• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    重組膠原蛋白在表皮修復(fù)中的作用機(jī)理研究?

    2022-12-12 10:37:20趙健烽馮麗萍黃建民馬德蓉
    生物學(xué)通報(bào) 2022年2期
    關(guān)鍵詞:市售膠原蛋白染色

    李 濱 趙健烽 馮麗萍 黃建民 馬德蓉

    (1江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)工程學(xué)院 江蘇連云港 222000 2江蘇江山聚源生物技術(shù)有限公司 江蘇泰州 214500)

    膠原蛋白是利用酸、酶等提取介質(zhì)從動(dòng)物組織中提取的大分子蛋白質(zhì),因其具有無(wú)毒、易降解、易吸收、低抗原性等特性,深受生物醫(yī)學(xué)及日用化學(xué)領(lǐng)域青睞,被廣泛用作手術(shù)縫合線、止血海綿、人工皮膚、人工血管、人角膜、藥物載體等[1]。但動(dòng)物來(lái)源的大分子膠原蛋白仍存在一些問(wèn)題[2]:1)存在潛在的傳染病危險(xiǎn),包括動(dòng)物源及人源性傳染?。ɡ?,艾滋病等);2)存在引起機(jī)體排斥反應(yīng)炎癥的風(fēng)險(xiǎn);3)排斥反應(yīng)導(dǎo)致的高吸收率使治療頻次增加,成本增加。此外,動(dòng)物源膠原蛋白的提取過(guò)程還存在高成本、重污染、獲取率低等缺陷,因此,利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組膠原蛋白(recombinant human collagen,RHC)受到廣泛關(guān)注[3]。

    重組膠原蛋白的生產(chǎn)工藝為:將來(lái)自人體膠原蛋白的mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,隨后進(jìn)行酶切,再通過(guò)特定序列的整理縫合、與特定表達(dá)載體連接,轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Escherichia coli)或畢赤酵母(Pichia pastoris)中[1-2],獲得相對(duì)較高的表達(dá)量;通過(guò)發(fā)酵、分離、純化手段生產(chǎn)生物重組膠原蛋白[3-8]。因其具有良好的生物學(xué)相容性、細(xì)胞黏附性、促進(jìn)新細(xì)胞形成和止血功能[3],對(duì)重組膠原蛋白在創(chuàng)傷修護(hù)類(lèi)化妝品中的作用機(jī)理研究,有助于將此類(lèi)蛋白質(zhì)推廣至日用化妝品領(lǐng)域乃至生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

    實(shí)驗(yàn)試劑:血清培養(yǎng)基、無(wú)血清培養(yǎng)基、磷酸氫二鈉(分析純)、磷酸二氫鉀(分析純)、氯化鈉(分析純)、氯化鉀(分析純)、EDTA(≥99.5%)、DMSO(≥99.9%)、Weigert鐵蘇木素染色液、天狼星紅染色液、MTT試劑盒(碧云天生物)、細(xì)胞黏附檢測(cè)試劑盒(上??道噬铮⒊衫w維細(xì)胞(原代培養(yǎng))、表皮細(xì)胞(原代培養(yǎng))、重組膠原蛋白、市售膠原蛋白樣品1(簡(jiǎn)稱“市售1”)、市售膠原蛋白樣品2(簡(jiǎn)稱“市售2”)、動(dòng)物膠原蛋白、RGD肽(Arg-Gly-Asp多肽,一種已被報(bào)道的細(xì)胞粘附序列,可明顯增加細(xì)胞黏附性)。

    儀器:96孔板(Nunc-96,賽默飛世爾,中國(guó))、Franz擴(kuò)散池(Permergear,世聯(lián)博研,美國(guó))、酶標(biāo)儀(MR-96A,貝登醫(yī)療,南京)、低速冷凍離心機(jī)(RC3B PLUS,SORVALL,美國(guó))、光學(xué)顯微鏡(DM3000 LED,徠卡,德國(guó))、石蠟包埋機(jī)(EG1150H,徠卡,德國(guó))、切片機(jī)(KD-3368AM,世紀(jì)科信,北京)、移液器(F1 Clip Tip,賽默飛世爾,中國(guó))。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 促細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn) 將活性好的細(xì)胞制作成單細(xì)胞懸浮液并統(tǒng)計(jì)數(shù)量,使細(xì)胞密度為104個(gè)/mL,接種于96孔板,每孔中加入細(xì)胞懸浮液200 μL,生長(zhǎng)至細(xì)胞貼壁后,加入不同濃度的待測(cè)樣品(0.0001%、0.0005%、0.0025%、0.0125%、0.0625%、0.3125%,注:如果有效,可繼續(xù)下調(diào)濃度),每個(gè)樣品設(shè)置5個(gè)重復(fù),置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h(每72 h更換一次含膠原蛋白樣品的培養(yǎng)液)。

    至每個(gè)時(shí)間點(diǎn),向?qū)?yīng)的孔中加入20 μL MTT溶液(用pH=7.4的PBS配制),再培養(yǎng)4 h,停止。

    快速翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)板,棄去上清液,每孔添加150 μL DMSO,振蕩10 min溶解MTT結(jié)晶。

    用酶聯(lián)檢測(cè)儀檢測(cè)各孔在490 nm處的吸光值(OD490值),同時(shí)設(shè)置無(wú)細(xì)胞孔作為對(duì)照組進(jìn)行調(diào)零,取6孔平均值。

    以培養(yǎng)時(shí)間與吸光值為坐標(biāo)軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

    1.2.2 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

    1)細(xì)胞鋪板:以記號(hào)筆均勻地分割6孔板,中間間隔0.5~1 cm,每個(gè)孔至少橫穿3條線。每孔中大約加入5×105個(gè)/mL細(xì)胞,過(guò)夜后可將孔鋪滿。

    2)劃痕實(shí)驗(yàn):第2天使用移液器吸頭垂直于橫線進(jìn)行劃痕,用PBS清洗細(xì)胞3次,洗脫被劃下的細(xì)胞,加入至含有RHC的無(wú)血清培養(yǎng)基中,作為對(duì)照組;加入至含有實(shí)驗(yàn)樣品(市售1和市售2)的培養(yǎng)基中,作為實(shí)驗(yàn)組,最終濃度為0.05%。在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),取樣時(shí)間分別為0 h、6 h、24 h。

    3)數(shù)據(jù)處理:計(jì)算不同時(shí)間段之間細(xì)胞整體遷移的距離,得出平均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差,建立直角坐標(biāo)系,以時(shí)間為橫軸,遷移距離為縱軸作圖,計(jì)算公式如下:

    式中:Si表示每個(gè)時(shí)間長(zhǎng)度細(xì)胞整體遷移的距離;S0表示0時(shí)距離長(zhǎng)度;St表示每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的距離長(zhǎng)度。

    1.2.3 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

    1)包被:將100 μL包被液加入96孔板,2~8℃條件下過(guò)夜。移除包被液,用洗滌液洗滌2~3次。

    2)細(xì)胞接種:胰酶消化處理的待測(cè)細(xì)胞,經(jīng)PBS洗滌后,用相應(yīng)培養(yǎng)基重懸制成細(xì)胞懸液,按5×104個(gè)/mL細(xì)胞,接種于96孔板;同時(shí)加入含膠原蛋白樣品,RHC終濃度為0.05%和0.01%,設(shè)置5個(gè)重復(fù)。設(shè)立對(duì)照組,即未加樣品的細(xì)胞懸液組;設(shè)置含有RGD肽的陽(yáng)性對(duì)照組。放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h。取出培養(yǎng)板,棄培養(yǎng)基,洗滌2~3次,每孔加入100 μL新鮮培養(yǎng)基。

    3)黏附率檢測(cè):96孔板每孔加入10 μL細(xì)胞染色液B,在37℃孵育2 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm各孔的吸光值(OD450值)。各重復(fù)孔的OD450值取平均數(shù),計(jì)算細(xì)胞黏附率的公式如下:

    1.2.4 透皮性實(shí)驗(yàn)

    1)制樣:取制備好的離體豬皮,用擴(kuò)散池進(jìn)行透皮實(shí)驗(yàn)。供給液分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。

    2)組織切片:用4%多聚甲醛固定上述豬皮24 h,用自來(lái)水高流速?zèng)_洗12 h,后依次浸泡在75%、85%、95%Ⅰ、95%Ⅱ的乙醇中各1 h,進(jìn)行脫水處理。然后浸泡于1∶1的無(wú)水乙醇及二甲苯混合液中30 min,二甲苯Ⅰ中15 min,二甲苯Ⅱ中15 min,進(jìn)行透明化處理。再進(jìn)行浸蠟處理,分別浸泡于石蠟Ⅰ中1 h,石蠟Ⅱ中過(guò)夜,石蠟Ⅲ中1 h。用石蠟包埋機(jī)進(jìn)行包埋,修蠟后,在-20℃的冰箱中過(guò)夜保存。最后,用切片機(jī)將切片橫向及縱向切成5 mm切片,40℃展片,62℃烤片。

    3)天狼星紅染色:

    ①染色前先脫蠟:水,二甲苯Ⅰ中10 min,二甲苯Ⅱ中10 min,無(wú)水乙醇Ⅰ中2 min,無(wú)水乙醇Ⅱ中2 min,95%乙醇2 min,85%乙醇2 min,75%乙醇2 min,流水沖洗。

    ②染色時(shí)用weigert鐵蘇木素染色液將組織切片染色10~20 min,自來(lái)水沖洗5~10 min,用蒸餾水清洗1次。隨后使用天狼星紅染液染色1 h,流水沖洗后,去除染液。

    ③染色后脫水,浸泡于95%Ⅰ、95%Ⅱ的乙醇中各5 min,無(wú)水乙醇Ⅰ中5 min,無(wú)水乙醇Ⅱ中5 min,二甲苯Ⅰ中5 min,二甲苯Ⅱ中5 min透明。

    ④將中性樹(shù)膠滴于載玻片組織上,用蓋玻片覆蓋,覆蓋時(shí)應(yīng)先接觸一邊,后逐漸覆蓋,可有效避免產(chǎn)生氣泡。

    4)顯微鏡觀察拍照:在普通光學(xué)顯微鏡下,觀察分析實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在顯微鏡下的組織切片,并拍照。紅色為膠原纖維,藍(lán)色為細(xì)胞核,黃色為肌纖維。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

    2.1.1 RHC促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的起效量實(shí)驗(yàn) 對(duì)比各組細(xì)胞生長(zhǎng),分析RHC促進(jìn)成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)的最低起效量濃度。圖1結(jié)果顯示,成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的生長(zhǎng)趨勢(shì)相似。與對(duì)照組相比,當(dāng)RHC濃度≥0.0025%時(shí),實(shí)驗(yàn)組均可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng);而當(dāng)RHC濃度<0.0025%時(shí),其生長(zhǎng)情況與對(duì)照組大致相同。這證明RHC促進(jìn)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞)生長(zhǎng)的起效量為0.0025%。

    2.1.2 RHC與市售普通膠原蛋白1、2對(duì)比實(shí)驗(yàn)本文選用RHC濃度為0.01%,該濃度可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng),采用實(shí)驗(yàn)方法1.1.2得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示,RHC組的細(xì)胞生長(zhǎng)速率明顯快于市售普通膠原蛋白1、2組,表明RHC促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的性能優(yōu)于市售普通膠原蛋白1、2。

    2.1.3 表皮細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)學(xué)變化 如圖3所示,在倒置顯微鏡下,接種1 d,各組表皮細(xì)胞呈球形,大小均勻,邊界清晰;在接種2~4 d內(nèi),細(xì)胞逐漸貼壁生長(zhǎng),形狀呈眼球形,可觀察到細(xì)胞核,細(xì)胞數(shù)量快速增長(zhǎng)并連接成片狀,各組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異;與空白對(duì)照組比,其他各組細(xì)胞增長(zhǎng)量明顯,其中RHC組表皮細(xì)胞密度最大,分布均勻。

    2.2 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞整體遷移距離,分析RHC及其他樣品促進(jìn)細(xì)胞遷移的能力。

    本實(shí)驗(yàn)主要為劃痕實(shí)驗(yàn),通過(guò)顯微鏡觀察不同時(shí)間內(nèi)“傷口”的愈合程度,即細(xì)胞的遷移(圖4)。圖5統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,RHC組在6 h的細(xì)胞遷移距離大于其他組在24 h的遷移距離,而24 h后,RHC組的細(xì)胞遷移距離遠(yuǎn)高于其他對(duì)照組,證明RHC促進(jìn)細(xì)胞遷移能力優(yōu)于市售普通膠原蛋白。

    此外,本研究還采用以人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞為代表的單層體外實(shí)驗(yàn)?zāi)P停▽?shí)驗(yàn)方法中未體現(xiàn)這部分),測(cè)定了2種化妝品原料(海洋膠原蛋白)體外促進(jìn)創(chuàng)面愈合的能力。在體外系統(tǒng)中,通過(guò)產(chǎn)品促進(jìn)損傷組織愈合的能力評(píng)價(jià)修復(fù)效果。

    以0.1%濃度為例,在相同時(shí)間內(nèi),RHC的細(xì)胞修復(fù)能力比海洋膠原蛋白更加突出。圖6數(shù)據(jù)顯示,經(jīng)過(guò)t檢驗(yàn),2 h后RHC組細(xì)胞遷移變化率呈顯著性差異,且24 h后RHC的細(xì)胞修復(fù)比海洋膠原蛋白高21.1%。因此,RHC在細(xì)胞修復(fù)方面的效果比海洋膠原蛋白更加顯著,且起效速度更快,2 h內(nèi)即有顯著效果。

    2.3 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) 根據(jù)各組的黏附率,分析并比較RHC與市售普通膠原蛋白1、2及RGD肽的細(xì)胞黏附能力。

    如表1所示,RHC的促細(xì)胞黏附性能明顯優(yōu)于市售普通膠原蛋白,且RHC促細(xì)胞黏附性能與濃度相關(guān),RHC濃度越大,細(xì)胞黏附增強(qiáng),這一性質(zhì)對(duì)不同種類(lèi)的細(xì)胞無(wú)較大差異。當(dāng)RHC濃度達(dá)到0.05%時(shí),細(xì)胞黏附率已高達(dá)45%,根據(jù)已報(bào)導(dǎo)文獻(xiàn)[9]:細(xì)胞黏附率大于40%說(shuō)明材料已具有優(yōu)良的細(xì)胞黏附性能。

    表1 不同濃度RHC的細(xì)胞黏附情況匯總(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

    2.4 透皮性實(shí)驗(yàn)

    2.4.1 皮膚中RHC的吸收利用情況 通過(guò)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的染色,比較2組內(nèi)表皮RHC含量。由內(nèi)表皮RHC含量差異,得出皮膚中RHC的吸收利用量。

    在顯微鏡下觀察對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的切片并拍照(圖7),可發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中紅色所占面積更大,表明涂抹過(guò)RHC溶液的豬皮中膠原蛋白含量更多,即豬皮吸收了一定的RHC溶液,使其膠原蛋白含量上升,高于動(dòng)物膠原蛋白對(duì)照組。

    2.4.2 RHC在皮膚深度方向上的吸收量分布由實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組不同深度處的染色顯色差異,可分析皮膚不同深度對(duì)于膠原蛋白的吸收情況。

    實(shí)驗(yàn)組中不同深度的組織切片,紅色分布較為一致,顏色不隨深度的變化而變化(圖8)。對(duì)照組中,顏色亦不隨深度的變化而改變。但在不同深度下,實(shí)驗(yàn)組的紅色分布多于對(duì)照組,這說(shuō)明在一定時(shí)間后,豬皮在吸收RHC后可達(dá)到一個(gè)平衡的狀態(tài),其吸收的膠原蛋白分布均勻。

    圖9顯示,實(shí)驗(yàn)組縱向紅色分布較為均勻,顏色不隨縱向位置的不同而發(fā)生較大變化,結(jié)果與圖7一致。而對(duì)照組(10倍濃度動(dòng)物膠原)中,顏色隨縱向位置的不同有較大的變化,證明動(dòng)物膠原在皮膚中滲透是不均一的;隨著濃度增加(100倍濃度動(dòng)物膠原),染料顏色加深,說(shuō)明動(dòng)物膠原透過(guò)皮膚的量增加。但同實(shí)驗(yàn)組比(從縱向及橫向2個(gè)方面),動(dòng)物膠原的滲透性能是弱于RHC的。本實(shí)驗(yàn)證明,RHC具有更強(qiáng)的透皮性能,且在皮膚的分散性更均勻。

    3 討論

    細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中,RHC促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的起效量為0.0025%,優(yōu)于市售普通膠原蛋白。重組膠原蛋白比普通膠原蛋白在分子量方面具有一定優(yōu)勢(shì),有研究表明,膠原蛋白分子量為1 500~3 000 Da時(shí),更容易被人體吸收利用。重組膠原蛋白在基因構(gòu)建時(shí),可通過(guò)控制氨基酸含量實(shí)現(xiàn)小分子量重組膠原蛋白的生產(chǎn)。本研究所用重組膠原蛋白分子量約2 000 Da,相比于市售的大分子膠原蛋白,重組膠原蛋白在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。

    促細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,24 h內(nèi),RHC促進(jìn)細(xì)胞遷移能力優(yōu)于市售普通膠原蛋白;細(xì)胞黏附性方面,RHC濃度越高,黏附性越強(qiáng);與動(dòng)物膠原蛋白相比,RHC具有更優(yōu)異的透皮性能。重組膠原蛋白具有與普通膠原蛋白相同的三螺旋結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上,本研究所用重組膠原蛋白在構(gòu)建過(guò)程中加入了更多的親水性基團(tuán)與活性基團(tuán),這些基團(tuán)有效提高了重組膠原蛋白的親水性與生物活性。親水性基團(tuán)可與皮膚中的水分結(jié)合達(dá)到保濕效果,也有效增強(qiáng)了細(xì)胞黏附性。同時(shí)強(qiáng)活性使得重組膠原蛋白具有強(qiáng)滲透性,可透過(guò)角質(zhì)層與皮膚上層細(xì)胞結(jié)合,參與和改善皮膚細(xì)胞的代謝,增強(qiáng)皮膚中原有膠原蛋白的活性。因此,重組膠原蛋白在促細(xì)胞遷移、促細(xì)胞黏附與透皮性方面都展現(xiàn)出優(yōu)于普通膠原蛋白的性能。綜上,從生物相容性方面分析,RHC展現(xiàn)出的優(yōu)良性能,為其在表皮修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了可能性。

    總體上,重組膠原蛋白應(yīng)用前景廣闊,其高穩(wěn)定性、易擴(kuò)大生產(chǎn)、高生物相容性等特點(diǎn)均是其作為組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品的實(shí)施基礎(chǔ),研究者也將重組膠原蛋白用于創(chuàng)面修復(fù)、角膜替代物等再生醫(yī)療領(lǐng)域,已取得了一定的臨床效果[10-14],故對(duì)重組膠原蛋白的開(kāi)發(fā)研究在未來(lái)依然是生物材料領(lǐng)域熱點(diǎn)研究方向之一。

    猜你喜歡
    市售膠原蛋白染色
    想不到你是這樣的膠原蛋白
    Coco薇(2017年12期)2018-01-03 21:27:09
    平面圖的3-hued 染色
    簡(jiǎn)單圖mC4的點(diǎn)可區(qū)別V-全染色
    美國(guó)肉參膠原蛋白肽對(duì)H2O2損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用
    膠原蛋白在食品中的應(yīng)用現(xiàn)狀及其發(fā)展前景分析
    油紅O染色在斑馬魚(yú)體內(nèi)脂質(zhì)染色中的應(yīng)用
    梭魚(yú)骨膠原蛋白的提取及其性質(zhì)
    兩類(lèi)冪圖的強(qiáng)邊染色
    市售威靈仙飲片的質(zhì)量分析
    14種市售抗菌藥對(duì)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的體外抑菌作用
    欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲成av人片在线播放无| 高清在线国产一区| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 成人av一区二区三区在线看| 少妇的逼好多水| 久久久久九九精品影院| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 91在线观看av| 久久精品人妻少妇| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 嫩草影院入口| 亚洲欧美激情综合另类| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 91久久精品电影网| 一二三四社区在线视频社区8| 男女视频在线观看网站免费| 久久久国产成人精品二区| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 精品国产亚洲在线| 亚洲av美国av| 亚洲成av人片免费观看| av黄色大香蕉| 小说图片视频综合网站| 美女黄网站色视频| 禁无遮挡网站| 久久久久精品国产欧美久久久| 免费看光身美女| 神马国产精品三级电影在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 级片在线观看| 欧美日韩综合久久久久久 | ponron亚洲| 国产91精品成人一区二区三区| 91在线精品国自产拍蜜月| 在线看三级毛片| 国产激情偷乱视频一区二区| 此物有八面人人有两片| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 无人区码免费观看不卡| 99久久99久久久精品蜜桃| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久久久久久久久黄片| 俺也久久电影网| 日韩欧美在线二视频| 亚洲国产精品合色在线| 在线观看av片永久免费下载| 黄色女人牲交| 男人的好看免费观看在线视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 一个人看视频在线观看www免费| 免费看a级黄色片| a级毛片a级免费在线| 麻豆国产av国片精品| 国产综合懂色| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产成年人精品一区二区| 中国美女看黄片| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产探花极品一区二区| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 精品久久久久久,| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 一级作爱视频免费观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 午夜福利在线在线| 午夜亚洲福利在线播放| xxxwww97欧美| 亚洲天堂国产精品一区在线| 免费看光身美女| 大型黄色视频在线免费观看| 国产真实伦视频高清在线观看 | 免费电影在线观看免费观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 日本免费a在线| 国产成人影院久久av| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产v大片淫在线免费观看| 日本一本二区三区精品| 在线国产一区二区在线| 看十八女毛片水多多多| 成人毛片a级毛片在线播放| 男人舔女人下体高潮全视频| 久久亚洲真实| 亚洲av成人精品一区久久| 欧美日韩黄片免| 精品午夜福利在线看| 亚洲最大成人手机在线| 亚洲在线自拍视频| 大型黄色视频在线免费观看| 超碰av人人做人人爽久久| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 最近中文字幕高清免费大全6 | 在线a可以看的网站| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产高清视频在线播放一区| 国产男靠女视频免费网站| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 成人欧美大片| 欧美日本亚洲视频在线播放| 嫩草影院入口| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 桃色一区二区三区在线观看| 国产免费男女视频| 日韩欧美三级三区| x7x7x7水蜜桃| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产主播在线观看一区二区| 麻豆国产av国片精品| 麻豆一二三区av精品| 此物有八面人人有两片| 91久久精品国产一区二区成人| 日韩欧美在线二视频| 欧美日韩综合久久久久久 | 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产精品亚洲av一区麻豆| 日本熟妇午夜| 国产91精品成人一区二区三区| 久久性视频一级片| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| www日本黄色视频网| 色播亚洲综合网| 精品久久久久久久久久久久久| 99视频精品全部免费 在线| 日韩欧美三级三区| 最新在线观看一区二区三区| 国产探花极品一区二区| 欧美黄色片欧美黄色片| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 久久中文看片网| 在现免费观看毛片| 久久久久免费精品人妻一区二区| 黄色女人牲交| 好男人在线观看高清免费视频| 麻豆一二三区av精品| 午夜福利18| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 欧美另类亚洲清纯唯美| 日韩人妻高清精品专区| 一区二区三区四区激情视频 | 色综合站精品国产| 国产单亲对白刺激| 国内精品美女久久久久久| 十八禁网站免费在线| 国产美女午夜福利| 成人国产综合亚洲| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美成人免费av一区二区三区| 在线a可以看的网站| 一二三四社区在线视频社区8| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 老司机深夜福利视频在线观看| 一区福利在线观看| 成人av在线播放网站| 亚洲成av人片在线播放无| 国产一区二区在线观看日韩| 最近在线观看免费完整版| 在线播放无遮挡| 久久精品国产自在天天线| 性色avwww在线观看| 免费人成在线观看视频色| 午夜福利在线在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 免费在线观看日本一区| 日本熟妇午夜| 黄片小视频在线播放| 午夜激情福利司机影院| 国产精品1区2区在线观看.| 精品乱码久久久久久99久播| 国产69精品久久久久777片| 欧美激情久久久久久爽电影| 丰满的人妻完整版| 99热6这里只有精品| 天天一区二区日本电影三级| 天堂动漫精品| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 日韩欧美 国产精品| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲avbb在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产精品爽爽va在线观看网站| 老司机福利观看| 不卡一级毛片| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 人妻久久中文字幕网| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精品三级大全| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲真实伦在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 啦啦啦韩国在线观看视频| 两个人的视频大全免费| 一夜夜www| 久久国产精品人妻蜜桃| 精品人妻视频免费看| 高清毛片免费观看视频网站| netflix在线观看网站| 一a级毛片在线观看| 1024手机看黄色片| 婷婷精品国产亚洲av| АⅤ资源中文在线天堂| 精品久久久久久成人av| 1000部很黄的大片| 国产精品久久视频播放| 国产精品亚洲美女久久久| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲国产色片| 亚洲色图av天堂| 长腿黑丝高跟| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 午夜影院日韩av| 性色avwww在线观看| 亚洲无线观看免费| 一二三四社区在线视频社区8| 成年女人毛片免费观看观看9| av天堂中文字幕网| 淫秽高清视频在线观看| av黄色大香蕉| 美女免费视频网站| 国产成人aa在线观看| 成年版毛片免费区| 久久精品影院6| 国产单亲对白刺激| 成人国产一区最新在线观看| 久久久久国内视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 真人做人爱边吃奶动态| 在线a可以看的网站| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 天天躁日日操中文字幕| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 午夜免费激情av| 中文字幕久久专区| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产老妇女一区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲精品在线美女| 性插视频无遮挡在线免费观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 久久这里只有精品中国| 欧美丝袜亚洲另类 | 欧美日韩综合久久久久久 | 亚洲精品成人久久久久久| 欧美黄色片欧美黄色片| 色精品久久人妻99蜜桃| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产熟女xx| 中文字幕av成人在线电影| 舔av片在线| 国产淫片久久久久久久久 | 人人妻人人澡欧美一区二区| 欧美精品国产亚洲| 成人无遮挡网站| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲专区中文字幕在线| 极品教师在线免费播放| 亚洲人成网站在线播| 欧美区成人在线视频| 国产成年人精品一区二区| 国产麻豆成人av免费视频| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产精品影院久久| 日本免费a在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 在线观看免费视频日本深夜| 长腿黑丝高跟| 热99re8久久精品国产| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲国产精品成人综合色| 黄色丝袜av网址大全| 神马国产精品三级电影在线观看| 精品欧美国产一区二区三| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 久久久精品欧美日韩精品| 男女那种视频在线观看| 亚洲美女黄片视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 欧美日韩综合久久久久久 | 在线观看午夜福利视频| 免费看光身美女| 亚洲无线在线观看| 亚洲在线自拍视频| 黄片小视频在线播放| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产成人av教育| 亚洲电影在线观看av| 丝袜美腿在线中文| 亚洲最大成人中文| 俄罗斯特黄特色一大片| 午夜视频国产福利| 久久人人爽人人爽人人片va | 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产人妻一区二区三区在| 国产老妇女一区| 国产黄色小视频在线观看| 99热精品在线国产| 在线免费观看的www视频| 亚洲人成网站在线播| 免费看a级黄色片| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲成人免费电影在线观看| 男女视频在线观看网站免费| 国产精品国产高清国产av| 日本免费a在线| 人人妻人人看人人澡| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲真实伦在线观看| 精品人妻熟女av久视频| 日韩欧美 国产精品| 一本久久中文字幕| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 性色av乱码一区二区三区2| 看片在线看免费视频| 国产成年人精品一区二区| www.熟女人妻精品国产| 草草在线视频免费看| 免费看日本二区| 久久精品人妻少妇| 国产成人av教育| 1000部很黄的大片| 亚洲人成电影免费在线| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产亚洲精品久久久com| 波野结衣二区三区在线| 丝袜美腿在线中文| 成年版毛片免费区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产探花极品一区二区| 51午夜福利影视在线观看| 国产精品不卡视频一区二区 | 特级一级黄色大片| 一级毛片久久久久久久久女| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 可以在线观看毛片的网站| 国产高清视频在线观看网站| 国产色婷婷99| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| av国产免费在线观看| xxxwww97欧美| 亚洲自拍偷在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 又粗又爽又猛毛片免费看| 一本一本综合久久| 12—13女人毛片做爰片一| 午夜免费激情av| 欧美日韩综合久久久久久 | 最近在线观看免费完整版| 精品国产亚洲在线| 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 99视频精品全部免费 在线| 日韩欧美精品免费久久 | 国产成人av教育| 成人毛片a级毛片在线播放| 最近在线观看免费完整版| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 91久久精品国产一区二区成人| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲自拍偷在线| 日韩欧美精品免费久久 | 俄罗斯特黄特色一大片| 国产成人a区在线观看| 午夜影院日韩av| 男插女下体视频免费在线播放| 国产精品99久久久久久久久| 色吧在线观看| aaaaa片日本免费| 国产老妇女一区| 最近视频中文字幕2019在线8| 级片在线观看| 日本与韩国留学比较| 国产成人av教育| 日韩精品中文字幕看吧| 少妇的逼好多水| 久久伊人香网站| 日韩免费av在线播放| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久中文看片网| 日本在线视频免费播放| 亚洲国产精品999在线| 午夜免费激情av| 乱码一卡2卡4卡精品| 99视频精品全部免费 在线| 国产精品,欧美在线| 最近最新免费中文字幕在线| 免费在线观看日本一区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 色精品久久人妻99蜜桃| 成人精品一区二区免费| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产视频内射| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久这里只有精品中国| 51国产日韩欧美| 欧美最新免费一区二区三区 | 国产精品亚洲av一区麻豆| 悠悠久久av| 中国美女看黄片| 欧美+日韩+精品| 国产欧美日韩精品亚洲av| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 波多野结衣高清无吗| 久久九九热精品免费| 又紧又爽又黄一区二区| 毛片女人毛片| www.熟女人妻精品国产| 国产精品,欧美在线| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲熟妇熟女久久| 99久久99久久久精品蜜桃| 我要搜黄色片| 看十八女毛片水多多多| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 在线观看66精品国产| 午夜福利视频1000在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 日韩成人在线观看一区二区三区| 精品日产1卡2卡| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 真人一进一出gif抽搐免费| 日本黄色视频三级网站网址| 青草久久国产| 午夜免费成人在线视频| 99久国产av精品| 精品一区二区免费观看| 窝窝影院91人妻| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 成人永久免费在线观看视频| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 全区人妻精品视频| 午夜激情欧美在线| 国产不卡一卡二| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产精品日韩av在线免费观看| 在线观看舔阴道视频| 欧美zozozo另类| 熟女电影av网| 免费观看的影片在线观看| 欧美日韩黄片免| 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产精品一区二区免费欧美| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产探花极品一区二区| 一本久久中文字幕| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 免费在线观看日本一区| a级毛片a级免费在线| 黄色配什么色好看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 91字幕亚洲| 一级av片app| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 免费高清视频大片| 国产成+人综合+亚洲专区| 午夜福利在线观看吧| 一进一出抽搐gif免费好疼| 欧美3d第一页| 久久精品国产清高在天天线| 国产在线男女| 99久久无色码亚洲精品果冻| 两个人的视频大全免费| 麻豆国产97在线/欧美| 国产伦在线观看视频一区| 男女视频在线观看网站免费| 一区二区三区高清视频在线| 婷婷丁香在线五月| 波多野结衣高清作品| 一本综合久久免费| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲精品一区av在线观看| 精品日产1卡2卡| 国产高清视频在线观看网站| 特级一级黄色大片| 嫁个100分男人电影在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产日本99.免费观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 精品一区二区三区视频在线| 色哟哟哟哟哟哟| 久久久久亚洲av毛片大全| 免费搜索国产男女视频| netflix在线观看网站| 国产精品三级大全| 欧美潮喷喷水| 精华霜和精华液先用哪个| 久久久国产成人精品二区| 色综合站精品国产| 看免费av毛片| 97超视频在线观看视频| 久久人妻av系列| 日韩欧美三级三区| 男女那种视频在线观看| 亚州av有码| 日本一本二区三区精品| 欧美黑人欧美精品刺激| 天堂网av新在线| 欧美精品国产亚洲| 熟女电影av网| 欧美日韩乱码在线| 一区二区三区激情视频| 日本黄大片高清| 久久久久久国产a免费观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 黄色一级大片看看| 男女下面进入的视频免费午夜| 日本精品一区二区三区蜜桃| www.熟女人妻精品国产| 精品人妻偷拍中文字幕| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲黑人精品在线| av天堂中文字幕网| 在线观看午夜福利视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 偷拍熟女少妇极品色| 一本精品99久久精品77| 久久精品国产清高在天天线| 国产精品伦人一区二区| av天堂在线播放| 午夜激情福利司机影院| 悠悠久久av| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 99国产极品粉嫩在线观看| 极品教师在线视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 内地一区二区视频在线| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 免费观看的影片在线观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 脱女人内裤的视频| 淫秽高清视频在线观看| 全区人妻精品视频| 国产v大片淫在线免费观看| 国产野战对白在线观看| av在线老鸭窝| 国产黄色小视频在线观看| 欧美日韩黄片免| 18禁黄网站禁片午夜丰满| www.色视频.com| 国产成人a区在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 波野结衣二区三区在线| 国产麻豆成人av免费视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | or卡值多少钱| 波野结衣二区三区在线| 久久午夜亚洲精品久久| www日本黄色视频网| 看片在线看免费视频| 一级毛片久久久久久久久女| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产熟女xx| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产高清视频在线播放一区| 别揉我奶头 嗯啊视频| 欧美性感艳星| 亚洲午夜理论影院| 成年人黄色毛片网站| avwww免费| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 九九在线视频观看精品| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲av.av天堂| 欧美高清成人免费视频www| www.www免费av| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 一区福利在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 日本免费一区二区三区高清不卡| www日本黄色视频网| 国产高清视频在线观看网站| 两人在一起打扑克的视频| 精品一区二区三区人妻视频| 欧美乱妇无乱码| 禁无遮挡网站| 757午夜福利合集在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 九色成人免费人妻av| 亚洲成av人片在线播放无| 亚州av有码| 国产伦一二天堂av在线观看| 性插视频无遮挡在线免费观看| h日本视频在线播放|