播散腫瘤細(xì)胞的休眠與存活機(jī)制及其在防治實(shí)體瘤轉(zhuǎn)移中的作用

闕祖俊，席志超，徐宏喜，田建輝

0 引言

癌癥是全球第二大疾病死因，每年約有1 000萬人死于癌癥[1]。盡管在癌癥的診斷和治療方面已經(jīng)取得了長足的進(jìn)展，但是癌癥的轉(zhuǎn)移問題仍然沒有得到解決，大約90%的癌癥患者死于轉(zhuǎn)移性疾病進(jìn)展[2]。因此，闡明與癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機(jī)制有助于改善轉(zhuǎn)移性疾病患者的治療效果。

隨著早期診斷技術(shù)的快速發(fā)展和早期篩查如PET-CT在臨床上的推廣與應(yīng)用，促使早期癌癥確診患者的比例逐年升高[3]。為防止轉(zhuǎn)移，這些患者常規(guī)進(jìn)行根治性手術(shù)，以獲得最佳的疾病控制。然而，仍約有40%的患者在術(shù)后會發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，且這些患者的5年生存率約為60%（肺癌）[1]。大量臨床研究表明，現(xiàn)有的治療手段對于肺癌早期術(shù)后患者的遠(yuǎn)期療效往往獲益有限[4-5]。一個重要原因是患者在臨床確診前腫瘤細(xì)胞的播散已經(jīng)發(fā)生[6]，在部分患者的外周血、骨髓和淋巴結(jié)中均可檢測到腫瘤細(xì)胞[7]，提示遠(yuǎn)處靶器官中也可能已經(jīng)存在播散的腫瘤細(xì)胞，只是受限于現(xiàn)有臨床檢查技術(shù)而無法在活體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，故阻斷原發(fā)性腫瘤擴(kuò)散的轉(zhuǎn)移防治臨床研究均未獲得滿意療效，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）抑制劑、Cilengitide（靶向血管生成）、Dasatinib（靶向SRC）和Saracatinib（靶向BCR-ABL1）等抗轉(zhuǎn)移藥物[8-10]。

播散腫瘤細(xì)胞（disseminated tumor cells,DTCs）是指從原發(fā)灶脫落，在血管或淋巴管中循環(huán)的腫瘤細(xì)胞到達(dá)遠(yuǎn)處靶器官后，定植、存活下來的腫瘤細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)DTCs在化療和分子靶向治療后仍能存活，并以休眠的狀態(tài)長期潛伏在患者體內(nèi)[11]。當(dāng)這些DTCs從休眠激活為增殖狀態(tài)，并增殖至影像學(xué)可檢出的腫瘤病灶，此時才是臨床上判斷轉(zhuǎn)移是否發(fā)生、確定患者臨床分期和治療方案的標(biāo)準(zhǔn)。然而目前臨床上仍缺乏針對休眠DTCs形成轉(zhuǎn)移灶這一階段的有效治療方案。因此，揭示DTCs的休眠與存活機(jī)制，并以DTCs作為轉(zhuǎn)移干預(yù)的重要靶點(diǎn)，將有望改善腫瘤轉(zhuǎn)移防治的療效。本文就DTCs的休眠與存活機(jī)制及其干預(yù)策略的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 靶器官中DTCs的休眠與存活機(jī)制

外周血中的腫瘤細(xì)胞外滲侵入遠(yuǎn)處靶器官后，由于受到微環(huán)境、免疫監(jiān)視、血管生成等因素的影響，其中大部分的DTCs會發(fā)生凋亡，僅有部分DTCs得以存活[12]。在靶器官中存活下來的DTCs可能立即生長為明顯的轉(zhuǎn)移灶，或以休眠、低增殖的形式潛伏在患者體內(nèi)[7]。目前尚無法確定遠(yuǎn)處靶器官（骨髓除外）中DTCs的休眠或增殖狀態(tài)，僅可通過檢測骨髓中的DTCs的休眠或增殖狀態(tài)來推測遠(yuǎn)處靶器官中的DTCs的休眠或增殖狀態(tài)。由于DTCs所處的微環(huán)境不同，其增殖狀態(tài)也存在很大的差異。Harper等研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞早期播散到遠(yuǎn)處靶器官骨髓和肺臟后，經(jīng)過一段時間的休眠，在肺部發(fā)現(xiàn)的DTCs增殖后形成轉(zhuǎn)移性腫瘤，而在骨髓中檢測到的DTCs在整個實(shí)驗(yàn)期間仍保持休眠狀態(tài)[13]。此外，有證據(jù)表明休眠的DTCs對常規(guī)療法（化療、靶向治療等）具有抵抗力，且低表達(dá)腫瘤相關(guān)或特異性抗原、NK細(xì)胞活化配體等，從而有利于其逃避免疫系統(tǒng)的識別和殺傷[11]。因此，DTCs的休眠對于其在靶器官中定植和存活具有重要意義。

1.1 靶器官中DTCs的休眠機(jī)制

靶器官中DTCs的休眠是為了適應(yīng)新的微環(huán)境，細(xì)胞經(jīng)過一系列分子調(diào)控而進(jìn)入可逆性的周期阻滯狀態(tài)，為靜止期腫瘤細(xì)胞（quiescent cancer cells,QCCs）的一種。微環(huán)境對DTCs休眠的影響主要通過整合素信號通路。研究發(fā)現(xiàn)整合素β1在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞休眠中起著重要作用，下調(diào)整合素β1的表達(dá)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞由增殖狀態(tài)向靜止期狀態(tài)轉(zhuǎn)變[14]。與此同時，DTCs的休眠還受到細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的調(diào)控，其主要通過抑制Wnt和Notch信號通路或激活BMP信號通路來誘導(dǎo)DTCs進(jìn)入休眠狀態(tài)[15]。此外，當(dāng)受到應(yīng)激信號或處于乏氧條件下DTCs也會進(jìn)入休眠狀態(tài)，其中MEKERK/MAPK和PI3K-Akt等信號通路在此過程中起著重要作用[13]。以上通路最終都直接作用于經(jīng)典的細(xì)胞周期途徑，通過上調(diào)p27和p21的表達(dá)，抑制Cyclin-CDKs復(fù)合物的形成，使DTCs進(jìn)入休眠狀態(tài)，即細(xì)胞周期阻滯在G0/1期[16]。腫瘤細(xì)胞休眠的一大特征是p38-MAPK增加，ERK1/2活性降低，p38-MAPKhigh/ERKlow表型現(xiàn)已被廣泛用作DTCs休眠狀態(tài)的標(biāo)志[13]。

1.2 靶器官中DTCs的存活機(jī)制

DTCs進(jìn)入休眠的先決條件是自身存活信號的增強(qiáng)。Ranganathan等研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)激誘導(dǎo)的p38激酶的激活導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶BiP的上調(diào)，通過激活ERK信號通路，誘導(dǎo)休眠的DTCs具有更高的存活率和治療抗性[17]。研究還發(fā)現(xiàn)p38激酶可通過介導(dǎo)UPR的活化誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子ATF6的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)mTOR介導(dǎo)的休眠DTCs存活[18]。此外，在乳腺癌患者的骨髓中發(fā)現(xiàn)趨化因子CXCL12可通過Src基因上調(diào)Akt通路進(jìn)而促進(jìn)休眠的DTCs存活；而當(dāng)DTCs處于乏氧和低葡萄糖的條件下，其可通過上調(diào)Grp78（一種UPR）蛋白來維持自身的生存[19]。

自噬可能是促進(jìn)休眠DTCs存活的另一種生存機(jī)制，因?yàn)樽允稍诰S持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)自噬有助于延長DTCs的存活時間，其主要通過維持氨基酸水平、ATP生成和阻斷能量突變來支持DTCs的存活[13]。值得注意的是，當(dāng)DTCs異常黏附在ECM上時會誘導(dǎo)自噬，而自噬通過自噬相關(guān)蛋白7（ATG7）調(diào)控休眠的DTCs存活，當(dāng)敲除ATG7基因后可有效的消除休眠的DTCs[20]。此外，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞播散到靶器官后具有很高的自噬通量，其中進(jìn)入休眠的DTCs其自噬通量進(jìn)一步增加，而進(jìn)入增殖的DTCs其自噬通量降低，提示自噬是休眠DTCs生存的關(guān)鍵過程[20]。

2 靶向休眠DTCs防治實(shí)體瘤轉(zhuǎn)移的治療策略

傳統(tǒng)抗腫瘤治療藥物主要以增殖活躍的腫瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞，在臨床上取得了一定的療效。針對休眠的DTCs臨床上仍缺乏有效的干預(yù)藥物和治療手段，目前主要有三種治療策略[16,21]，這些策略包括：（1）長期維持DTCs休眠，使癌癥轉(zhuǎn)變?yōu)槁钥煽刂频募膊?；?）激活休眠的DTCs，隨后通過常規(guī)抗腫瘤治療將其殺死；（3）開發(fā)可以殺死休眠DTCs的治療藥物。其中，第一種策略仍存在休眠的DTCs增殖激活后形成轉(zhuǎn)移的風(fēng)險；第二種策略激活休眠的DTCs增殖可能會涉及誘發(fā)DTCs中對治療無反應(yīng)的細(xì)胞亞群擴(kuò)增，進(jìn)而使原本無疾病癥狀的患者加速轉(zhuǎn)移進(jìn)展；第三種策略是直接靶向根除休眠狀態(tài)的DTCs，這可能是預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移最有效的治療策略。

2.1 維持DTCs休眠

首先，DTCs的休眠可以通過抑制增殖信號、激活休眠通路或營造休眠的環(huán)境來維持。如抑制uPAR信號、整合素β1信號、ERK和Src激酶的活性等，可以誘導(dǎo)DTCs進(jìn)入休眠狀態(tài)[14,22]。DTCs的休眠也可以通過上調(diào)休眠因子的表達(dá)來維持，包括p38/MAPK、DYRK1A和NR2F1等[23-24]。此外，賦予轉(zhuǎn)移前休眠龕的成分，例如GAS6、BMP4、BMP7和TGF-β2等，也可使DTCs保持休眠[25-26]。已有研究發(fā)現(xiàn)ERK抑制劑U0126或Src抑制劑PP1可有效維持播散性乳腺癌細(xì)胞的休眠[27]。而HDAC抑制劑（伏立諾司他、帕諾比諾司他、貝立諾司他和羅米肽）或DNA去甲基化藥物可用于維持DTCs長期休眠的替代輔助治療藥物，如5-氮胞苷（5-AzaC）和全反式維甲酸（atRA）聯(lián)合使用時可長期維持骨髓中的DTCs處于休眠狀態(tài)[11,28]。以上這些方法的缺點(diǎn)是不能殺死休眠的癌細(xì)胞，其臨床結(jié)果是需要接受終生治療，這對患者的依從性、成本和藥物毒性等方面提出了挑戰(zhàn)。

2.2 誘導(dǎo)休眠的DTCs凋亡

揭示休眠DTCs的存活機(jī)制并進(jìn)行靶向阻斷可能對其根除具有一定作用。在休眠的乳腺癌細(xì)胞中，Src激酶活性是維持其休眠所必需的，而ERK1/2的活性是休眠向增殖轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵[29]。研究發(fā)現(xiàn)用Src抑制劑AZD0530單獨(dú)給藥時可阻止休眠的癌細(xì)胞增殖，而將其與MEK1/2抑制劑AZD6244（MEK1/2是ERK1/2的上游激活劑）聯(lián)合給藥時可誘導(dǎo)休眠的癌細(xì)胞凋亡[30]。此外，Schewe等研究發(fā)現(xiàn)一種eIF2α磷酸酶抑制劑Salubrinal，不僅能增強(qiáng)硼替佐米對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，且還可誘導(dǎo)硼替佐米治療后存活下來的靜止期腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[18]。與此類似，在用EGFR抑制劑（厄洛替尼）治療的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）異種移植瘤中，腫瘤細(xì)胞會進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)，在這種治療下存活下來的細(xì)胞最終在長時間的靜止后會重新生長。但是，當(dāng)厄洛替尼與ABT-737（一種BCL-2和BCL-XL抑制劑）聯(lián)合使用時，靜止期的腫瘤細(xì)胞會消失[31]。以上研究提示有效根除休眠的DTCs需要同時抑制維持休眠的生存途徑和逃離休眠的途徑。

抑制自噬也可誘導(dǎo)休眠的DTCs凋亡。Gupta等研究發(fā)現(xiàn)伊馬替尼（PDGFRA抑制劑）治療胃腸道間質(zhì)瘤（GIST）后存活下來的靜止期癌細(xì)胞高度依賴自噬，而采用自噬抑制劑和伊馬替尼聯(lián)合治療時可顯示減少體內(nèi)外休眠的GIST數(shù)量[32]。此外，Vera-Ramirez等研究發(fā)現(xiàn)采用自噬抑制劑（氫氯喹、3-甲基腺嘌呤或巴非霉素）或敲除ATG7基因抑制自噬都可顯著降低休眠乳腺癌細(xì)胞的存活[20]。由于自噬抑制劑不能有效地消除進(jìn)入細(xì)胞周期的細(xì)胞，因此這種作用僅針對處于休眠狀態(tài)的DTCs。然而，相比現(xiàn)有的治療，上述方法的主要問題是根除休眠DTCs效果的不確定性，因?yàn)楝F(xiàn)有可用的診斷工具無法檢測到單個休眠細(xì)胞，且無法評估該療法對患者的療效。

3 展望

盡管早期篩查和診斷顯著改善了癌癥患者的生存期，但許多接受手術(shù)治療的患者最終發(fā)展為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移并因此死亡。輔助治療的療效取決于其清除已播散的腫瘤細(xì)胞的能力，而由于遠(yuǎn)處靶器官中的播散腫瘤細(xì)胞為適應(yīng)新的環(huán)境過程會進(jìn)入休眠狀態(tài)，這使其對輔助治療產(chǎn)生抗藥性，并經(jīng)過一段長時間的休眠后，DTCs最終增殖為臨床可檢出的轉(zhuǎn)移瘤。因此，休眠的DTCs作為抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療的靶點(diǎn)越來越受到重視。由于休眠的DTCs嚴(yán)重依賴于增強(qiáng)其存活的信號通路，干擾這些通路可能會提高輔助治療的療效。此外，揭示DTCs的休眠和再激活機(jī)制還可提供額外的治療靶點(diǎn)。迄今為止，治療休眠DTCs的最佳方法在臨床上仍未找到答案。因?yàn)槿狈εR床前休眠模型和能夠檢測休眠DTCs的敏感診斷和成像工具。

為此，我們課題組建立了可部分模擬腫瘤細(xì)胞休眠的體內(nèi)與體外研究模型，其中包括營養(yǎng)剝奪、乏氧誘導(dǎo)和接觸抑制模型[33-34]以及3D懸浮培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)處于懸浮狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞可自發(fā)的聚集成簇，且具有休眠的特性。而將處于休眠狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞接種到小鼠體內(nèi)，即可建立具有休眠特征的DTCs研究模型。此外，基于我們建立的休眠腫瘤細(xì)胞研究模型，通過高通量篩選，發(fā)現(xiàn)藤黃屬植物中Guttiferone K、Garoliganthone C等化合物具有靶向殺傷休眠腫瘤細(xì)胞的作用[35-36]，提示其可能對休眠的DTCs也具有細(xì)胞毒作用，但仍有待進(jìn)一步研究?？傊钊胙芯啃菝叩腄TCs在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制，并以此尋找到可誘導(dǎo)休眠的DTCs凋亡的靶點(diǎn)和治療藥物，這可能對防治腫瘤轉(zhuǎn)移，提高臨床療效具有重大的意義。