基于mRNA-LNP的腫瘤免疫療法

曹學(xué)智，彭華，傅陽心（1.生物島實驗室，廣東 廣州 510005；2.廣州實驗室，廣東 廣州 510005；3.中國科學(xué)院 生物物理研究所，北京 100101；.清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，北京 10008）

免疫系統(tǒng)識別、殺傷腫瘤細(xì)胞的功能是有效的免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI）治療的理論基礎(chǔ)。由于對自身抗原的耐受機制的存在，針對腫瘤相關(guān)抗原的疫苗在很大程度上是無效的[1]。腫瘤細(xì)胞還表達(dá)由突變引起的腫瘤特異性抗原，然后通過主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ類或Ⅱ類分子展示給T細(xì)胞。這些腫瘤特異性T 細(xì)胞則成為了現(xiàn)代腫瘤免疫療法的基礎(chǔ)[2]。新抗原腫瘤疫苗則成為腫瘤治療的前沿?zé)狳c[3]。然而，鑒定免疫原性新表位以及有效安全地遞送亞單位疫苗成分以引發(fā)有效和強大的抗癌T 細(xì)胞反應(yīng)仍然存在重大挑戰(zhàn)[4]。mRNA 是一種新興的引人矚目的腫瘤疫苗形式，以時空同步的方式提供抗原遞送和固有免疫激活介導(dǎo)的共刺激。脂質(zhì)納米顆粒（lipid nanoparticle，LNP）制劑保護(hù)mRNA 免受細(xì)胞外RNases的影響，并改善抗原提呈細(xì)胞在體內(nèi)的攝取。新冠病毒病（cornoa virus disease 2019,COVID-19）大流行的全球威脅極大地促進(jìn)了快速反應(yīng)疫苗的開發(fā)，基于mRNA的治療方法能夠同時解決穩(wěn)定性、遞送和免疫原性等幾個技術(shù)障礙，被證明可以獲得快速開發(fā)，并且符合GMP的制造工藝，易于升級和快速獲得大批量成藥產(chǎn)品[5-6]。mRNA用于腫瘤免疫療法將不僅僅限于腫瘤疫苗，mRNA也將向雙特異性抗體、細(xì)胞因子、共刺激配體和受體，以及CAR-T細(xì)胞治療等腫瘤免疫療法提供新的策略并產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。

1 mRNA-LNP合成技術(shù)的發(fā)展

由線性DNA模板通過體外轉(zhuǎn)錄生成的合成mRNA，類似于天然存在的加工成熟mRNA 分子，包含5'帽結(jié)構(gòu)、5'非翻譯區(qū)域、編碼區(qū)、3'非翻譯區(qū)域和3' poly(A)尾巴。人工合成的mRNA不進(jìn)入細(xì)胞核，也不整合到基因組中，mRNA 只出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中并進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯。來自合成mRNA 與從細(xì)胞內(nèi)源mRNA 翻譯的蛋白質(zhì)無法區(qū)分，該蛋白質(zhì)經(jīng)過翻譯后修飾，并通過靶向序列或穿膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)入亞細(xì)胞器中，例如分泌路徑、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、線粒體或過氧化物酶體等。同時，蛋白質(zhì)降解后形成的表位短肽提呈在MHC復(fù)合物上[7]。

長期以來，人們認(rèn)為裸露的mRNA 對于藥物應(yīng)用不夠穩(wěn)定，因為其容易被普遍存在的RNase 快速降解，并且不能被抗原提呈細(xì)胞有效地內(nèi)化。在翻譯成蛋白質(zhì)的同時，外源mRNA 還具有內(nèi)在免疫活化功能，可激活Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）中的TLR3、TLR7和TLR8，或視黃酸誘導(dǎo)基因1和黑色素瘤分化相關(guān)蛋白5 下游干擾素（IFN）相關(guān)通路，從而觸發(fā)固有免疫。盡管這種內(nèi)在的免疫刺激活性可以起到佐劑樣作用以增強免疫反應(yīng)，但不幸的是免疫活化可能同時促進(jìn)mRNA 降解，降低了抗原表達(dá)[8]。輝瑞公司和拜恩泰科公司（BioNTech）開發(fā)的BNT162b2 mRNA疫苗是美國食品和藥物管理局（FDA）歷史上第一個批準(zhǔn)的mRNA 疫苗。Ⅲ期臨床試驗結(jié)果[6,9]表明，mRNA疫苗對預(yù)防COVID-19有95%的有效性。盡管BNT162b2 mRNA疫苗取得了成功，但作為其效應(yīng)基礎(chǔ)的免疫機制卻沒有被研究清楚。而最近的一項研究[10]則揭示了這一謎團(tuán)。該研究分析了在小鼠中接種BNT162b2疫苗后的固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)疫苗免疫刺激了強勁的抗體和抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)，并在二次免疫后顯著增強了固有免疫反應(yīng)，二次免疫1 d后血清IFN-γ水平升高，而引流淋巴結(jié)中的NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞是這種循環(huán)IFN-γ的主要產(chǎn)生者。對敲除TLR2～5、7基因的小鼠的分析表明，對BNT162b2 的抗體和T 細(xì)胞反應(yīng)的誘導(dǎo)不依賴于TLR2、TLR3和TLR4、TLR5和TLR7信號通路，也不依賴于炎癥小體激活及壞死性凋亡或細(xì)胞焦亡等細(xì)胞死亡途徑。相反，由BNT162b2 誘導(dǎo)的CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)依賴于Ⅰ型IFN依賴的黑色素瘤分化相關(guān)蛋白5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

在過去的30 年中，人們在提高合成mRNA 細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性、翻譯效率和攝取方面做出了廣泛的努力。這些優(yōu)化措施包括：5'帽的修飾，如最廣泛使用的體外轉(zhuǎn)錄后牛痘加帽系統(tǒng)[11]，抗反向帽類似物（antireverse cap analog，ARCA）[12]，新一代CleanCapTM共轉(zhuǎn)錄帽類似物[13]；3'非翻譯區(qū)域的優(yōu)化，如人類的α-球蛋白和β-球蛋白含有翻譯和穩(wěn)定性調(diào)節(jié)元件，通常用作合成mRNA 的3'非翻譯區(qū)域[14]；3'poly(A)尾修飾[15-16]和核苷酸的修飾，如用假尿苷（Ψ）、1-甲基假尿苷（1mΨ）和5-甲基胞苷（m5C）替代天然尿苷和胞苷，可以顯著降低固有免疫的激活并增加mRNA的翻譯能力[17-19]；高效的mRNA 遞送系統(tǒng)，如基于膽固醇、可離子化和輔助脂質(zhì)及PEG 衍生物的復(fù)合物的LNP[20]。最新的研究[21]報告了一種穩(wěn)定性很高的環(huán)狀RNA（circular RNA,circRNA）疫苗。circRNA缺乏翻譯成蛋白質(zhì)所必要的元件5'帽，但是可以通過引入內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點（internal ribosome entry site，IRES）以實現(xiàn)蛋白質(zhì)翻譯。與現(xiàn)在廣泛使用1mΨ 修飾的新冠mRNA 疫苗相比，circRNA 疫苗沒有使用核苷酸修飾就能夠產(chǎn)生更高水平和更持久時間的抗原，并引發(fā)更高比例的中和抗體和明顯的Th1偏向的免疫反應(yīng)。目前的研究數(shù)據(jù)表明，circRNA具有十分良好的應(yīng)用前景。這些策略提高了合成mRNA翻譯效率，并克服了其固有免疫原性，極大地推進(jìn)了mRNA技術(shù)的發(fā)展。

2 基于mRNA-LNP個性化的腫瘤疫苗

新抗原僅存在于腫瘤細(xì)胞中，因此不存在中樞耐受性和自身免疫問題。這種腫瘤特異性抗原可以來源于病毒蛋白和體細(xì)胞突變[22]。即使是同一類型的腫瘤，也會因每個人的具體情況而有很大差異，而基于患者腫瘤活檢樣本測序分析確定的突變組為腫瘤患者提供了個體化腫瘤疫苗的方案[23-24]。

2.1 mRNA-4157

莫德納（Moderna）公司和默克（Merck）公司合作研發(fā)的LNP 包裹的mRNA 的個性化腫瘤疫苗mRNA-4157，編碼含有每個患者特定腫瘤中存在的獨特突變的肽（新抗原）。當(dāng)注入體內(nèi)時，mRNA 會指導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生和表達(dá)這些新抗原，后者反過來又會激活免疫系統(tǒng)以更好地識別和破壞癌細(xì)胞。mRNA-4157 作為單藥治療實體瘤切除患者（A部分）或與默克公司的抗PD-1派姆單抗（pembrolizumab）聯(lián)合用藥臨床試驗，分析治療晚期/轉(zhuǎn)移性實體瘤患者（B部分）的安全性和有效性。A、B部分中選定的實體瘤包括黑色素瘤、膀胱癌、人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）陰性頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性高或腫瘤突變負(fù)荷高的腫瘤。擴展的研究對象包括：未接受ICI治療的微衛(wèi)星穩(wěn)定性結(jié)直腸癌、HPV 陰性頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（C 部分）和黑色素瘤切除（D部分）的患者。其中，79例患者接受mRNA-4157 治療，其中16 例接受單一療法、63 例接受與派姆單抗的聯(lián)合治療。分析結(jié)果顯示，僅存在低級別和可逆治療相關(guān)的不良反應(yīng)。14/16 A 部分患者在研究中保持無病狀態(tài)，B 部分的28 例患者、C 部分的27例患者和D部分的8例患者接受聯(lián)合治療，觀察到3 例完全緩解（CR）和8 例部分緩解（PR）病例。在10 例未接受ICI 的HPV 陰性頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者中，客觀緩解率（ORR）為50%，中位無進(jìn)展生存期（mPFS）為9.8個月，顯著高于派姆單抗單藥治療組的ORR（14.6%）和mPFS（2個月），結(jié)果表明，mRNA-4157與派姆單抗聯(lián)合使用時具有可接受的安全性以及顯著提高的臨床反應(yīng)率[25-26]。目前，該項研究正處于Ⅱ期臨床試驗（NCT03313778）階段。

2.2 RO7198457

另一個研究領(lǐng)先的mRNA個性化腫瘤疫苗是由拜恩泰科（BioNTech）公司開發(fā)的RO7198457，包含多達(dá)20個腫瘤特異性新表位，旨在刺激T 細(xì)胞對新抗原的反應(yīng)。拜恩泰科公司和羅氏（Roche）公司合作，在人體Ⅰb期研究中，RO7198457與羅氏公司的PD-L1單抗阿特朱單抗（atezolizumab）首次在晚期或轉(zhuǎn)移性實體瘤患者中進(jìn)行研究?？偣灿?32例患者參加了聯(lián)合治療，最常見的腫瘤類型是非小細(xì)胞肺癌、三陰性乳腺癌、黑色素瘤和結(jié)直腸癌，結(jié)果顯示，RO7198457與阿特朱單抗聯(lián)用具有可控的安全性，與研究藥物的作用機制一致，并誘導(dǎo)顯著高水平的新抗原特異性免疫反應(yīng)。在接受至少1次腫瘤評估的108例患者中，9例緩解，包括1例CR，ORR僅為8%[27]。在評估結(jié)果后，這兩家公司開始一項開放的Ⅱ期臨床試驗，對201例切除腫瘤的晚期直腸癌患者進(jìn)行試驗。

3 基于mRNA-LNP 的雙特異性T 細(xì)胞激動劑（bispecific T-cell engager，BiTE）

單克隆抗體是抗腫瘤中早已建立的治療方式，用于靶向腫瘤細(xì)胞和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞反應(yīng)。BiTE是一類人工雙特異性單克隆抗體，分子量約55 000 的單肽融合蛋白，由不同抗體的兩個單鏈可變片段（single-chain variable fragment，ScFv）組 成。與普通的單克隆抗體不同，BiTE 的一個ScFv 通過CD3 受體與T 細(xì)胞結(jié)合；另一個通過腫瘤特異性分子與腫瘤細(xì)胞結(jié)合形成了T 細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的聯(lián)系，導(dǎo)致T細(xì)胞通過產(chǎn)生穿孔素和顆粒酶等蛋白質(zhì)對腫瘤細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒活性[28]。一個成功的例子是博納吐單抗（blinatumomab）[29]，是一種CD19×CD3 形式的BiTE，可將T 細(xì)胞與淋巴瘤細(xì)胞共同聚集，有效發(fā)揮T細(xì)胞的殺傷活性[30]，并被批準(zhǔn)用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病[31-32]。BiTE 的小分子量允許有效穿透腫瘤組織，但生產(chǎn)制造方面的挑戰(zhàn)和血清半衰期短阻礙了該藥物分子的應(yīng)用潛力。然而，這些缺點可以通過使用工程化的mRNA 在患者體內(nèi)產(chǎn)生BiTE 來規(guī)避。在小鼠腫瘤模型中，利用mRNA-LNP 遞送緊密連接蛋白claudin 6 和T 細(xì)胞受體（TCR）相關(guān)分子CD3的BiTE。數(shù)據(jù)表明，低劑量mRNA-LNP 會持續(xù)編碼產(chǎn)生治療水平的claudin 6×CD3形式的BiTE，其半衰期在天然產(chǎn)生的免疫球蛋白范圍內(nèi)。在移植人類外周血單個核細(xì)胞（PBMC）的NSG 小鼠中未檢測到促炎細(xì)胞因子的釋放，表明沒有非特異性T 細(xì)胞激活，也沒有證據(jù)表明肝毒性的存在。重復(fù)使用mRNA-LNP是可行的，并產(chǎn)生可重復(fù)的BiTE蛋白的藥理學(xué)效應(yīng)，為臨床適用的給藥方案的開發(fā)提供了良好的基礎(chǔ)[33]。

4 基于mRNA-LNP的細(xì)胞因子/共刺激因子療法

重組刺激性細(xì)胞因子是一種經(jīng)過臨床前驗證的治療概念，但其臨床開發(fā)受到嚴(yán)重毒性的阻礙。如高劑量IL-2和IFN-α 的低緩解率和高毒性使這些細(xì)胞因子的臨床應(yīng)用傾向于被靶向治療和ICI 所取代[34]。T 細(xì)胞的激活需要抗原提呈細(xì)胞傳遞的共刺激信號。如果沒有共同刺激，T 細(xì)胞要么死亡，要么變得無反應(yīng)[35]。而針對腫瘤微環(huán)境中的共刺激分子的激動劑抗體療法是高度通用的，使其成為腫瘤免疫治療的理想候選藥物分子[36]。但和細(xì)胞因子相似，毒性作用也阻礙其臨床轉(zhuǎn)化。例如，腫瘤壞死因子（TNF）受體超家族成員4-1BB激動抗體的肝毒性就是一個嚴(yán)重問題[37]。

基于mRNA-LNP 的細(xì)胞因子/共刺激因子療法似乎至少可以通過以下兩種方式降低其毒性：（1）腫瘤內(nèi)局部注射mRNA-LNP，讓細(xì)胞因子集中表達(dá)在腫瘤內(nèi)；（2）靜脈內(nèi)給予mRNA-LNP，讓細(xì)胞因子集中表達(dá)在肝內(nèi)，用于肝癌的治療。但前者的未來應(yīng)用前景更加廣闊。腫瘤內(nèi)的免疫學(xué)研究專注于驅(qū)動強大的、特異性的抗腫瘤T 細(xì)胞反應(yīng)，將具有免疫抑制微環(huán)境的“冷”腫瘤轉(zhuǎn)化為免疫活化的“熱”腫瘤，從而產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。其目標(biāo)是發(fā)現(xiàn)和開發(fā)腫瘤內(nèi)局部給藥介導(dǎo)的免疫療法，以提供編碼有效免疫刺激蛋白的mRNA。這些蛋白可以作用于注射的腫瘤部位，降低全身毒性，并可能在遠(yuǎn)端產(chǎn)生“異位效應(yīng)”使腫瘤部位也受到影響。

4.1 單個細(xì)胞因子/共刺激因子mRNA-LNP療法

4.1.1 IL-12 IL-12是Th1免疫的有效介質(zhì)，在小鼠腫瘤模型中發(fā)揮顯著的抗腫瘤活性。但在人類中IL-12 全身給藥后會導(dǎo)致潛在致命毒性[38-39]。然而，通過mRNA-LNP 直接將IL-12 遞送到腫瘤中，腫瘤內(nèi)的細(xì)胞可能會在局部微環(huán)境中高表達(dá)IL-12，使得以前將IL-12 蛋白遞送到血液中產(chǎn)生的全身不良反應(yīng)更容易得到控制。通過腫瘤內(nèi)局部表達(dá)IL-12，可能導(dǎo)致T細(xì)胞對腫瘤的強烈攻擊，并產(chǎn)生新的腫瘤特異性T 細(xì)胞，進(jìn)入血液淋巴循環(huán)，在轉(zhuǎn)移性腫瘤中引發(fā)“異位效應(yīng)”，腫瘤局部注射不僅使該腫瘤縮小，還會引起身體其他部位的腫瘤縮小。

由莫德納公司和阿斯利康（AstraZeneca）公司合作開發(fā)的LNP 包裹mRNA 的單鏈IL-12（scIL-12）瘤內(nèi)免疫療法，通過腫瘤內(nèi)局部注射的mRNA-LNP 來遞送編碼由p35 和p40 亞基組成的scIL-12，使之在腫瘤局部得以表達(dá)。在小鼠腫瘤模型中，單次瘤內(nèi)注射可致使腫瘤消退，并且腫瘤完全消退的動物表現(xiàn)出對再次腫瘤接種的免疫力，同時也導(dǎo)致未經(jīng)注射的遠(yuǎn)端腫瘤的消退，而這些抗腫瘤作用依賴于IFN-γ和CD8+T細(xì)胞。重要的是，編碼膜連接的scIL-12的mRNA 的瘤內(nèi)遞送也推動了未注射病變的排斥反應(yīng)，這支持了局部IL-12 可以誘導(dǎo)針對遠(yuǎn)端病變的全身性抗腫瘤免疫反應(yīng)的假設(shè)[40]。在相應(yīng)的Ⅰ期臨床試驗中，人類scIL-12-LNP（MEDI1191）正在以瘤內(nèi)給藥的方式進(jìn)行單一療法或與阿斯利康公司的抗PD-L1 單抗德瓦魯單抗（durvalumab）聯(lián)合使用對87例實體瘤患者的療效評估正在進(jìn)行中（NCT03946800）[41]。

在另一項研究中，scIL-12 mRNA-LNP 靜脈內(nèi)給藥治療MYC致癌基因驅(qū)動的肝細(xì)胞癌小鼠，含有報告基因mRNA 的LNP 表明，翻譯的蛋白質(zhì)僅限于腫瘤以及肝和脾的非惡性區(qū)域。scIL-12 mRNA-LNP靜脈內(nèi)給藥可縮小肝腫瘤并延長生存期，而無明顯的肝毒性。重要的是，scIL-12 mRNA-LNP對轉(zhuǎn)MYC基因水平?jīng)]有影響，證實其治療功效與驅(qū)動癌基因的下調(diào)無關(guān)，但引起活化的CD44+CD3+CD4+Th 細(xì)胞顯著浸潤到腫瘤組織中，并增加IFN-γ的分泌[42]。

4.1.2 OX40L 最佳的T 細(xì)胞反應(yīng)需要TCR 激活和共刺激信號。OX40 共刺激分子是TNF 受體家族成員之一，OX40L 與OX40 結(jié)合可促進(jìn)CD4+和CD8+T 細(xì)胞擴增，增強記憶反應(yīng)并抑制Treg 細(xì)胞功能[43]。莫德納公司研發(fā)的mRNA-2416是一種基于mRNA的LNP治療劑，可表達(dá)野生型人源OX40L。mRNA-2416正單獨或與阿斯利康公司的抗PD-L1 單抗德瓦魯單抗聯(lián)合，對117例晚期、復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性實體瘤或淋巴瘤患者瘤內(nèi)注射的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗（NCT03323398）正在進(jìn)行中。目前的單一療法結(jié)果表明，腫瘤內(nèi)注射各種劑量的mRNA-2416都是可耐受的，并且腫瘤治療后的結(jié)果分析表明，OX40L蛋白表達(dá)增加、PD-L1水平升高和促炎因子活性增強。結(jié)合對PD-L1 阻斷的臨床前體內(nèi)協(xié)同作用的觀察，這些數(shù)據(jù)支持腫瘤內(nèi)注射mRNA-2416與抗PD-L1單抗德瓦魯單抗在實體瘤治療中的良好療效的評估[44]。

4.2 聯(lián)合細(xì)胞因子/共刺激因子mRNA-LNP療法

4.2.1 IL-23/IL-36γ/OX40L 各種mRNA 可以很容易地混合并配制為單一藥物產(chǎn)品，這種技術(shù)特性促進(jìn)了細(xì)胞因子mRNA聯(lián)合療法的發(fā)展。IL-23促進(jìn)炎癥，協(xié)調(diào)免疫系統(tǒng)對外來入侵者（如細(xì)菌和病毒）的反應(yīng)；IL-36γ感知病原體誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，是上皮組織內(nèi)免疫反應(yīng)和病毒性炎癥的關(guān)鍵啟動器。在小鼠腫瘤模型中，這三者組合形成的IL-23/IL-36γ/OX40L三聯(lián)體mRNA-LNP（mRNA-2752）觸發(fā)大量免疫細(xì)胞募集到腫瘤中，無論先前的腫瘤免疫浸潤如何，都能有效地破壞腫瘤。IL-23/IL-36γ/OX40L 三聯(lián)體mRNA-2752 治療可誘導(dǎo)下游細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)，并且還激活多種類型的DC和T細(xì)胞，該治療效果取決于Batf3 依賴性交叉提呈DC 和細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞[45]。在相應(yīng)的Ⅰ期臨床試驗[46-47]中，人類IL-23/IL-36γ/OX40L 三聯(lián)體mRNA-2752 作為單一療法或與阿斯利康公司的抗PD-L1單抗德瓦魯單抗聯(lián)合，用于可觸及到的腫瘤的患者或者通過圖像引導(dǎo)后能到達(dá)腫瘤的患者，該研究正在對264例患者中進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗（NCT03739931）,結(jié)果表明，mRNA-2752 作為單一療法或與德瓦魯單抗聯(lián)合使用，患者對所有劑量水平都是可耐受的，可引起腫瘤縮小。對腫瘤和血清生物標(biāo)志物的分析結(jié)果表明，治療具有持續(xù)的免疫調(diào)節(jié)作用，包括升高的IFN-γ、TNF-α和PD-L1水平。該研究正在擴展招募三陰性乳腺癌、膀胱尿路上皮癌、淋巴瘤、免疫檢查點難治性黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌的患者。

4.2.2 四聯(lián)細(xì)胞因子mRNA（scIL-12/IFN-α/GM-CSF/IL-15 sushi）scIL-12/IFN-α/GM-CSF/IL-15 sushi是由賽諾菲（Sanofi）公司研發(fā)的四聯(lián)細(xì)胞因子mRNA局部免疫治療制劑。在小鼠腫瘤模型中，該四聯(lián)細(xì)胞因子mRNA 單獨使用或與抗PD-1 單抗聯(lián)合使用，跨越12 個同基因小鼠腫瘤模型，代表不同范圍的小鼠腫瘤類型。用四聯(lián)細(xì)胞因子mRNA 進(jìn)行單藥治療后，在12個腫瘤模型中的8個中產(chǎn)生了顯著的抗腫瘤反應(yīng)。將四聯(lián)細(xì)胞因子mRNA 與全身性抗PD-1 免疫療法相結(jié)合，進(jìn)一步改善了抗腫瘤反應(yīng)，并在另外兩種對單藥治療無反應(yīng)的模型中抑制了腫瘤生長。局部四聯(lián)細(xì)胞因子mRNA 免疫療法與ICI 的聯(lián)合，治療結(jié)果展現(xiàn)出對代表不同小鼠腫瘤類型的一系列臨床前腫瘤模型中抗腫瘤活性的增強。目前，人四聯(lián)細(xì)胞因子mRNA scIL-12/IFN-α/GM-CSF/15 sushi（SAR441000）單獨或與賽諾菲公司的抗PD-1 單抗西米普利單抗（cemiplimab）聯(lián)合，對231例轉(zhuǎn)移性腫瘤患者Ⅰ期臨床試驗（NCT03871348）[48]正在進(jìn)行中。

5 基于mRNA-LNP的CAR-T細(xì)胞療法

CAR-T細(xì)胞療法是革命性里程碑，因為它產(chǎn)生了非常有效和持久的臨床反應(yīng)[49]。CAR 與細(xì)胞表面表達(dá)的靶抗原的結(jié)合獨立于MHC受體，導(dǎo)致T細(xì)胞強烈活化和強大的抗腫瘤反應(yīng)[50]。CD19 靶向的CAR-T 細(xì)胞是最先進(jìn)的，有超過80%的緩解率（一半為CR），一些產(chǎn)品已獲得批準(zhǔn)用于治療B 細(xì)胞白血病和淋巴瘤[51-52]。通常應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒技術(shù)來改造抗原受體表達(dá)細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAR-T 細(xì)胞非常有效，其功效與其持續(xù)存在的能力有關(guān)。與病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)相比，mRNA-LNP 的瞬時表達(dá)不會造成轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的基因組整合和惡性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險。而且mRNA-LNP轉(zhuǎn)染可以向淋巴細(xì)胞同時遞送多種mRNA-LNP，例如免疫刺激細(xì)胞因子[53]、趨化因子受體[54-55]，或Cas9 介導(dǎo)的基因組編輯[56]等。但是mRNA-LNP 轉(zhuǎn)染導(dǎo)致的CAR 在T細(xì)胞表面表達(dá)只能短時間維持，這使得基于mRNA-LNP的CAR-T細(xì)胞療法在臨床應(yīng)用面臨挑戰(zhàn)，因為清除腫瘤需要足夠的時間。

最近的一項關(guān)于治療心肌纖維化的研究意外地在基于mRNA-LNP 的CAR-T 細(xì)胞療法開辟了一條全新的道路。CD5 在淋巴細(xì)胞前體、成熟T 細(xì)胞和成熟B細(xì)胞亞群（B1a 細(xì)胞）上組成型表達(dá)[57]。該研究開發(fā)了一種治療方法，無需在體外獲取小鼠的T細(xì)胞再轉(zhuǎn)染，而是直接通過靶向CD5 的mRNA-LNP 注射到心力衰竭小鼠模型中，在體內(nèi)T 細(xì)胞中遞送CAR mRNA 產(chǎn)生瞬時抗纖維化的CAR-T細(xì)胞，以此來評估這些在動物體內(nèi)重編程的CAR-T細(xì)胞的功效。研究結(jié)果表明，可以觀察到編碼CAR的mRNA向T細(xì)胞的有效遞送，使在體內(nèi)產(chǎn)生了瞬時、有效的CAR-T 細(xì)胞。用CD5 靶向的mRNA-LNP 治療可減少纖維化并恢復(fù)損傷的心功能。體內(nèi)生成CAR-T 細(xì)胞的技術(shù)有望成為治療腫瘤及其他各種疾病的治療平臺[58]。

6 結(jié)語

在COVID-19大流行發(fā)生后不到一年的時間里，針對COVID-19的mRNA疫苗的開發(fā)和授權(quán)展示了mRNA-LNP技術(shù)的巨大應(yīng)用潛力。這種對大流行的快速反應(yīng)是利用了幾十年來所探索的用于治療性腫瘤疫苗開發(fā)的mRNA-LNP技術(shù)的豐富經(jīng)驗。反之，在將mRNA首次從疫苗研發(fā)推向商業(yè)產(chǎn)品的過程中所獲得的經(jīng)驗，將反饋到mRNA-LNP 技術(shù)在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用。mRNA-LNP技術(shù)具有以下優(yōu)勢：（1）mRNA是非整合的，可降解性強，無插入突變風(fēng)險，且不含細(xì)胞和致病性病毒成分，沒有感染的可能性；（2）mRNA本身可激活固有免疫反應(yīng)以增強適應(yīng)性免疫反應(yīng)，具備自我佐劑特點；（3）mRNA可同時編碼多種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可以是不同抗原的組合，也可以是不同藥物的組合，打開了多聯(lián)疫苗或聯(lián)合用藥的大門；（4）mRNA生產(chǎn)周期短、速度快、規(guī)模大、成本低。mRNA-LNP技術(shù)功能的多樣性和靈活性，使其很容易擴展到個性化腫瘤疫苗之中，例如雙特異性抗體、細(xì)胞因子、共刺激配體和受體，以及CAR-T細(xì)胞治療等腫瘤免疫療法，mRNA-LNP雙特異性抗體可以克服生產(chǎn)制造方面的挑戰(zhàn)和血清半衰期短的缺點,腫瘤內(nèi)注射編碼細(xì)胞因子和共刺激因子的mRNA-LNP證明了其具有抗腫瘤免疫活性的同時避免了由于脫靶作用導(dǎo)致的藥物毒性。mRNA-LNP CAR-T 細(xì)胞有可能提高CAR-T細(xì)胞治療的安全性。由于上述的優(yōu)勢，基于mRNA-LNP的腫瘤免疫治療已成功進(jìn)入臨床試驗。雖然mRNA-LNP技術(shù)在較短的時間內(nèi)已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但其技術(shù)還有不完善的方面：一是目前的mRNA-LNP配方難以實現(xiàn)熱穩(wěn)定性，對儲藏運輸條件較為苛刻；二是由于LNP的雜質(zhì)，可能存在嚴(yán)重的不良反應(yīng)。隨著mRNA-LNP技術(shù)的不斷進(jìn)步與革新，相信這些缺點會得到改善甚至完全被克服?？傊?，mRNA-LNP是一個功能強大、用途廣泛的疫苗和藥物開發(fā)平臺，有望成為未來腫瘤疫苗和藥物開發(fā)的主要支柱之一。mRNA-LNP成功地向臨床轉(zhuǎn)化，為腫瘤免疫治療注入了新的活力，將顯著增強抗腫瘤的能力。