羅非魚無乳鏈球菌SIP-pET32a基因工程菌高密度發(fā)酵工藝及SIP蛋白提取方法研究

文/吳斌

本文在構(gòu)建羅非魚無乳鏈球菌病亞單位疫苗基因工程菌的基礎(chǔ)上，針對中試生產(chǎn)環(huán)節(jié)，進一步開展基因工程菌高密度發(fā)酵及目標蛋白提取條件的研究，從發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選、誘導劑的使用劑量、誘導時間，以及目標蛋白提取與純化等方面優(yōu)化工藝條件，以實現(xiàn)基因工程菌高密度培養(yǎng)和獲得較高目標產(chǎn)物濃度的目的，進一步節(jié)約疫苗生產(chǎn)成本并提高產(chǎn)出效率，解決規(guī)?；a(chǎn)決定性環(huán)節(jié)的問題，為基因工程疫苗走向產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

無乳鏈球菌是革蘭氏陽性菌，可感染包括羅非魚在內(nèi)的多種淡水養(yǎng)殖魚類。2009年至今，我國羅非魚養(yǎng)殖業(yè)受到無乳鏈球菌病影響嚴重。無乳鏈球菌具有多種血清型，多發(fā)于春、夏和秋季，流行高峰為5月～9月，幼魚和成魚均可發(fā)病，傳染性強，發(fā)病率達20%～30%，病魚死亡率高達25%～80%。目前羅非魚無乳鏈球菌病尚無有效控制手段，研發(fā)無乳鏈球菌病基因工程亞單位疫苗成為防控該病重要的研究方向。

SIP蛋白是一種B族鏈球菌的表面免疫性蛋白，是無乳鏈球菌疫苗抗原的重要候選蛋白。通過構(gòu)建原核表達體系，可獲得具有免疫原性和保護特性的重組蛋白SIP。

本文針對已研發(fā)的羅非魚無乳鏈球菌SIP微膠囊口服疫苗，在所構(gòu)建的羅非魚無乳鏈球菌疫苗SIP工程菌SIPpET32a基礎(chǔ)上，對重組基因工程菌高密度發(fā)酵、SIP蛋白表達和分離純化的條件進行優(yōu)化，以完善重組大腸桿菌高密度發(fā)酵和目標蛋白有效提取的工藝技術(shù)，為經(jīng)濟、高效生產(chǎn)SIP重組蛋白建立基礎(chǔ)，并對促進羅非魚無乳鏈球菌基因工程SIP微膠囊口服疫苗的產(chǎn)業(yè)化起到積極推動作用。

一、材料與方法

（一）材料

1.供試菌株及來源

羅非魚無乳鏈球菌SIP原核表達工程菌SIP-pET32a為含SIP蛋白基因的大腸桿菌工程菌E.coliBL21（DE3），具有氨芐青霉素抗性，由福建省淡水水產(chǎn)研究所水產(chǎn)動物病害防治研究室構(gòu)建并保存。

2.主要培養(yǎng)基

發(fā)酵試驗用LB、Th、TB、YE、308培養(yǎng)基，成分見表1。

表1 不同培養(yǎng)基每升的成分組成

10L發(fā)酵罐培養(yǎng)均為308培養(yǎng)基按比例配制，微量元素見表2。

表2 微量元素母液組成

發(fā)酵罐補料培養(yǎng)基：300g/L酵母粉、600g/L葡萄糖、24g/L MgSO4·7H2O。其中葡萄糖和MgSO4·7H2O需要單獨滅菌115℃，20min，pH7.2。

3.SDS-PAGE電泳儲液

電泳儲液按照蛋白質(zhì)技術(shù)手冊配制。

（二）方法

1.種子菌體的活化

將在15%甘油保存的SIP基因工程菌SIP-pET32a菌種，涂布于LB瓊脂平板獲得單菌落。挑取單菌落接種于含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃、120r/min搖床培養(yǎng)。

2.SIP基因工程菌SIP-pET32a發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

以1%的接種量分別接種在LB、Th、TB、YE、308培養(yǎng)基中，30℃搖瓶培養(yǎng)，每2h取樣，測定菌株生長曲線。菌體生長一定時間后，用IPTG誘導蛋白表達，SDS-PAGE分析蛋白表達情況，測算出SIP蛋白表達量占工程菌菌體總蛋白的百分比。

3.不同誘導劑量和誘導時間對工程菌表達SIP蛋白的影響

使用本試驗優(yōu)化的培養(yǎng)基，30℃搖瓶培養(yǎng)，根據(jù)SIP基因工程菌SIPpET32a菌株生長曲線，于菌體對數(shù)生長中期，加入終濃度為0.5mmol/L和1.0mmol/L的IPTG誘導劑誘導蛋白表達，分別于誘導表達4h、5h和6h時取樣，SDS-PAGE分析蛋白表達情況，測算出SIP蛋白表達量占工程菌菌體總蛋白的百分比。

4.SDS-PAGE分析

發(fā)酵結(jié)束后，4℃，5000r/min離心收集菌體。在PBS緩沖液中超聲破碎菌體，破碎液與上樣緩沖液混合后進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍R-250染色后脫色，掃描蛋白電泳膠后，用Quantity One軟件進行灰度分析，根據(jù)灰度測算出SIP蛋白表達量占工程菌菌體總蛋白的百分比。

5.高密度發(fā)酵

高密度發(fā)酵采用10L發(fā)酵罐，發(fā)酵初始培養(yǎng)基體積6L，設(shè)置培養(yǎng)基pH7.0，使用25%氨水自動調(diào)節(jié)。通過轉(zhuǎn)速關(guān)聯(lián)控制溶氧在20%以上。當葡萄糖消耗完溶氧迅速上升時，指數(shù)流加補料。根據(jù)下列公式計算補料體積，設(shè)定不同的比生長速率（μset）為0.05h-1、0.08h-1和0.10h-1，采用每1h改變補料體積的階梯式補料方式。

其中，F(xiàn)為流加率（L/h），X（t0）和V（t0）為補料開始前細胞濃度（細胞干重g/L）和發(fā)酵液體積（L），SF為補料培養(yǎng)基葡萄糖的濃度（g/L），m為保持系數(shù)（g·g/h）-0.025，YX/S為產(chǎn)出系數(shù)（g/g），即每克葡萄糖產(chǎn)生多少克細胞干重，通過以下公式計算。

其中，ODb為補料開始前發(fā)酵液的OD600值，OD0為發(fā)酵開始時的OD600值，0.54為1OD600相當于1L發(fā)酵液中含有的細胞干重為0.54g，Vm為發(fā)酵合成培養(yǎng)基的初始體積（L），Vi為發(fā)酵種子液的體積，Vs為取樣體積（L），S為合成培養(yǎng)基中含有的葡萄糖的總量（g）。當OD600達到60.0左右時，加入IPTG，終濃度為1mmol/L，誘導SIP蛋白的表達，補料體積根據(jù)計算F的公式進行計算，μset分別為0.05、0.08和0.10，每1h改變一次補料流加率F，誘導5h。

6.細胞破碎滲透休克方法提取SIP蛋白

在4℃，6000r/min條件下離心收集菌體，棄上清，將100mL菌體懸浮于適量冷滲透休克1#溶液中（20mmol/L Tris，pH8.0，5mmol/L EDTA，蔗糖），其中1#溶液中蔗糖濃度分別設(shè)置5%、10%、20%；溶解至菌體密度OD600約為2.0，冰水浴，10min。離心，棄去上清，菌體懸浮于等量的冷滲透休克2#溶液中（20mmol/L Tris，pH8.0，5mmol/L EDTA），冰水浴，10min。4℃，10000r/min離心15min，取上清，-20℃凍存待測。

7.滲透休克法提取SIP蛋白條件的優(yōu)化

滲透休克法中，影響SIP蛋白釋放效果比較大的三個因素為：細胞濃度、處理時間和EDTA濃度。選擇影響SIP蛋白提取效果各因素中有意義的水平進行正交實驗，以基因工程菌100mL發(fā)酵液為處理對象，確定最佳提取條件。正交實驗的因素水平見表3。

表3 因素水平表

8.SIP蛋白提取放大試驗

優(yōu)化確定滲透休克提取SIP蛋白的最佳條件后，對提取規(guī)模進行放大，從每次處理基因工程菌發(fā)酵液100mL提升到10L。分析SIP蛋白提取效果。

9.蛋白質(zhì)濃度測定

總蛋白含量測定：Bradford法。

二、結(jié)果與分析

（一）工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.SIP基因工程菌SIP-pET32a發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

選取5種可用于基因工程菌SIP-pET32a發(fā)酵使用的培養(yǎng)基，針對本研究構(gòu)建菌株進行搖瓶培養(yǎng)，繪制生長曲線。從圖1可以看出，LB作為基因工程最常使用的培養(yǎng)基但并非本工程菌最適宜生長的培養(yǎng)基。TB培養(yǎng)基以高濃度的酵母粉和蛋白胨作為主要成分，并以磷酸鹽作為緩沖體系，有利于本菌株的生長，到24h后菌體量仍在增長。Th培養(yǎng)基中胰蛋白胨和酵母粉的含量是TB的十分之一，不利于菌的后期增殖。YE培養(yǎng)基以酵母粉為氮源，以甘油為碳源，與TB培養(yǎng)基相比，缺少磷酸鹽，培養(yǎng)菌的后期生長速率明顯減緩。308培養(yǎng)基是以普通的葡萄糖作為碳源，培養(yǎng)菌株生長快速進入對數(shù)生長期，12h后就進入穩(wěn)定期，說明以葡萄糖作為碳源，以酵母粉為氮源很適合本工程菌的生長。從SIP蛋白表達量的結(jié)果可見，在培養(yǎng)10h時誘導4h，單位細胞SIP蛋白表達量無顯著性差異（見圖2）。雖然TB培養(yǎng)基也適合本菌株的生長，但其培養(yǎng)基組分用量大、價格高，單位成本遠遠高于308培養(yǎng)基，因此后續(xù)研究和生產(chǎn)以308培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

圖1 工程菌在不同培養(yǎng)基中的生長情況

圖2 不同培養(yǎng)基中SIP蛋白的表達量

2.不同誘導時間和誘導劑量對工程菌表達SIP蛋白的影響

誘導時間和誘導劑添加量是工程菌發(fā)酵過程中重要的控制參數(shù)。308培養(yǎng)基培養(yǎng)SIP基因工程菌SIP-pET32a 5h，分別加入0.5mmol/L和1.0mmol/L誘導劑，表4顯示，加入2種濃度誘導劑后5h，目標蛋白表達量均達到最高，時間延長單位細胞蛋白表達不再增加。從IPTG的添加量可以看出，1.0mmol/L的IPTG更有利于SIP蛋白的誘導表達。

表4 不同誘導時間對SIP蛋白表達的影響

（二）10L發(fā)酵罐工程菌高密度發(fā)酵策略的優(yōu)化

從圖3的發(fā)酵曲線顯示，當設(shè)定細胞比生長速率為0.05h-1時，補料后細胞生長較緩慢，生長周期長，OD600達到60的時間比μ值設(shè)定為0.08h-1時推遲了3h，說明補料的速度可以加大，當μset設(shè)定到0.10h-1時，補料速度過快，發(fā)酵過程中，氧氣供應(yīng)遇到困難，反而出現(xiàn)細胞生長沒有0.08h-1時快的現(xiàn)象。從實驗結(jié)果可以確定，當μset為0.08h-1時，能快速得到高密度工程菌細胞，18h結(jié)束發(fā)酵時，細胞量達到干重36.4g/L。從圖4可以看出在高密度條件下，SIP蛋白仍能得到高效表達，SIP蛋白表達量占可溶性蛋白的20.6%。

圖3 工程菌指數(shù)補料高密度發(fā)酵曲線

圖4 補料發(fā)酵中比生長速率設(shè)定值對SIP蛋白表達的影響

（三）SIP蛋白的提取與純化

1.細胞破碎滲透休克法對SIP蛋白釋放的影響

基因工程菌表達蛋白的分離純化一直是困擾產(chǎn)品應(yīng)用的重要瓶頸，有效地破碎細胞釋放融合蛋白是其中的第一步。通過滲透休克的方法處理工程菌細胞，結(jié)果如圖5所示，較低滲透壓下，SIP蛋白釋放量很少，當蔗糖濃度達到20%，大部分SIP蛋白得到有效釋放，并且SIP蛋白占可溶性蛋白的70%以上。該方法可應(yīng)用于基因工程菌的SIP蛋白分離、提取與純化。

圖5 滲透休克對細胞釋放SIP蛋白的影響

2.滲透休克法提取SIP蛋白條件的優(yōu)化

細胞濃度、處理時間和EDTA濃度對SIP蛋白釋放的影響比較大，正交實驗結(jié)果見表5。在各個因素分析中，相對于總蛋白濃度，處理時間和細胞濃度的R最大，對總蛋白提取的影響也相對較大，各因素對總蛋白提取影響的次序為：處理時間>細胞濃度＞EDTA濃度。最佳提取工藝條件為A3B2C3，即細胞濃度OD600=20，EDTA濃度為10mM，處理1h。相對SIP蛋白比例，影響最大的是EDTA濃度，各因素影響SIP蛋白比例的次序為：EDTA濃度>細胞濃度>處理時間。最佳提取工藝條件為：細胞濃度OD600=10，EDTA濃度為20mM，處理0.5h。

表5 正交實驗結(jié)果

3.SIP蛋白提取放大試驗

確定應(yīng)用優(yōu)化條件后的滲透休克法提取SIP蛋白，每次處理基因工程菌發(fā)酵液10L。4個批次均有效獲得SIP蛋白，SIP蛋白占總蛋白的比例大于78.2%（見表6）。

表6 SIP蛋白提取試驗

三、討論

（一）發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇

基因工程菌是基因工程生產(chǎn)抗體、疫苗等高價值產(chǎn)品的重要基礎(chǔ)。工程菌對外源基因的表達會受到各種因素的影響，這些因素主要有：培養(yǎng)基的組成、誘導劑的種類、誘導的時機、誘導的時間、誘導的濃度、誘導的溫度和溶氧情況等。本研究結(jié)果表明，以葡萄糖為碳源的308培養(yǎng)基最有利于菌株的生長和SIP蛋白的表達。其中很重要的一個因素是在培養(yǎng)基中加入了幾類微量元素和無機鹽。這些微量元素和無機鹽除了為大腸桿菌SIPpET32a的生長提供足夠的營養(yǎng)，還能穩(wěn)定菌體的生長環(huán)境，如加入磷酸鹽中的磷酸根可以保持菌體生長過程中pH的穩(wěn)定，鉀離子可以維持細胞滲透壓的平衡。

（二）基因工程菌高密度發(fā)酵條件優(yōu)化

為了得到大量的SIP蛋白，需要對發(fā)酵的規(guī)模進行放大，并且實現(xiàn)工程菌高密度發(fā)酵。在實踐中，通常要先在小型發(fā)酵罐中摸索高密度發(fā)酵的條件。本研究采用10L發(fā)酵罐對高密度發(fā)酵的策略進行優(yōu)化，根據(jù)工程菌生長和底物消耗的特性，采取了指數(shù)補料策略，成功實現(xiàn)了在小型發(fā)酵罐中較短時間內(nèi)使細胞量達到高密度的結(jié)果，并且不影響SIP蛋白的表達量。

經(jīng)過培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，本研究對象工程菌SIP-pET32a在含葡萄糖的308培養(yǎng)基中，30℃發(fā)酵，在對數(shù)生長中期用1.0mmol/L IPTG誘導5h，最有利于SIP蛋白的表達。在10L發(fā)酵罐中采用指數(shù)補料發(fā)酵，當μset為0.08h-1時，發(fā)酵18h后菌體干重和SIP蛋白表達量分別達到36.4g/L和20.6%，實現(xiàn)了工程菌高密度發(fā)酵和蛋白質(zhì)的有效表達，為SIP蛋白的規(guī)?；瘧?yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

（三）基因工程重組蛋白SIP的提取與純化

重組蛋白的提取與純化是工程菌生產(chǎn)中重要的一環(huán)。本研究中基因工程菌SIP-pET32a產(chǎn)生的SIP蛋白主要在周質(zhì)空間，采用滲透休克法不僅簡便易行，還有可能對目標蛋白進行選擇性釋放。因此對滲透休克法釋放SIP蛋白的條件進行了優(yōu)化，在細胞濃度OD600=10、EDTA濃度為20mM、處理0.5h時可得到較佳的效果。放大到10L的規(guī)模提取SIP蛋白，發(fā)現(xiàn)在高滲溶液處理后轉(zhuǎn)移到低滲溶液時，細胞容易聚集成團，影響蛋白的釋放。通過改變轉(zhuǎn)移方法，邊勻漿攪拌邊轉(zhuǎn)移，增加稀釋液體積，分批次轉(zhuǎn)移，再通過分子量10kDa的超濾膜進行蛋白質(zhì)濃縮，可更好地獲得SIP蛋白。4個批次試驗結(jié)果均能有效獲得SIP蛋白，SIP蛋白占總蛋白的比例大于78.2%。用滲透休克法提取SIP蛋白快速、簡便、有效。