三子養(yǎng)親湯調(diào)節(jié)哮喘大鼠氣道線粒體自噬相關(guān)基因BECN1 UVRAG的實驗研究

張博達(dá) 謝 芳 全亞林 張 燕 劉 夢 蒲珊珊

資料顯示，目前全球哮喘患者達(dá)3.58億，大多數(shù)國家哮喘的發(fā)生率不斷上升[1]。2019年中國肺健康研究顯示，20歲以上哮喘患者4570萬，發(fā)生率為4.2%[2]。氣道重構(gòu)是哮喘的重要病理生理特點，但長期以來一直無特殊治療手段[3～5]。

中醫(yī)藥以痰治哮在臨床取得較好療效[6]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為哮喘患者均發(fā)生氣道重構(gòu)，主要特征是纖維化、基膜增厚、杯狀細(xì)胞化生、黏液分泌增加，并介導(dǎo)氣道高反應(yīng)性和可逆氣道阻塞，此認(rèn)識與中醫(yī)宿痰伏肺理論同源異流[7～9]。肺組織中線粒體的生理功能除了生產(chǎn)能量還產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，ROS又能夠引起線粒體的損傷，線粒體的損傷關(guān)系到細(xì)胞的生存[10]?；尉€粒體在哮喘患者的氣道平滑肌細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞中很常見，提示線粒體功能和生物狀態(tài)受到干擾[11]。現(xiàn)有研究表明自噬是哮喘氣道重構(gòu)的關(guān)鍵驅(qū)動因素[12]。故線粒體功能異常廣義上符合中醫(yī)脾為氣血生化之源，虛生痰，痰貯肺成哮的理論。

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，三子養(yǎng)親湯有改善氣道炎癥狀態(tài)的作用，而炎癥與自噬、氣道重構(gòu)密切相關(guān)[13]。本研究擬觀察三子養(yǎng)親湯對哮喘大鼠氣道線粒體自噬的影響，并探討其內(nèi)在的分子機(jī)制。

材料與方法

1. 實驗動物：3～5周鼠齡的Wistar大鼠共35只，體質(zhì)量60～80g。實驗動物購自成都達(dá)碩動物實驗有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(川)2018-25。動物飼養(yǎng)于川北醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，維持12h晝夜節(jié)律，室溫25℃，相對濕度50%～70%，自由進(jìn)食、飲水。

2.藥品與試劑：三子養(yǎng)親湯：萊菔子12g、白芥子12g、紫蘇子12g，實驗藥物購自川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房，由四川省中藥材公司統(tǒng)一煎煮、濃縮，所有流程均符合《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)；發(fā)動蛋白抑制劑(mitochondrial division inhibitor, Mdivi-1)(批號：20200507)，規(guī)格：10mg，購自美國Selleck公司；OVA(批號：A5708)購自美國Sigma公司；UVRAG，Beclin1蛋白定量分析試劑盒(批號：Br52155648，Dx5856612)購自上海江萊生物科技有限公司；實時熒光定量PCR試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)公司。

3.主要實驗儀器：倒置生物顯微鏡(CKX-31)購自日本奧林巴斯公司；超臨界萃取儀(SFT-1000)購自美國SFT公司；酶標(biāo)儀(Multlskan Mk3)購自賽默飛世爾儀器有限公司；透射電子顯微鏡(HT7700)購自美國HITACHI公司；NanoUV-3000 型微量核酸蛋白檢測儀購自廣州標(biāo)旗光電科技有限公司；ABI7500 Real- time PCR儀購自賽默飛世爾儀器有限公司。

4.動物分組及造模：35只Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，分別為空白組、哮喘模型組、三子養(yǎng)親湯組、三子養(yǎng)親湯+Mdivi-1組和Mdivi-1組，每組7只。哮喘大鼠模型采用腹腔注射卵蛋白加霧化激發(fā)復(fù)制。分別于第1天和第14天腹腔注射0.1%卵蛋白加氫氧化鋁凝膠混合液(二者比例為1∶4，pH值7.4)。15～28天在自制玻璃箱中霧化吸入2%卵蛋白NaCl注射液 5ml。每天1次，每次持續(xù)30min，連續(xù)激發(fā)14天[14]。

5.給藥：每天在激發(fā)前0.5h，按人和大鼠間體表面積折算等效劑量，對三子養(yǎng)親湯組大鼠灌胃濃度5.4g/(kg·d)中藥湯劑2ml；Mdivi-1組大鼠用1.2mg/(kg·d)藥量2ml灌胃，三子養(yǎng)親湯+Mdivi-1組使用10.8g/(kg·d)和2.4mg/(kg·d)各1ml先后灌胃；哮喘模型組使用0.9%NaCl注射液2ml灌胃，連續(xù)2周。

6.電鏡觀察線粒體自噬體：取綠豆大小的肺組織團(tuán)塊，于丙酮上脫水，將樣品插入包埋板過夜，切60～80nm超薄切片，鈾鉛雙染色，干燥過夜，透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

7.肺組織中UVRAG、Beclin1含量檢測：處死大鼠，剪開胸腔，將實驗大鼠左肺小心剝離，取100～200mg肺組織，加入Ripa裂解液，冰上孵育30min勻漿，12000r/m離心10min，取上清液，按試劑盒要求采用 BCA 法進(jìn)行蛋白定量，以β-actin為內(nèi)參，采用Image J軟件進(jìn)行圖像分析，計算上述蛋白的變化。

8.HE及PAS形態(tài)學(xué)觀察：大鼠處死后，肺組織標(biāo)本以10%甲醛溶液固定，以蘇木精-伊紅(HE) 及過碘酸-Schiff 染色，并做病理切片，觀察肺組織的形態(tài)變化。

9.UVRAG、Beclin1 mRNA q-PCR 檢測：大鼠肺組織提取總RNA，采取Trizol試劑純化并制備cDNA，并按Thermo Fisher Scientific SuperScript Ⅳ反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作，所得結(jié)果用2-ΔΔCT法分析。引物序列: 從美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)中搜索基因序列，使用Primer引物設(shè)計軟件篩選各基因特異性引物。所有引物均交由武漢博士德工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計合成并純化。引物序列詳見表1。

表1 引物序列(5′→3′)

結(jié) 果

1.大鼠一般情況觀察：除正常組外，哮喘模型組大鼠出現(xiàn)呼吸急促、不停撓鼻、噴嚏、腹肌抽搐、動作遲緩、精神狀態(tài)差、攝食飲水量較正常組下降等典型哮喘癥狀。三子養(yǎng)親湯組大鼠精神較好，呼吸平穩(wěn)，自主運動無異常。依據(jù)大鼠癥狀提示，哮喘模型復(fù)制成功。Mdivi-1組與三子養(yǎng)親湯+Mdivi-1組大鼠表現(xiàn)與哮喘模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.三子養(yǎng)親湯對哮喘大鼠肺組織中Beclin1、UVRAG含量影響：Western blot法檢測大鼠肺組織，與空白組比較，哮喘模型組大鼠Beclin1、UVRAG指標(biāo)顯著升高。經(jīng)藥物干預(yù)后，三子養(yǎng)親湯組Beclin1、UVRAG指標(biāo)明顯下降，詳見圖1。

圖1 三子養(yǎng)親湯對哮喘大鼠肺組織Beclin1、UVRAG蛋白表達(dá)影響

3.三子養(yǎng)親湯對哮喘大鼠UVRAG、Beclin1 mRNA 含量影響：Real- time PCR檢測大鼠肺組織中UVRAG、Beclin1 mRNA 含量，與空白組比較，哮喘模型組大鼠Beclin1、UVRAG mRNA 指標(biāo)顯著升高。經(jīng)藥物干預(yù)后，三子養(yǎng)親湯組Beclin1、UVRAG mRNA指標(biāo)明顯下降，詳見圖2。

圖2 三子養(yǎng)親湯對哮喘大鼠肺組織Beclin1、UVRAG mRNA表達(dá)影響

4.三子養(yǎng)親湯對哮喘大鼠肺組織病理學(xué)影響：HE染色結(jié)果顯示,空白組支氣管無明顯改變，未見明顯的杯狀細(xì)胞增殖(圖3A)。哮喘模型組支氣管炎，支氣管周圍可見大量的炎性細(xì)胞浸潤，肌層損傷斷裂，炎癥浸潤至黏膜層，支氣管上皮細(xì)胞化生大量杯狀細(xì)胞(紅色箭頭)，少量的支氣管上皮組織脫落(黃色箭頭，圖3B)。三子養(yǎng)親湯組肺泡內(nèi)少許氣道上皮(黃色箭頭)，基膜無明顯增殖(黑色箭頭,圖3C)。三子養(yǎng)親湯+Mdivi-1組少見支氣管上皮脫落(黑色箭頭)，局部肺泡擴(kuò)張(紅色箭頭)，基膜增厚，肺泡腔內(nèi)多見零散的巨噬細(xì)胞(黃色箭頭,圖3D)。Mdivi-1組一側(cè)肺泡壁輕度增厚，并伴有的炎性細(xì)胞浸潤(黑色箭頭)，一側(cè)肺泡重度擴(kuò)張，肺泡壁斷裂(紅色箭頭,圖3E)。

圖3 三子養(yǎng)親湯對哮喘大鼠肺組織病理學(xué)影響 (HE染色，×200)

PAS染色結(jié)果顯示，空白組支氣管未見明顯的杯狀細(xì)胞增生，未見明顯其他異常(圖4A)。哮喘模型組大量的杯狀細(xì)胞增生(黑色箭頭)，少量的支氣管上皮組織脫落(紅色箭頭，圖4B)。三子養(yǎng)親湯組支氣管上皮組織脫落(黑色箭頭)，少量杯狀細(xì)胞增生(紅色箭頭，圖4C)。三子養(yǎng)親湯+Mdivi-1組大量的杯狀細(xì)胞增生(黑色箭頭)，并伴有小黏液栓形成(紅色箭頭,圖4D)。Mdivi-1組大量的杯狀細(xì)胞增生(黑色箭頭)，內(nèi)含未分泌黏液(紅色箭頭,圖4E)。

圖4 三子養(yǎng)親湯對哮喘大鼠肺組織病理學(xué)影響(PAS染色， ×200)

5.三子養(yǎng)親湯對哮喘大鼠肺組織線粒體自噬形態(tài)學(xué)影響：空白組細(xì)胞表面見微絨毛結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)見豐富的嗜鋨性板層體，未見自噬體(圖5A)。哮喘模型組嗜鋨性板層小體結(jié)構(gòu)破壞，板層結(jié)構(gòu)疏松，見較多自噬體，線粒體腫大明顯(圖5B)。三子養(yǎng)親湯組細(xì)胞內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)基本正常，見較少自噬體形成(圖5C)。三子養(yǎng)親湯+Mdivi-1組細(xì)胞內(nèi)未見自噬體，線粒體腫大變形(圖5D)。Mdivi-1組細(xì)胞內(nèi)未見自噬體，線粒體腫脹呈低電子密度(圖5D)。

圖5 三子養(yǎng)親湯對哮喘大鼠肺組織線粒體自噬形態(tài)學(xué)影響 (透射電鏡，×8000)

討 論

哮喘反復(fù)發(fā)作，纏綿難愈，究其根本，原是哮有“宿根”所致。《證因脈治》云：“哮病之因，痰飲留伏，結(jié)成巢臼，潛伏于內(nèi)”闡明了哮與痰之間的因果關(guān)系[15]。中醫(yī)理論認(rèn)為，脾主運化，為氣血生化之源，后天之本，脾氣虧虛，水運失常，痰濁內(nèi)生；中焦氣機(jī)受阻，肺通調(diào)水道失常，貯肺為痰。三子養(yǎng)親湯源于《韓氏醫(yī)通》，具有降氣、消食、化痰之功。其中蘇子降氣行痰、止咳平喘；白芥子溫肺利氣、快隔消痰；萊菔子消食導(dǎo)滯、行氣祛痰。三者合用治療咳喘氣逆、痰多胸痞、食少難消，舌苔白膩，脈細(xì)滑等癥， 以消為補(bǔ)可明顯減少肺痰致哮的發(fā)生概率[16,17]。

已有研究證實，UVRAG是體內(nèi)至關(guān)重要的自噬調(diào)節(jié)劑，促進(jìn)自噬可能有助于防治易感人群的炎癥性疾病和癌癥[18]。Kim 等[19]通過研究發(fā)現(xiàn)mTORC1磷酸化UVRAG可以負(fù)調(diào)控自噬體和內(nèi)體成熟。Beclin1可以通過CCD和ECD結(jié)構(gòu)域與ClassⅢ PI3K結(jié)合，形成Beclin1-ClassⅢ PI3K-Vps15 復(fù)合體，上調(diào)細(xì)胞自噬水平[20]。UVRAG能與 Beclin1 的 CCD 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，提高 Beclin1與ClassⅢ PI3K 的相互作用以及 ClassⅢ PI3K 的活性，從而上調(diào)細(xì)胞自噬的水平，故選擇UVRAG和Beclin1作為線粒體自噬狀態(tài)的標(biāo)志物[21]。

本研究通過肺組織形態(tài)學(xué)觀察顯示，三子養(yǎng)親湯可減輕哮喘大鼠肺組織杯狀細(xì)胞化生，抑制氣道基膜增厚，這種改善作用可被線粒體自噬抑制劑Mdivi-1阻斷，電鏡觀察顯示使用自噬抑制劑后線粒體自噬體消失，提示三子養(yǎng)親湯發(fā)揮作用跟調(diào)控線粒體自噬有關(guān)。各哮喘實驗組Beclin1mRNA 表達(dá)變化趨勢與Beclin1蛋白一致，且三子養(yǎng)親湯組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示三子養(yǎng)親湯可能通過對Beclin1轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控而發(fā)揮相關(guān)作用。Beclin1上游因子UVRAG蛋白測試中發(fā)現(xiàn)三子養(yǎng)親湯+Mdivi-1組抑制作用最強(qiáng)，具有協(xié)同作用，但UVRAG mRNA檢測顯示，哮喘模型組與三子養(yǎng)親湯+Mdivi-1組比較UVRAG mRNA差異明顯，且趨勢與UVRAG蛋白達(dá)不一致，提示三子養(yǎng)親湯可能通過調(diào)控UVRAG mRNA轉(zhuǎn)錄后環(huán)節(jié)而起作用。

綜上所述，三子養(yǎng)親湯能改善哮喘大鼠氣道重構(gòu)，與其下調(diào)Beclin1、UVRAG表達(dá)恢復(fù)線粒體自噬有關(guān)，其作用的具體靶點可能是UVRAG mRNA的轉(zhuǎn)錄后環(huán)節(jié)。