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    重組膠原蛋白在表皮修復(fù)中的作用機(jī)理研究?

    2022-12-12 10:37:20趙健烽馮麗萍黃建民馬德蓉
    生物學(xué)通報(bào) 2022年2期
    關(guān)鍵詞:市售膠原蛋白染色

    李 濱 趙健烽 馮麗萍 黃建民 馬德蓉

    (1江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)工程學(xué)院 江蘇連云港 222000 2江蘇江山聚源生物技術(shù)有限公司 江蘇泰州 214500)

    膠原蛋白是利用酸、酶等提取介質(zhì)從動(dòng)物組織中提取的大分子蛋白質(zhì),因其具有無(wú)毒、易降解、易吸收、低抗原性等特性,深受生物醫(yī)學(xué)及日用化學(xué)領(lǐng)域青睞,被廣泛用作手術(shù)縫合線、止血海綿、人工皮膚、人工血管、人角膜、藥物載體等[1]。但動(dòng)物來(lái)源的大分子膠原蛋白仍存在一些問(wèn)題[2]:1)存在潛在的傳染病危險(xiǎn),包括動(dòng)物源及人源性傳染?。ɡ?,艾滋病等);2)存在引起機(jī)體排斥反應(yīng)炎癥的風(fēng)險(xiǎn);3)排斥反應(yīng)導(dǎo)致的高吸收率使治療頻次增加,成本增加。此外,動(dòng)物源膠原蛋白的提取過(guò)程還存在高成本、重污染、獲取率低等缺陷,因此,利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組膠原蛋白(recombinant human collagen,RHC)受到廣泛關(guān)注[3]。

    重組膠原蛋白的生產(chǎn)工藝為:將來(lái)自人體膠原蛋白的mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,隨后進(jìn)行酶切,再通過(guò)特定序列的整理縫合、與特定表達(dá)載體連接,轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Escherichia coli)或畢赤酵母(Pichia pastoris)中[1-2],獲得相對(duì)較高的表達(dá)量;通過(guò)發(fā)酵、分離、純化手段生產(chǎn)生物重組膠原蛋白[3-8]。因其具有良好的生物學(xué)相容性、細(xì)胞黏附性、促進(jìn)新細(xì)胞形成和止血功能[3],對(duì)重組膠原蛋白在創(chuàng)傷修護(hù)類(lèi)化妝品中的作用機(jī)理研究,有助于將此類(lèi)蛋白質(zhì)推廣至日用化妝品領(lǐng)域乃至生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

    實(shí)驗(yàn)試劑:血清培養(yǎng)基、無(wú)血清培養(yǎng)基、磷酸氫二鈉(分析純)、磷酸二氫鉀(分析純)、氯化鈉(分析純)、氯化鉀(分析純)、EDTA(≥99.5%)、DMSO(≥99.9%)、Weigert鐵蘇木素染色液、天狼星紅染色液、MTT試劑盒(碧云天生物)、細(xì)胞黏附檢測(cè)試劑盒(上??道噬铮⒊衫w維細(xì)胞(原代培養(yǎng))、表皮細(xì)胞(原代培養(yǎng))、重組膠原蛋白、市售膠原蛋白樣品1(簡(jiǎn)稱“市售1”)、市售膠原蛋白樣品2(簡(jiǎn)稱“市售2”)、動(dòng)物膠原蛋白、RGD肽(Arg-Gly-Asp多肽,一種已被報(bào)道的細(xì)胞粘附序列,可明顯增加細(xì)胞黏附性)。

    儀器:96孔板(Nunc-96,賽默飛世爾,中國(guó))、Franz擴(kuò)散池(Permergear,世聯(lián)博研,美國(guó))、酶標(biāo)儀(MR-96A,貝登醫(yī)療,南京)、低速冷凍離心機(jī)(RC3B PLUS,SORVALL,美國(guó))、光學(xué)顯微鏡(DM3000 LED,徠卡,德國(guó))、石蠟包埋機(jī)(EG1150H,徠卡,德國(guó))、切片機(jī)(KD-3368AM,世紀(jì)科信,北京)、移液器(F1 Clip Tip,賽默飛世爾,中國(guó))。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 促細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn) 將活性好的細(xì)胞制作成單細(xì)胞懸浮液并統(tǒng)計(jì)數(shù)量,使細(xì)胞密度為104個(gè)/mL,接種于96孔板,每孔中加入細(xì)胞懸浮液200 μL,生長(zhǎng)至細(xì)胞貼壁后,加入不同濃度的待測(cè)樣品(0.0001%、0.0005%、0.0025%、0.0125%、0.0625%、0.3125%,注:如果有效,可繼續(xù)下調(diào)濃度),每個(gè)樣品設(shè)置5個(gè)重復(fù),置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h(每72 h更換一次含膠原蛋白樣品的培養(yǎng)液)。

    至每個(gè)時(shí)間點(diǎn),向?qū)?yīng)的孔中加入20 μL MTT溶液(用pH=7.4的PBS配制),再培養(yǎng)4 h,停止。

    快速翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)板,棄去上清液,每孔添加150 μL DMSO,振蕩10 min溶解MTT結(jié)晶。

    用酶聯(lián)檢測(cè)儀檢測(cè)各孔在490 nm處的吸光值(OD490值),同時(shí)設(shè)置無(wú)細(xì)胞孔作為對(duì)照組進(jìn)行調(diào)零,取6孔平均值。

    以培養(yǎng)時(shí)間與吸光值為坐標(biāo)軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

    1.2.2 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

    1)細(xì)胞鋪板:以記號(hào)筆均勻地分割6孔板,中間間隔0.5~1 cm,每個(gè)孔至少橫穿3條線。每孔中大約加入5×105個(gè)/mL細(xì)胞,過(guò)夜后可將孔鋪滿。

    2)劃痕實(shí)驗(yàn):第2天使用移液器吸頭垂直于橫線進(jìn)行劃痕,用PBS清洗細(xì)胞3次,洗脫被劃下的細(xì)胞,加入至含有RHC的無(wú)血清培養(yǎng)基中,作為對(duì)照組;加入至含有實(shí)驗(yàn)樣品(市售1和市售2)的培養(yǎng)基中,作為實(shí)驗(yàn)組,最終濃度為0.05%。在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),取樣時(shí)間分別為0 h、6 h、24 h。

    3)數(shù)據(jù)處理:計(jì)算不同時(shí)間段之間細(xì)胞整體遷移的距離,得出平均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差,建立直角坐標(biāo)系,以時(shí)間為橫軸,遷移距離為縱軸作圖,計(jì)算公式如下:

    式中:Si表示每個(gè)時(shí)間長(zhǎng)度細(xì)胞整體遷移的距離;S0表示0時(shí)距離長(zhǎng)度;St表示每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的距離長(zhǎng)度。

    1.2.3 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

    1)包被:將100 μL包被液加入96孔板,2~8℃條件下過(guò)夜。移除包被液,用洗滌液洗滌2~3次。

    2)細(xì)胞接種:胰酶消化處理的待測(cè)細(xì)胞,經(jīng)PBS洗滌后,用相應(yīng)培養(yǎng)基重懸制成細(xì)胞懸液,按5×104個(gè)/mL細(xì)胞,接種于96孔板;同時(shí)加入含膠原蛋白樣品,RHC終濃度為0.05%和0.01%,設(shè)置5個(gè)重復(fù)。設(shè)立對(duì)照組,即未加樣品的細(xì)胞懸液組;設(shè)置含有RGD肽的陽(yáng)性對(duì)照組。放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h。取出培養(yǎng)板,棄培養(yǎng)基,洗滌2~3次,每孔加入100 μL新鮮培養(yǎng)基。

    3)黏附率檢測(cè):96孔板每孔加入10 μL細(xì)胞染色液B,在37℃孵育2 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm各孔的吸光值(OD450值)。各重復(fù)孔的OD450值取平均數(shù),計(jì)算細(xì)胞黏附率的公式如下:

    1.2.4 透皮性實(shí)驗(yàn)

    1)制樣:取制備好的離體豬皮,用擴(kuò)散池進(jìn)行透皮實(shí)驗(yàn)。供給液分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。

    2)組織切片:用4%多聚甲醛固定上述豬皮24 h,用自來(lái)水高流速?zèng)_洗12 h,后依次浸泡在75%、85%、95%Ⅰ、95%Ⅱ的乙醇中各1 h,進(jìn)行脫水處理。然后浸泡于1∶1的無(wú)水乙醇及二甲苯混合液中30 min,二甲苯Ⅰ中15 min,二甲苯Ⅱ中15 min,進(jìn)行透明化處理。再進(jìn)行浸蠟處理,分別浸泡于石蠟Ⅰ中1 h,石蠟Ⅱ中過(guò)夜,石蠟Ⅲ中1 h。用石蠟包埋機(jī)進(jìn)行包埋,修蠟后,在-20℃的冰箱中過(guò)夜保存。最后,用切片機(jī)將切片橫向及縱向切成5 mm切片,40℃展片,62℃烤片。

    3)天狼星紅染色:

    ①染色前先脫蠟:水,二甲苯Ⅰ中10 min,二甲苯Ⅱ中10 min,無(wú)水乙醇Ⅰ中2 min,無(wú)水乙醇Ⅱ中2 min,95%乙醇2 min,85%乙醇2 min,75%乙醇2 min,流水沖洗。

    ②染色時(shí)用weigert鐵蘇木素染色液將組織切片染色10~20 min,自來(lái)水沖洗5~10 min,用蒸餾水清洗1次。隨后使用天狼星紅染液染色1 h,流水沖洗后,去除染液。

    ③染色后脫水,浸泡于95%Ⅰ、95%Ⅱ的乙醇中各5 min,無(wú)水乙醇Ⅰ中5 min,無(wú)水乙醇Ⅱ中5 min,二甲苯Ⅰ中5 min,二甲苯Ⅱ中5 min透明。

    ④將中性樹(shù)膠滴于載玻片組織上,用蓋玻片覆蓋,覆蓋時(shí)應(yīng)先接觸一邊,后逐漸覆蓋,可有效避免產(chǎn)生氣泡。

    4)顯微鏡觀察拍照:在普通光學(xué)顯微鏡下,觀察分析實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在顯微鏡下的組織切片,并拍照。紅色為膠原纖維,藍(lán)色為細(xì)胞核,黃色為肌纖維。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

    2.1.1 RHC促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的起效量實(shí)驗(yàn) 對(duì)比各組細(xì)胞生長(zhǎng),分析RHC促進(jìn)成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)的最低起效量濃度。圖1結(jié)果顯示,成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的生長(zhǎng)趨勢(shì)相似。與對(duì)照組相比,當(dāng)RHC濃度≥0.0025%時(shí),實(shí)驗(yàn)組均可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng);而當(dāng)RHC濃度<0.0025%時(shí),其生長(zhǎng)情況與對(duì)照組大致相同。這證明RHC促進(jìn)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞)生長(zhǎng)的起效量為0.0025%。

    2.1.2 RHC與市售普通膠原蛋白1、2對(duì)比實(shí)驗(yàn)本文選用RHC濃度為0.01%,該濃度可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng),采用實(shí)驗(yàn)方法1.1.2得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示,RHC組的細(xì)胞生長(zhǎng)速率明顯快于市售普通膠原蛋白1、2組,表明RHC促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的性能優(yōu)于市售普通膠原蛋白1、2。

    2.1.3 表皮細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)學(xué)變化 如圖3所示,在倒置顯微鏡下,接種1 d,各組表皮細(xì)胞呈球形,大小均勻,邊界清晰;在接種2~4 d內(nèi),細(xì)胞逐漸貼壁生長(zhǎng),形狀呈眼球形,可觀察到細(xì)胞核,細(xì)胞數(shù)量快速增長(zhǎng)并連接成片狀,各組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異;與空白對(duì)照組比,其他各組細(xì)胞增長(zhǎng)量明顯,其中RHC組表皮細(xì)胞密度最大,分布均勻。

    2.2 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞整體遷移距離,分析RHC及其他樣品促進(jìn)細(xì)胞遷移的能力。

    本實(shí)驗(yàn)主要為劃痕實(shí)驗(yàn),通過(guò)顯微鏡觀察不同時(shí)間內(nèi)“傷口”的愈合程度,即細(xì)胞的遷移(圖4)。圖5統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,RHC組在6 h的細(xì)胞遷移距離大于其他組在24 h的遷移距離,而24 h后,RHC組的細(xì)胞遷移距離遠(yuǎn)高于其他對(duì)照組,證明RHC促進(jìn)細(xì)胞遷移能力優(yōu)于市售普通膠原蛋白。

    此外,本研究還采用以人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞為代表的單層體外實(shí)驗(yàn)?zāi)P停▽?shí)驗(yàn)方法中未體現(xiàn)這部分),測(cè)定了2種化妝品原料(海洋膠原蛋白)體外促進(jìn)創(chuàng)面愈合的能力。在體外系統(tǒng)中,通過(guò)產(chǎn)品促進(jìn)損傷組織愈合的能力評(píng)價(jià)修復(fù)效果。

    以0.1%濃度為例,在相同時(shí)間內(nèi),RHC的細(xì)胞修復(fù)能力比海洋膠原蛋白更加突出。圖6數(shù)據(jù)顯示,經(jīng)過(guò)t檢驗(yàn),2 h后RHC組細(xì)胞遷移變化率呈顯著性差異,且24 h后RHC的細(xì)胞修復(fù)比海洋膠原蛋白高21.1%。因此,RHC在細(xì)胞修復(fù)方面的效果比海洋膠原蛋白更加顯著,且起效速度更快,2 h內(nèi)即有顯著效果。

    2.3 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) 根據(jù)各組的黏附率,分析并比較RHC與市售普通膠原蛋白1、2及RGD肽的細(xì)胞黏附能力。

    如表1所示,RHC的促細(xì)胞黏附性能明顯優(yōu)于市售普通膠原蛋白,且RHC促細(xì)胞黏附性能與濃度相關(guān),RHC濃度越大,細(xì)胞黏附增強(qiáng),這一性質(zhì)對(duì)不同種類(lèi)的細(xì)胞無(wú)較大差異。當(dāng)RHC濃度達(dá)到0.05%時(shí),細(xì)胞黏附率已高達(dá)45%,根據(jù)已報(bào)導(dǎo)文獻(xiàn)[9]:細(xì)胞黏附率大于40%說(shuō)明材料已具有優(yōu)良的細(xì)胞黏附性能。

    表1 不同濃度RHC的細(xì)胞黏附情況匯總(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

    2.4 透皮性實(shí)驗(yàn)

    2.4.1 皮膚中RHC的吸收利用情況 通過(guò)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的染色,比較2組內(nèi)表皮RHC含量。由內(nèi)表皮RHC含量差異,得出皮膚中RHC的吸收利用量。

    在顯微鏡下觀察對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的切片并拍照(圖7),可發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中紅色所占面積更大,表明涂抹過(guò)RHC溶液的豬皮中膠原蛋白含量更多,即豬皮吸收了一定的RHC溶液,使其膠原蛋白含量上升,高于動(dòng)物膠原蛋白對(duì)照組。

    2.4.2 RHC在皮膚深度方向上的吸收量分布由實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組不同深度處的染色顯色差異,可分析皮膚不同深度對(duì)于膠原蛋白的吸收情況。

    實(shí)驗(yàn)組中不同深度的組織切片,紅色分布較為一致,顏色不隨深度的變化而變化(圖8)。對(duì)照組中,顏色亦不隨深度的變化而改變。但在不同深度下,實(shí)驗(yàn)組的紅色分布多于對(duì)照組,這說(shuō)明在一定時(shí)間后,豬皮在吸收RHC后可達(dá)到一個(gè)平衡的狀態(tài),其吸收的膠原蛋白分布均勻。

    圖9顯示,實(shí)驗(yàn)組縱向紅色分布較為均勻,顏色不隨縱向位置的不同而發(fā)生較大變化,結(jié)果與圖7一致。而對(duì)照組(10倍濃度動(dòng)物膠原)中,顏色隨縱向位置的不同有較大的變化,證明動(dòng)物膠原在皮膚中滲透是不均一的;隨著濃度增加(100倍濃度動(dòng)物膠原),染料顏色加深,說(shuō)明動(dòng)物膠原透過(guò)皮膚的量增加。但同實(shí)驗(yàn)組比(從縱向及橫向2個(gè)方面),動(dòng)物膠原的滲透性能是弱于RHC的。本實(shí)驗(yàn)證明,RHC具有更強(qiáng)的透皮性能,且在皮膚的分散性更均勻。

    3 討論

    細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中,RHC促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的起效量為0.0025%,優(yōu)于市售普通膠原蛋白。重組膠原蛋白比普通膠原蛋白在分子量方面具有一定優(yōu)勢(shì),有研究表明,膠原蛋白分子量為1 500~3 000 Da時(shí),更容易被人體吸收利用。重組膠原蛋白在基因構(gòu)建時(shí),可通過(guò)控制氨基酸含量實(shí)現(xiàn)小分子量重組膠原蛋白的生產(chǎn)。本研究所用重組膠原蛋白分子量約2 000 Da,相比于市售的大分子膠原蛋白,重組膠原蛋白在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。

    促細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,24 h內(nèi),RHC促進(jìn)細(xì)胞遷移能力優(yōu)于市售普通膠原蛋白;細(xì)胞黏附性方面,RHC濃度越高,黏附性越強(qiáng);與動(dòng)物膠原蛋白相比,RHC具有更優(yōu)異的透皮性能。重組膠原蛋白具有與普通膠原蛋白相同的三螺旋結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上,本研究所用重組膠原蛋白在構(gòu)建過(guò)程中加入了更多的親水性基團(tuán)與活性基團(tuán),這些基團(tuán)有效提高了重組膠原蛋白的親水性與生物活性。親水性基團(tuán)可與皮膚中的水分結(jié)合達(dá)到保濕效果,也有效增強(qiáng)了細(xì)胞黏附性。同時(shí)強(qiáng)活性使得重組膠原蛋白具有強(qiáng)滲透性,可透過(guò)角質(zhì)層與皮膚上層細(xì)胞結(jié)合,參與和改善皮膚細(xì)胞的代謝,增強(qiáng)皮膚中原有膠原蛋白的活性。因此,重組膠原蛋白在促細(xì)胞遷移、促細(xì)胞黏附與透皮性方面都展現(xiàn)出優(yōu)于普通膠原蛋白的性能。綜上,從生物相容性方面分析,RHC展現(xiàn)出的優(yōu)良性能,為其在表皮修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了可能性。

    總體上,重組膠原蛋白應(yīng)用前景廣闊,其高穩(wěn)定性、易擴(kuò)大生產(chǎn)、高生物相容性等特點(diǎn)均是其作為組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品的實(shí)施基礎(chǔ),研究者也將重組膠原蛋白用于創(chuàng)面修復(fù)、角膜替代物等再生醫(yī)療領(lǐng)域,已取得了一定的臨床效果[10-14],故對(duì)重組膠原蛋白的開(kāi)發(fā)研究在未來(lái)依然是生物材料領(lǐng)域熱點(diǎn)研究方向之一。

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