錦州地區(qū)副豬嗜血桿菌病流行情況調(diào)查與藥敏試驗(yàn)

趙心悅，郝 爽，李思奇，胡籍勻，賀騰飛，王書全

（錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001）

副豬嗜血桿菌病也稱格拉澤氏?。℅lasser’s disease），是由副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)引起的以纖維素性多漿膜炎和關(guān)節(jié)炎為特征的一種豬傳染病。本病于1990年有德國學(xué)者Glasser首次報(bào)道。目前，已在世界各地廣泛分布，并成為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的呼吸道細(xì)菌性的傳染病病之一。HPS血清型眾多，目前至少可以分為15種血清型，另有20%以上的分離株無法定型，各血清型之間的致病性也存在著極大的差異，我國流行血清型主要以4、5型為主，其次為12、13和14型，且有明顯的地域性。

為了解HPS在遼寧省錦州市的感染和流行情況，對2019～2020年錦州地區(qū)養(yǎng)殖場的采集的疑似樣本，進(jìn)行HPS分離鑒定、分型及藥敏試驗(yàn)，旨在為錦州地區(qū)副豬嗜血桿菌病的預(yù)防和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料于2019年3月～2020年6月，采集來自錦州市太和區(qū)、凌海市、北寧市、黑山縣、義縣等地區(qū)疑似病例樣本（肺臟、脾臟、關(guān)節(jié)液、心包液、腦組織）37例。

1.2 細(xì)菌分離鑒定

1.2.1 涂片鏡檢 分別對病料樣本進(jìn)行革蘭氏染色及美蘭染色鏡檢，觀察形態(tài)特征。

1.2.2 分離培養(yǎng) 取上述病料接種巧克力瓊脂平板培養(yǎng)基上，置于含5%～10%CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24～48h。觀察菌落形態(tài)特征，并挑取菌落與金黃色葡萄球菌（由錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)傳染病病實(shí)驗(yàn)室提供）做交叉劃線培養(yǎng)，觀察菌落生長規(guī)律及是否有溶血想象。

1.2.3 生化實(shí)驗(yàn) 依文獻(xiàn)方法將可疑菌株進(jìn)行純培養(yǎng)后設(shè)置陽性對照進(jìn)行生化試驗(yàn)，鑒定菌株。

1.3 HPS血清型鑒定依文獻(xiàn)方法參照進(jìn)行合成引物（生工生物工程(上海)技術(shù)服務(wù)有限公司合成），采用試劑盒（天根生物科技(北京)有限公司）方法提取DNA，并進(jìn)行多重PCR鑒定，引物大小分別為180bp(1型)、295bp(2型)、650bp(3型)、320bp(4型)、450bp(5型)、360bp(6型)、490bp（7型）、650bp(8型)、710bp(9型)、790bp(10型)、890bp(11型)、508bp(12型)、840bp(13型)、730bp(14型)、550bp(15型)。

1.4 藥敏試驗(yàn)對具有代表性血清型的HPS菌株采用Kirby-bauer紙片法對阿莫西林、青霉素、頭孢噻肟、頭孢曲松、新霉素、阿米卡星、氟苯尼考、克林霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素和復(fù)方新諾明12種藥物（購于杭州微生物試劑有限公司）進(jìn)行抗生素敏感試驗(yàn)，根據(jù)抑菌圈大小判定菌株對抗生素的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定

2.1.1 涂片鏡檢 革蘭氏染色可見陰性、有莢膜的小桿菌；美蘭染色呈現(xiàn)兩極著色。

2.1.2 分離培養(yǎng) 可見有棕色至灰白色的針尖大小的菌落。挑取菌落與金黃色葡萄球菌做交叉劃線培養(yǎng)，可見典型的“衛(wèi)星現(xiàn)象”，即在葡萄球菌的菌落周圍出現(xiàn)圓形、隆起、表面光滑、邊緣整齊、灰白色半透明的針尖大小的菌落，無溶血現(xiàn)象。

2.1.3 生化試驗(yàn) 葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、半乳糖為陽性；木糖、甘露醇、吲哚、尿酶、氧化酶試驗(yàn)為陰性，觸酶和酸還原試驗(yàn)為陽性，與HPS標(biāo)準(zhǔn)菌株的生化特征相符，獲得23株HPS菌株。

2.2 HPS血清型鑒定對23株HPS菌株采用多重PCR進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清1型、4型、5型、7型、14型，其中血清4型11株（47.8%），5型6株（26.1%），1、2、14型各1株（各4.3%），不可分型菌株為3株（13.0%）。

2.3 藥敏試驗(yàn)本研究對獲得的菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明23株分離株對頭孢噻肟（100%）、氟苯尼考（100%）、頭孢曲松（91.3%）、阿莫西林（78.3%）、阿米卡星（78.3%）較敏感；對青霉素、克林霉素、卡那霉素和復(fù)方新諾明耐藥性較高，分別為69.7%、69.7%、78.3%，87.0%。

3 討論

HPS是正常呼吸菌群的一個成員，并且在豬群中普遍存在，它在仔豬上呼吸道的一個早期寄居菌，最長在初生后通過伴隨分娩時與母豬的接觸而獲得。副豬嗜血桿菌病是目前豬常見的呼吸道傳染病，也是豬呼吸道綜合征的重要的病原體之一，對養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，尤其對規(guī)?；B(yǎng)殖場。HPS血清型較多，各血清型菌株之間的致病力也存在極大的差異，其中血清1、5、10、12、13、14型毒力最強(qiáng)，其次是血清2、4、8、15型，血清3、6、7、9、11型的毒力較弱；我國目前流行的血清型主要為4型和5型，此外還有1型、12型、13型。張清嫻等對河南省46株HPS共檢測出7種血清型（2、4、5/12、6、7、11、13），血清型5/12和4為優(yōu)勢血清型,最流行的血清型為5/12型（15/46,32.6%），其次是4型（12/46,26.1%）和7型（7/46,15.2%）；王彬[5]對煙臺地區(qū)分離的55株HPS血清型為1型1株，4型21株、5型15株、14型5株、NT型13株，分離率分別為1.8%、38.2%、27.3%、9.1%、23.6%。而李曦婷在2015～2016年間對遼寧省內(nèi)部分市縣（不含錦州地區(qū)）的HPS進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，分離得到1株血清1型、3株血清7型、2株血清9型、1株血清11型和1株血清14型，且有一株未測定出血清型，與本研究表明錦州地區(qū)主要流行的血清型為4型和5型，這一結(jié)果與王彬、張清嫻等的研究結(jié)果基本一致，但與李曦婷得研究結(jié)果有較大的差異，這可能與樣品采集來源或菌株數(shù)量等差異有關(guān)，但也從另一方面說明了HPS具有明顯的地方性特征。

本研究表明，不同菌株對抗生素耐藥性存在一定的差異，但所有菌株對頭孢噻肟、氟苯尼考均敏感，大部分菌株對頭孢曲松、阿莫西林、阿米卡星存在較高的敏感性，這也為錦州地區(qū)副豬嗜血桿菌病的防治提供了理論依據(jù)。