小反芻獸疫診斷技術(shù)和疫苗研究進(jìn)展

索郎扎西

（西藏自治區(qū)獸醫(yī)生物藥品制藥廠，西藏拉薩 850003）

小反芻獸疫簡稱為PPR，該病具有接觸傳染性以及嚴(yán)重的烈性等特征，被FAO/OIE歸為A類烈性傳染病，我國則規(guī)定PPR為一類動物疫病。PPR的病原體為PPRV小反芻獸疫病毒，與RPV牛瘟病毒一樣均屬于副黏病毒科麻疹病毒屬[1]。曾經(jīng)PPRV被錯認(rèn)為是由于RPV變異所得來的病株，PPRV與RPV能產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)機(jī)制，因此PPR的預(yù)防常使用牛瘟疫苗。直到上世紀(jì)70年代后才被證明PPRV與RPV之間的區(qū)別和差異所在。

PPRV的主要感染對象為小反芻獸，山羊則是小反芻獸中最容易感染的群體，不同品種山羊感染的幾率、程度均不同。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)PPRV更傾向于感染歐洲品系的山羊，幼齡動物以及哺乳期的動物其易感程度更強[2]。同時發(fā)現(xiàn)豬牛兩種動物群體也可能會感染，但不會伴隨臨床癥狀。

此外，PPRV還能夠克服大型反芻動物，破壞其先天抵抗力對水牛、駱駝造成感染。當(dāng)動物感染PPRV之后，臨床典型特征表現(xiàn)為口舌潰瘍、高熱、支氣管肺炎、嚴(yán)重腹瀉、眼鼻分泌物增多、流淚，其感染程度嚴(yán)重時發(fā)病率及病死率為100%，且該病尚未研發(fā)出完全診治的治療方法，僅通過疫苗免疫以及早期診斷來控制病情的發(fā)生和發(fā)展[3]。

1942年在非洲的科特迪瓦發(fā)生了世界上第一例PPR病例。本病曾經(jīng)嚴(yán)重危害到中東、非洲等地區(qū)，直至2006年年初，巴基斯坦、尼迫爾、孟加拉國、印度等位于我國周邊的國家均爆發(fā)PPR疫情，在過后幾年疫情呈現(xiàn)增長的趨勢[4]。2007年7月我國在西藏地區(qū)發(fā)生了首例小反芻獸疫，經(jīng)過國家外來動物疫病診斷中心的診斷后確診為PPR疫病。

1 PPRV結(jié)構(gòu)概述

PPRV是一種屬于副黏病毒科麻疹的病毒。對麻疹病毒屬病毒基因的保守性問題研究發(fā)現(xiàn)，L和M是高度保守的基因，非編碼區(qū)為易變異區(qū)，如M和F基因之間富含GC區(qū)域。

PPRV粒子是一種呈圓形且在病毒包膜里為核衣殼狀態(tài)，組成成分為P磷蛋白、L大蛋白、N核衣殼蛋白。N蛋白是N基因編碼所編制，包含一個ORF開放閱讀框，氨基酸殘基能夠編譯出525個。N蛋白中含有細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原位點，是由九個氨基酸所組成的，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生受I型MHC分子，對CTL反應(yīng)造成限制[5]。P蛋白在RNA聚合酶復(fù)合物中，是一種輔助因子，在結(jié)合L蛋白后，能夠更好的折疊L蛋白。核衣殼蛋白和P蛋白結(jié)合后能夠保持P蛋白在細(xì)胞質(zhì)中維持可溶狀態(tài)，組織蛋白出現(xiàn)補非特異RNA結(jié)合或者不正常裝配的情況。P蛋白是一種最不保守的蛋白。病毒囊膜的內(nèi)層則由M蛋白形成。細(xì)胞在釋放成熟病毒粒子的過程當(dāng)中，M蛋白有著關(guān)鍵性的作用。M蛋白處于缺損狀態(tài)的時候，病毒無法穩(wěn)定持續(xù)發(fā)揮感染功能。F蛋白含有546個氨基酸，是一種融合蛋白，分子量為59KD，與病毒之間的關(guān)聯(lián)在于其參與了細(xì)胞融合和感染的開始以及介導(dǎo)的溶血過程。病毒的另一種纖突由H蛋白構(gòu)成，該蛋白的作用在于具備神經(jīng)氨酸酶活性以及血凝素，其變異性較高，并含有T細(xì)胞抗原決定簇[6]。

2 國內(nèi)研究發(fā)展現(xiàn)狀

目前對小反芻獸疫病的研究我國尚處于初始起步階段。隨著近年來禽流感、SARS等大規(guī)模國際性人畜傳染病的爆發(fā)，我國周邊地區(qū)PPR開始蔓延，這也引起了國內(nèi)的高度重視。中國檢疫檢驗科學(xué)研究院、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院、云南出入境檢驗檢疫局、中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心以及北京畜牧獸醫(yī)研究所等單位展開了關(guān)于疫病的相關(guān)研究，以檢驗檢疫技術(shù)為主要目的，建立了檢測小反芻獸以病毒核酸的方法，主要采用RT-PCR檢測法，研究重點同時 進(jìn)行克隆N、H基因和原核以及真核表達(dá)。在此之后又以核酸檢測技術(shù)為基礎(chǔ)，引入巢式PCR技術(shù)，從第一次PCR產(chǎn)物作為基礎(chǔ)開展二次PCR，提高反應(yīng)特異性[7]。

3 診斷技術(shù)

3.1 瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗

瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散的簡稱為AGID，該試驗廣泛應(yīng)用與臨床中，原因在于其具有諸多優(yōu)勢如便宜經(jīng)濟(jì)適用、方法簡單易于操作，不僅能夠在基層實驗室操作，其不受空間的限制在野外也可操作，反應(yīng)18～24 h之后便可取得結(jié)果。但對于臨床中較為常見的溫和型PPR，AGID試驗不具備對應(yīng)的敏感性來檢測分泌物中含量較低的抗原， 因此不適合用于處于PPR早期的診斷。

3.2 間接熒光抗體試驗

通過PPRV的單克隆抗體建立IFAT間接熒光抗體試驗，該試驗?zāi)軌蛴行z測出早期以及晚期病料中的PPRV。除此之外以重組的PPRVF蛋白作為抗原，對家兔進(jìn)行免疫，制備多克隆抗體為一抗能夠捕獲病料中的抗原，二抗則是從抗兔體內(nèi)的IGG提取，通過IFAT能將PPRV診斷出。

3.3 對流免疫電泳

通過CIEP和AGID對流免疫電泳的檢測方法聯(lián)合使用來檢測PPR病料，發(fā)現(xiàn)AGID的檢測陽性率僅為42.3%，而CIEP的檢測率高達(dá)80.6%，說明CIEP的敏感性更高。Osman等用CIEP及競爭ELISA（c-ELISA）兩種方法對520個血清樣本進(jìn)行同時檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CIEP的陽性率為59.15%，高于c-ELISA的50.67%陽性率。對比下來CIEP的敏感性又比c-ELISA高，但是CIEP試驗存在一個明顯的缺陷，無法區(qū)分RPV和PPRV感染。但由于CIEP所具備的敏感性較高，可以在無條件開展c-ELISA的實驗室或者地區(qū)作為篩選試驗，在臨床上用于檢測PPRV[8]。

3.4 中和試驗

VNT中和試驗是國際貿(mào)易所唯一指定診斷PPR的方法，該方法的優(yōu)勢在于具備較強的特異性和高靈敏性，但其缺點在于所需時間較長，通常要10～12 d才能出診斷結(jié)果，其次所要具備的試驗要求較高，無法適用于大規(guī)模樣品檢測。其轉(zhuǎn)管培養(yǎng)通常應(yīng)用于非洲綠猴的腎細(xì)胞或者原代羔羊腎細(xì)胞，與RPV做交叉中和試驗，能夠有效鑒別診斷出RPV。

3.5 病毒分離鑒定

培養(yǎng)分離PPRV時可選用兩種細(xì)胞，分別為原代羔羊腎細(xì)胞以及非洲綠猴腎細(xì)胞，病毒培養(yǎng)5～6 d后細(xì)胞形態(tài)會發(fā)生變化，逐漸變圓并收縮，最終形成合胞體。細(xì)胞核的形狀為圓形，排列如表盤狀。CPE出現(xiàn)時間較長，5～6 d后會開始盲傳繼代，此時需要借助電子顯微鏡或者VNT病毒中和試驗來進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。該方法的缺點在于對試驗要求較高，且需要投入大量的物力、人力，不適用于基層實驗室應(yīng)用開展檢測[9]。

3.6 核酸探針雜交試驗

目前可以通過建立核酸探針雜交檢測的方法來檢測PPRV各個基因。針對PPRVN蛋白基因所夠賤的CD-NA探針能夠有效對PPRV以及RPV區(qū)分鑒別，但其缺點在于放射性元素危害較大且32P半衰期較短，因此核酸探針雜交試驗的方法不具備廣泛應(yīng)用與臨床、實驗室的診斷方法。

3.7 ELISA

ELISA用于檢測血清的方法在臨床上已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，且發(fā)展十分成熟并具有多種試驗方法。

3.7.1 競爭ELISA

動物血清收到PPRV感染之后會產(chǎn)生H蛋白及PPRVN蛋白的抗體用以針對PPRV，c-ELISA由單克隆抗體作為基礎(chǔ)所建立研發(fā)的檢測方法。除此之外，大腸桿菌中可以提供RPV碳端可變區(qū)表達(dá)的條件，生成c-ELISA抗原，鑒別診斷RPV和PPRV的具體感染情況。c-ELISA是一種標(biāo)準(zhǔn)的OIE檢測方法，目前已經(jīng)研發(fā)出c-ELISA檢測試劑盒，血漿或血清均可通過c-ELISA檢測試劑盒來檢測完P(guān)PRVN蛋白抗體。這種方法的優(yōu)點在于耗時短，能夠大量化時間檢測，且敏感性和特異性的數(shù)據(jù)表現(xiàn)都十分優(yōu)秀，敏感性高達(dá)94.5%，特異性則高達(dá)99.4%。因此該方法得到臨床的廣泛應(yīng)用。

3.7.2 夾心ELISA

S-ELISA夾心ELISA方法是對臨床樣品通過多克隆抗體來捕獲PPRV抗原，用單克隆抗體來檢測從樣品中捕獲的抗原。根據(jù)相關(guān)試驗數(shù)據(jù)報道發(fā)現(xiàn)，S-ELISA的特異性和敏感性均低于C-ELISA，數(shù)據(jù)分別為92.8%和88.9%，但在2h內(nèi)即可獲得試驗結(jié)果，該方法尤其適合用于臨床的檢測，缺點在于無法鑒別RPV；S-ELISA具備操作簡單、檢測迅速的優(yōu)勢，可以替代VNT作為PPR疫苗質(zhì)量控制的方法。

3.7.3 間接ELISA

血清中存在多抗，為應(yīng)對這種情況建立了IELISA間接ELISA的方法，敏感性和特異性的表現(xiàn)都很優(yōu)秀，分別達(dá)到90.81%以及95.09%，zhang等克隆了在西藏爆發(fā)的疫情中感染動物的PPRVN蛋白基因，于大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，以此為基礎(chǔ)建立了iELISA方法，對697份血清進(jìn)行分析后得出特異性和敏感性的數(shù)據(jù)，分別為96.1%和96.7%。經(jīng)過對比分析后發(fā)現(xiàn)，PPRV的NP蛋白中位于452-472區(qū)域的多肽序列具備特異性，且免疫原性更強，產(chǎn)生的抗體能夠精準(zhǔn)特異識別PPRV，可用于鑒別診斷RPV和PPRV。該方法具備高敏感性和特異性能夠有效替代國外昂貴的試劑盒，將其應(yīng)用于實驗室中診斷PPR。

3.8 PCR-ELISA

PCRELISA檢測方法是由Saravana等基于PPRVN基因建立了。對336 bp產(chǎn)物通過RT-PCR擴(kuò)增地高辛進(jìn)行標(biāo)記，然后使用ELISA進(jìn)行檢測，該方法相較于傳統(tǒng)的RT-PCR檢測法靈敏度高出10000倍，在檢測臨床樣本的過程中發(fā)現(xiàn)，該方法的敏感度遠(yuǎn)高于S-ELISA。對于處于早期感染以及感染后期PPRV，使用PCR-ELISA更加適合，同時還具備鑒別診斷RPV和PPRV的功能。

3.9 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

針對 N、 M基因的一步法Balamurugan 等建立了RT-PCR多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法。該方法能夠鑒別診斷RPV。Georg等基于PPRV N、H、M 蛋白基因建立了多重RT-PCR方法，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)敏感性中最高的便是M基因的PCR，N、H、F的敏感性則逐次降低，均可鑒別診斷RPV和PPRV。一步法實時定量RT-PCR法是一種基于PPRV N蛋白基因所研發(fā)的方法，能夠檢測血液樣本，相較于RT-PCR而言，其具有更高的敏感性并能夠減少PCR所帶來的污染。PCR具有檢測耗時短、靈敏性高、特異性強且具備高通量等優(yōu)勢，值得應(yīng)用于診斷PPRV。

4 疫苗研究進(jìn)展

4.1 PPR弱毒疫苗

上世紀(jì)八十年代末首次研究出針對PPRV毒株致弱的方法，從非洲綠猴腎細(xì)胞中所獲取的，該株疫苗屬Ⅰ群，因為具有較強的交叉保護(hù)作用，且不存在毒副作用而廣泛應(yīng)用與預(yù)防PPR中。該疫苗可進(jìn)行干燥冷凍處理，經(jīng)過處理后的疫苗獲得高熱穩(wěn)定性，因此能夠在基層運輸匯總廣泛應(yīng)用。在機(jī)體獲得面以后能夠維持12個月的保護(hù)性抗體，母源抗體較高在4～5月齡實現(xiàn)首次免疫；該疫苗的缺點在于無法區(qū)分疫苗毒和野毒。除此之外，在經(jīng)過細(xì)胞致弱后，PPRV毒株采用C-ELISA方法能夠檢測出體內(nèi)較高的水平抗體，且能夠維持一年之久。

4.2 RPV弱毒疫苗

RPV弱毒疫苗曾用于山羊和綿羊的免疫，不但能夠預(yù)防PPR且能夠控制RP，具有較好的免疫保護(hù)效果，云隱在于RPV和PPRV之間具有較高抗原相關(guān)性。該疫苗的缺點在于不利于用于認(rèn)證RP的無疫。Walsh等在牛瘟弱毒RBOK疫苗株中插入GFP綠色熒光蛋白基因，構(gòu)建成經(jīng)過充足的病毒RPV-SIGGFP。接種后，不會受到PPRV和RPV的感染，并且產(chǎn)生的抗體能夠區(qū)別疫苗免疫動物和自然感染動物。

4.3 重組亞單位疫苗

無需使用佐劑，用重組桿狀病毒表達(dá)的HN蛋白即可產(chǎn)生RPV和PPRV的抗體。綿羊口服后產(chǎn)生中和抗體。相較于PPR弱毒疫苗而言具有更穩(wěn)定的耐熱性能，且時效長，因此可用于PPR防控。

4.4 嵌合體疫苗

嵌合體疫苗是通過代替PPRV中的蛋白基因所形成的。在用該疫苗免疫山羊后并未出現(xiàn)不良反應(yīng)，且體內(nèi)產(chǎn)生水平較高的中和抗體，能夠有效抵抗PPRV強毒。

4.5 山羊痘活載體疫苗

用于小反芻獸疫以及羊痘預(yù)防的疫苗均使用的弱毒疫苗，存在一定的隱患如散毒性。重組羊痘病毒面以后則功效得以極大的提升，不但能夠預(yù)防感染CPV還能抵抗感染PPR。研究發(fā)現(xiàn)重組后的rCPVPPRVF能夠產(chǎn)生更強的免疫能力，首次注射后便可取得80%的抗體產(chǎn)生有效率，6個月后仍能從體內(nèi)檢測到中和抗體，其作用時間長可以作為發(fā)展小反芻獸疫苗的趨向。

4.6 RNA干涉技術(shù)

利用桿狀病毒載體和重組腺病毒來表達(dá)小干擾RNA，可治療RPV感染和PPRV感染。重組病毒可以對病毒的復(fù)制進(jìn)行有效抑制。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在對抗麻疹病毒感染的治療中SiRNA分子有著巨大的潛在價值。

5 小結(jié)

PCR和c-ELISA檢測技術(shù)均具備特異性強、檢測快速、通量性高、靈敏性高的有點，因此可用作為檢測OIE的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，基因工程疫苗則能夠有效發(fā)揮控制小反芻獸疫的作用。