曲霉聚合酶鏈反應(yīng)的技術(shù)推薦、臨床應(yīng)用和納入原則更新
——歐洲癌癥研究和治療組織/真菌研究組教育和研究共同體（EORTC/MSGERC）第二次修訂

2019年歐洲癌癥研究和治療組織/真菌研究組教育和研究共同體（EORTC/MSGERC）侵襲性真菌病定義共識更新，將血液和支氣管肺泡灌洗液（BALF）的曲霉聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）納入侵襲性曲霉?。↖A）臨床診斷的真菌學標準。取得該顯著進步的基礎(chǔ)源于以下方面：歐洲曲霉PCR方案（EAPCRI），現(xiàn)在被稱為真菌PCR方案（FPCRI）極大促進了曲霉PCR方法學的標準化；商品化試劑的可及性；各種薈萃分析和隨機對照臨床研究（研究方案中包含PCR技術(shù)）；以及檢測性能的第三方評價。

當考慮某一檢測方法是否適用于臨床時，必須考慮其技術(shù)的穩(wěn)定性和適用性、分析和臨床性能以及臨床實用性。檢測頻率、樣本類型和結(jié)果解釋都會受到檢測目的（篩查與診斷）的影響，并因檢測目的的變化而變化。在將一項檢測方法納入到EORTC/MSGERC定義的過程中，方法特異性最為重要，因為將患者納入新療法的臨床試驗或評估新試驗的性能時，診斷的準確性至關(guān) 重要。

本文總結(jié)了將曲霉PCR納入到最新的EORTC/MSGERC定義的依據(jù)，并描述了其最新進展、臨床需求和發(fā)展?jié)撃堋?/p>

1 技術(shù)方面

1.1 核酸提取

多年來，由于商業(yè)檢測的缺乏，方法學標準化受限，阻礙了曲霉PCR納入到EORTC/MSGERC定義的進程。EAPCRI/FPCRI的研究表明，曲霉檢測分子方法的性能有賴于核酸（NA）提取，以提供足夠高質(zhì)量的DNA，并盡可能去除抑制化合物。針對全血、血清和血漿標本的研究顯示合適的標本可為≥3 mL EDTA全血或≥0.5 mL血清/血漿且核酸洗脫體積＜100 μL。從血清/血漿標本中檢測循環(huán)游離DNA，在方法學上是非常簡單的，在大多數(shù)分子診斷實驗室中，都是使用核酸全自動提取平臺進行。與全血相比，血清中提取核酸特異度更高，但靈敏度較低。血漿樣本的靈敏度優(yōu)于血清，與全血相當，但特異度較低。若考慮呼吸道及其他送檢樣本中存在真菌，則需要機械破碎真菌細胞，從而保證有效的核酸提取。由于宿主免疫應(yīng)答或抗真菌治療的作用，呼吸道中可出現(xiàn)游離的真菌DNA，將BALF樣本離心后，使用核酸提取儀就可得到病原DNA和游離DNA片段?？紤]到某些BALF標本比較黏稠，在核酸提取之前，樣本需要進行液化處理。

1.2 PCR擴增

PCR擴增不是曲霉PCR成功的關(guān)鍵，使用不同的方法檢測相同的核酸濃度時，其檢測速度基本一致。但擴增多拷貝基因可提高PCR的分析靈敏度，如核糖體RNA基因簇[18S/28S rRNA和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）]。由于IA最常由煙曲霉引起，大多數(shù)檢測方法優(yōu)先檢測煙曲霉。然而，其他菌種也會引起曲霉病，因此曲霉屬檢測更有利，但可能存在其他菌屬（如青霉屬）的交叉污染。目前的曲霉PCR檢測試劑更適合檢測煙曲霉；PCR可在屬水平上針對rRNA基因進行檢測，這可提高非煙曲霉種的檢測性能。

實時定量PCR可在種水平上進行快速鑒定，并大大降低污染的可能性。其定量循環(huán)（quantification cycle, Cq） 與真菌載量成比例，可很好地解釋陽性結(jié)果。通常情況下，在檢測血液樣本時若Cq值＞35個循環(huán)，結(jié)果重復性不佳。進行復孔PCR擴增可提高低含量核酸樣本的檢測靈敏度。室內(nèi)質(zhì)控也至關(guān)重要。解釋低載量結(jié)果是否具有臨床意義是非常復雜的，可能是因為樣本與感染部位沒有直接聯(lián)系、病情不嚴重或沒有侵犯到血管等。如果Cq值大于35個循環(huán)是由于臨床和實驗室環(huán)境的污染而出現(xiàn)的假陽性，應(yīng)使用陰性對照監(jiān)測環(huán)節(jié)污染。商品化試劑盒通常提供陽性和陰性質(zhì)控品，可按照試劑盒規(guī)定方法進行質(zhì)控。

Cq閾值的設(shè)置至關(guān)重要。設(shè)置低的閾值可提高靈敏度，但會降低特異度。雖然從臨床早期診斷與治療需求的角度，不漏診真陽性病例更為重要，然而，EORTC/MSGERC指南的目的是明確分類標準，使臨床實踐具有高度確定性，因此對特異度要求高。最近關(guān)于血液曲霉PCR檢測文獻和薈萃分析的Cochrane系統(tǒng)綜述采納了新的EORTC/MSGERC標準（29項研究，34個數(shù)據(jù)集，4 718例患者，平均IA患病率為16.3%），綜述顯示，2個連續(xù)陽性的總靈敏度/總特異度為60%/95%，證實了目前的納入標準為2個陽性PCR結(jié)果。

BALF檢測通常用于診斷已出現(xiàn)臨床癥狀的高?；颊?，因此，這類檢測的特異性至關(guān)重要。薈萃分析說明，BALF曲霉PCR檢測的特異度高（94%～95%），陽性似然比高（＞12），適合確診感染，并被納入到當前的定義中。實時PCR陽性與Cq值相關(guān)，Cq值與樣本中的真菌載量成比例；這有助于設(shè)定閾值，以區(qū)分呼吸道樣本是感染、定植或污染。

商品化曲霉PCR檢測提供了質(zhì)量保證和技術(shù)一致性，包括提供質(zhì)控樣本，便于更多不具備真菌檢測標準設(shè)施的實驗室采用，但在性能方面并未表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。商業(yè)檢測不推薦特定的核酸提取方法。標準化的方法是將商業(yè)檢測與FPCRI建議的核酸提取方法相結(jié)合，以便于在各檢測中心推廣，實現(xiàn)方法學的統(tǒng)一。這種方法的一致性以及曲霉PCR檢測的外部質(zhì)控（分子診斷學的質(zhì)量控制）保證了檢測的穩(wěn)定運行。目前正在制定的曲霉PCR國際標準中，提出了使用國際曲霉DNA校準儀，從而實現(xiàn)多個檢測平臺使用同一質(zhì)控品。綜上所述，理想情況下，曲霉PCR檢測應(yīng)僅使用實時PCR平臺進行。

2 臨床應(yīng)用和性能

2.1 篩查與診斷

臨床醫(yī)師申請曲霉PCR檢測主要是為了診斷臨床診斷IA患者，或者篩查有發(fā)病風險的個體，以便早期診斷。篩查最適用于中到高風險的IA患者（如急性白血病或移植受者），因為患病率決定了檢測的效果。

薈萃分析綜述顯示，使用曲霉PCR篩查血液樣本的靈敏度為84%～88%，特異度為75%～76%。在最新的Cochrane綜述中，血液曲霉PCR檢測的統(tǒng)計數(shù)據(jù)與其類似（靈敏度為79%；特異度為80%）。

抗曲霉預(yù)防治療顯著降低了IA篩查陽性的概率，也導致了其特異度顯著降低（79%～64%），而靈敏度未顯著增加（75%～82%）。這與抗真菌治療對半乳甘露聚糖酶免疫分析（GM-EIA）的影響相矛盾，可能是因為預(yù)防法可以防止最初的感染加重；而抗真菌劑靶向細胞壁或細胞膜，導致核酸的釋放，造成曲霉DNA的持續(xù)存在甚至增加。預(yù)防治療的患者采取BALF曲霉PCR檢測，可實現(xiàn)突破性診斷。

在臨床診斷IA患者時，感染部位的樣本比血液樣本更有意義。在一項多中心回顧性分析中，BALF與血液樣本同時進行曲霉PCR檢測，BALF的PCR敏感度（63%）顯著高于血液樣本（8%）。此外，盡管75%的樣本是在抗真菌治療期間采集的，但這并沒有對BALF的檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。目前尚無直接比較篩查和診斷PCR方法性能的研究。然而，在同時使用PCR和GM-EIA定期篩查的IA病例中，73%的患者血液樣本的陽性結(jié)果平均比支氣管鏡檢查結(jié)果提前了11 d，所以前者更有利于早期診斷。

BALF曲霉PCR檢測的薈萃分析性能與GMEIA相當，靈敏度和特異度相似，范圍分別為76.8%～79.65%和93.7%～94.5%。曲霉PCR結(jié)合抗原檢測，性能最佳。在一項BALF檢測的研究中，PCR和GM（I＞1.0）相結(jié)合的靈敏度為100%，特異度為98%。商業(yè)Pathonostics AsperGenius檢測驗證了此方法：PCR與GM（I＞1.0）結(jié)合，靈敏度為96%，特異度為100%。這些發(fā)現(xiàn)為商業(yè)PCR和抗原檢測的聯(lián)合應(yīng)用提供了臨床支持。BALF抗原/PCR檢測薈萃分析的靈敏度為84%，特異度為94%。BALF的聯(lián)合檢測使靈敏度增加了5%～9%，特異度也足以診斷IA（陽性似然 比=14）。各種隨機對照試驗和前瞻性研究說明，血液樣本抗原/PCR聯(lián)合檢測有助于診斷IA。一項薈萃分析表明，如果兩項檢測均為陰性，靈敏度（99%）足以排除IA，而兩項檢測均為陽性時診斷特異度為98%。血液和BALF聯(lián)合檢測，特異度更高，當兩種檢測結(jié)果均為陽性時，可增強臨床診斷IA患者的信心。相反，如果兩種檢測結(jié)果均為陰性，就可排除疾病。這對于抗真菌管理策略的成功應(yīng)用至關(guān)重要。

最新的歐洲臨床微生物與感染性疾病學會/歐洲醫(yī)學真菌學聯(lián)盟/歐洲呼吸學會（ESCMID/ECMM/ERS）曲霉病管理指南在一定程度上支持對血液、BALF和腦脊液（CSF）樣本進行PCR檢測，進而診斷IA。BALFGM-EIA和PCR聯(lián)合檢測的應(yīng)用，使該建議更具說服力。2016年美國傳染病學會曲霉病指南建議，PCR應(yīng)在個體基礎(chǔ)上進行，但也要結(jié)合其他檢測和臨床情況。由于實時曲霉PCR檢測的發(fā)展，在治療過程中可使用該檢測作為評價預(yù)后的指標。然而，檢測血液樣本時，Cq值經(jīng)常延遲，患者通常在接受治療后立即轉(zhuǎn)陰，故只作為定性檢測。而BALF的PCR檢測陽性通常與Cq值有關(guān)，可用于療效監(jiān)測，但侵入性取樣的方式不適合進行預(yù)后評估。

2.2 在非中性粒細胞減少癥患者中的應(yīng)用

大多數(shù)關(guān)于曲霉生物標志物分析評估的數(shù)據(jù)是基于對中性粒細胞減少癥患者和造血干細胞移植（HSCT）患者的檢測。對非中性粒細胞減少癥患者進行的生物標志物檢測評估有限，但需求日益增長，因為重癥監(jiān)護病房（ICU）中出現(xiàn)IA的頻率明顯增加，包括2019冠狀病毒?。–OVID-19）患者。由于非中性粒細胞減少癥的IA患者很少侵犯血管，頻繁篩查血液樣本效果有限。非中性粒細胞減少癥患者曲霉感染局限于呼吸道（如流感感染后的曲霉氣管支氣管炎），臨床表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)；而中性粒細胞減少癥患者感染曲霉表現(xiàn)為組織梗死，因此目前首選PCR檢測進行診斷。然而，考慮到某些ICU中IA的發(fā)生率越來越高（流感后患者為19%，COVID-19后患者為33%），優(yōu)先選用篩查方法，即采用商業(yè)曲霉PCR檢測ICU患者的BALF樣本，其靈敏度為100%，特異度為99%～100%。有研究發(fā)現(xiàn)，在ICU患者中，對血液病和危重患者的BALF樣本進行Pathonostics AsperGenius檢測，其性能是相同的，靈敏度為80%，特異度為91%。

2.3 在兒科患者中的應(yīng)用

對兒童曲霉PCR進行性能評估的研究有限，尤其是對新生兒?，F(xiàn)有研究主要針對高危兒科患者（如白血病、移植和慢性肉芽腫性疾?。┣筆CR進行性能評估。由于一些研究囊括了確診/臨床診斷IA患者、使用了泛真菌PCR技術(shù)或病例分類標準不符合EORTC/MSGERC定義，總體臨床性能不穩(wěn)定，數(shù)據(jù)分析相當復雜。對于研究數(shù)據(jù)進行分析，總體靈敏度為82.3%，特異度為72.8%，這與最新的曲霉Cochrane綜述結(jié)果相當，說明曲霉PCR的診斷性能在成人和兒童之間沒有顯著差異。

由于研究數(shù)量有限，在兒科IA患者診斷和管理方面，近期沒有與PCR檢測相關(guān)的建議。對成人和兒童來說，曲霉PCR的性能相似。

3 發(fā)展前景和需求

由于不同的曲霉種類具有不同的抗真菌藥物敏感性，因此采用分子方法鑒別出不同的菌種具有意義。當前主要的PCR方法很少對非煙曲霉（如土曲霉）進行檢測。雖然在煙曲霉復合群中可能鑒別出非煙曲霉種，如Aspergillus lentulus，但大多數(shù)其他菌種不能檢測。最近幾種商品化檢測法（例 如Fungiplex Aspergillus，Bruker UK Limited，Glasgow，UK和AsperGenius，Pathonostics，Maastricht，Netherlands）可用于區(qū)分土曲霉和其他菌種。通過熔解曲線分析，AsperGenius檢測可以在煙曲霉復合群中鑒別出A.lentulus和Aspergillus felis，然而該檢測僅適用于從培養(yǎng)物中提取的DNA。在臨床標本的菌種鑒定方面，尚需更多的研究。

傳統(tǒng)藥敏試驗耗時長且可能因菌種生長不良而無法進行，PCR技術(shù)克服了傳統(tǒng)藥敏試驗的局限性，可用于鑒定耐藥真菌。煙曲霉單核苷酸多態(tài)性（SNP）或串聯(lián)重復序列與耐三唑類藥物相關(guān)，針對其最常見突變（TR34/L98H和TR46/Y121F/T289A）的 商 品 化 檢 測（Mycogenie, Ademtech, Pessac, France；Pathonostics AsperGenius） 現(xiàn) 已 問世。另一種檢測方法是在治療過程中使用分子方法檢測耐藥性。然而，由于血液中的核酸半衰期很短，BALF中的核酸不一定代表活動性感染，其應(yīng)用受到了限制。

由于基于PCR的DNA測序復雜費時，實時PCR憑借著快速的優(yōu)勢逐步替代了PCR測序，但可檢測的突變范圍縮小了。最新的實時PCR可檢測7種cyp51A突變，但尚未投入臨床使用。BALF樣本AsperGenius檢測的多中心評估顯示，突變的存在與治療失敗（75%對27%，P=0.01）和6周死亡率增加（50% 對19%，P=0.07）具有顯著相關(guān)性。AsperGenius檢測與直接從樣本中鑒定突變的PCR測序相比，PCR測序在性能上僅略顯優(yōu)勢?？焖俳沽姿釡y序方法能檢測越來越多的突變，并已直接應(yīng)用于臨床樣本。雖然可以直接檢測血液樣本來鑒定突變，但核酸量過低，不利于靶基因的成功擴增。

隨著二代測序（NGS）的迅猛發(fā)展，將來有望應(yīng)用NGS技術(shù)直接從臨床標本中檢測和鑒定真菌，在暴發(fā)期間實現(xiàn)菌種水平（甚至在真菌生物群內(nèi)）的鑒定，并確定抗真菌藥物敏感性和基因型。目前，在常規(guī)使用之前，仍有幾個限制因素，包括選定最佳的基因片段進行物種鑒定 （例如，ITS 1/2區(qū)域僅能區(qū)分75%的真菌種），同時保持所需分析的靈敏度（多拷貝與單拷貝基因），優(yōu)化從采樣到DNA提取、PCR擴增的整體檢測過程，以及解決NGS生物信息學工具和儀器匱乏的問題。鑒于使用分子方法研究呼吸道真菌菌群復雜性，由于某一共生/定植菌種/屬的大量存在，會干擾具有臨床意義的真菌的檢出，NGS方法還需進一步改進以避免漏診。數(shù)字液滴曲霉PCR可定量檢測真菌，且靈敏度更高，這一技術(shù)的進步令人振奮。

4 結(jié)論

現(xiàn)已收集了大量曲霉PCR檢測的數(shù)據(jù)，以支持其應(yīng)用于臨床和科研。隨著分子技術(shù)的不斷進步及臨床需求的亟待解決，分子技術(shù)的進一步發(fā)展將改善其在臨床篩查、診斷和治療方案選擇中的應(yīng)用。