肺部腫瘤熱消融聯(lián)合免疫治療現(xiàn)狀與進(jìn)展

劉寶東

腫瘤免疫（immuno-oncology, IO）聯(lián)合腫瘤介入（interventional oncology, IO）（IO+IO）是目前臨床研究的熱點(diǎn)[1-6]。腫瘤免疫是研究腫瘤的抗原、機(jī)體的免疫功能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相互關(guān)系，機(jī)體對腫瘤的免疫應(yīng)答及其抗腫瘤免疫效應(yīng)的機(jī)制、腫瘤的免疫診斷和免疫治療的科學(xué)[7]。本文討論的腫瘤介入主要是腫瘤熱消融，包括射頻消融（radiofrequency ablation, RFA）、微波消融（microwave ablation, MWA）和冷凍消融（cryoablation）三項(xiàng)技術(shù)。

1 腫瘤免疫

在腫瘤的免疫機(jī)制中，涉及到腫瘤抗原的免疫原性、機(jī)體的免疫監(jiān)視和腫瘤的免疫逃逸作用。

1.1 腫瘤抗原 腫瘤抗原是細(xì)胞癌變過程中所出現(xiàn)的新抗原（neoantigen）及過度表達(dá)的抗原物質(zhì)的總稱，到目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腫瘤抗原近3,000種。根據(jù)特異性可分為腫瘤特異抗原（tumor specific antigen, TSA）和腫瘤相關(guān)抗原（tumorassociated antigen, TAA）；根據(jù)腫瘤抗原產(chǎn)生機(jī)制分為突變基因或癌基因表達(dá)產(chǎn)物、異常表達(dá)的細(xì)胞蛋白、化學(xué)或物理因素誘發(fā)的腫瘤抗原、病毒誘發(fā)的腫瘤抗原、自發(fā)性腫瘤抗原、胚胎抗原和組織特異性分化抗原。

1.2 機(jī)體抗腫瘤免疫機(jī)制 對免疫原性強(qiáng)的腫瘤，特異性免疫應(yīng)答是主要的；而對免疫原性弱的腫瘤，非特異性免疫應(yīng)答可能具有更重要的意義。細(xì)胞免疫在免疫監(jiān)視和抗腫瘤效應(yīng)中占主導(dǎo)地位，體液免疫僅在某些情況下起協(xié)同作用，包括激活補(bǔ)體系統(tǒng)溶解腫瘤細(xì)胞、抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC）、抗體的調(diào)理作用和抗體使腫瘤細(xì)胞的黏附特性改變或喪失。

1.2.1 細(xì)胞免疫的效應(yīng)細(xì)胞 細(xì)胞免疫的效應(yīng)細(xì)胞有T細(xì)胞、自然殺傷（natural killer, NK）細(xì)胞、巨噬細(xì)胞（macrophage, Mφ）、髓系來源抑制細(xì)胞（myeloid-drived suppressor cells, MDSCs）。

T細(xì)胞分為主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex, MHC）II類抗原限制的輔助性T淋巴細(xì)胞（helper T cell, Th）或CD4+T細(xì)胞和MHC I類抗原限制的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte,Tc）或CD8+T細(xì)胞兩種亞群。根據(jù)其分泌細(xì)胞因子的不同，CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞又分別分為Th1、Th2和Tc1、Tc2細(xì)胞亞群。Th1、Tc1細(xì)胞參與抗腫瘤細(xì)胞免疫效應(yīng)，主要分泌白介素2（interleukin-2, IL-2）、γ干擾素（interferon-γ, IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α, TNF-α）等激活單核-巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞，并增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞殺傷功能。Th2、Tc2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10等II類因子，主要參與體液免疫。IFN-γ和IL-4能分別對Th1和Th2產(chǎn)生促生成作用，因此可以通過監(jiān)測IFN-γ/IL-4的比例間接反映Th1/Th2水平。CD8+T細(xì)胞是抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，其殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制有：①通過其抗原受體識別腫瘤細(xì)胞上的腫瘤抗原并與之結(jié)合，通過溶細(xì)胞作用，直接殺傷腫瘤細(xì)胞；②通過分泌多種細(xì)胞因子（如IFN-γ、TNF）間接殺傷腫瘤細(xì)胞。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells, Treg）屬于抑制性T細(xì)胞（suppressor T cells, Ts），它是一個(gè)異質(zhì)性群體，主要來自CD4+CD25+表型細(xì)胞，在胸腺產(chǎn)生，旨在保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和免疫沉默，是一個(gè)重要的自身核對，主要包括：①通過分泌免疫抑制因子抑制效應(yīng)細(xì)胞的功能，分泌免疫抑制因子如IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β, TGF-β）完成，其中TGF-β可以阻斷T細(xì)胞和B細(xì)胞的活性、NK和淋巴因子激活殺傷細(xì)胞（lymphokine activated killer cells, LAK）和抗原呈遞；②通過顆粒酶和穿孔素直接殺傷效應(yīng)細(xì)胞；③通過干擾細(xì)胞代謝影響效應(yīng)細(xì)胞的功能；④通過影響樹突狀細(xì)胞（dendritic cell, DC）的功能進(jìn)而影響T細(xì)胞的活化以及Treg的誘生和增殖。Tregs表達(dá)CD4+CD25+，因此可以通過監(jiān)測CD4+CD25+雙陽性細(xì)胞水平來間接反映Tregs在消融后患者血清中的變化。

NK細(xì)胞占循環(huán)淋巴細(xì)胞的15%，能產(chǎn)生IFN-7、TNF-8等豐富的細(xì)胞因子，是細(xì)胞免疫中的非特異性成分。它不依賴抗體或補(bǔ)體、不需要預(yù)先活化即可直接殺傷腫瘤細(xì)胞，其殺傷作用不受腫瘤特異性和MHC限制，處于抗腫瘤的第一道防線。

巨噬細(xì)胞不僅是溶解腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞，也是機(jī)體抗腫瘤細(xì)胞免疫中的抗原呈遞細(xì)胞（antigen-presenting cells, APC）。

M DSCs來源于骨髓祖細(xì)胞和未成熟髓細(xì)胞，是樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和/或粒細(xì)胞的前體，具有CD34+CD33+CD13+CD15-Treg的表型細(xì)胞。具有抑制T細(xì)胞功能和調(diào)節(jié)天然抗腫瘤免疫的作用。

1.2.2 APC APC包括DC、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞等，其中DC是功能最強(qiáng)的APC。DC表達(dá)MHC I類、MHC II類分子及T細(xì)胞活化所必需的共刺激分子，通過MHC I類、MHC II類分子及交叉呈遞功能，捕獲抗原，經(jīng)其加工、處理后將抗原信息呈遞給T、B細(xì)胞，分別刺激CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞。MHC I類分子主要來源于自身抗原或病毒感染后細(xì)胞抗原，MHC II類分子主要來源于外界抗原。巨噬細(xì)胞和DC主要區(qū)別在于交叉呈遞能力不同。DC可將MHC II類抗原交叉呈遞進(jìn)入MHC I類途徑，進(jìn)而產(chǎn)生CD8+T細(xì)胞。

1.3 腫瘤免疫逃逸 腫瘤免疫逃逸機(jī)制包括免疫抑制和免疫耐受。

免疫抑制是腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫抑制細(xì)胞，如Treg、MDSCs、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、不成熟DC等。免疫抑制因子包括TGF-β、IL-10、前列腺素（prostaglandin E2,PGE2）、環(huán)氧合酶2、吲哚胺-2,3-雙加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）及Toll樣受體（Toll-like receptor,TLR）等。

免疫耐受包括腫瘤局部的“免疫黑洞”和宿主免疫系統(tǒng)異常，前者表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞的抗原缺失和抗原調(diào)變，腫瘤抗原的封閉、遮蔽與隔離，腫瘤細(xì)胞MHC I類、MHC II類分子表達(dá)低下，腫瘤細(xì)胞共刺激信號缺乏，腫瘤細(xì)胞漏逸，免疫檢查點(diǎn)和腫瘤細(xì)胞抗凋亡；后者表現(xiàn)為宿主血清中存在一定量的“增強(qiáng)抗體”，機(jī)體免疫抑制性細(xì)胞異常活躍，宿主APC功能低下或數(shù)量異常，腫瘤局部浸潤淋巴細(xì)胞功能異常，外周血紅細(xì)胞免疫狀態(tài)改變，血清可溶性IL-2受體水平異常增高，外周血NK細(xì)胞活性降低和外周血Th1/Th2、Tc1/Tc2細(xì)胞比例失衡。

2 肺部腫瘤熱消融

2.1 熱消融技術(shù) 肺部腫瘤熱消融技術(shù)主要有射頻消融、微波消融和冷凍消融三種[8]。靶腫瘤消融后，可以誘發(fā)遠(yuǎn)處的腫瘤消退，這一現(xiàn)象稱之為異位效應(yīng)（abscopic effect）。

2.2 共同的免疫學(xué)機(jī)制[9-13]消融中心區(qū)損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns, DAMPs）是組織或細(xì)胞受到損傷、缺氧、應(yīng)激等因素刺激后釋放到細(xì)胞間隙或血液循環(huán)中的一類物質(zhì)，主要包括：DNA、RNA、高遷移率族蛋白1（high mobility group protein 1, HMGB1）、熱休克蛋白（heat shock proteins, HSPs）、鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin,CRT）、腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate, ATP）等物質(zhì)作為危險(xiǎn)信號與模式識別受體（pattern recognition receptor, PRR）被機(jī)體的免疫系統(tǒng)識別結(jié)合，激活多種免疫細(xì)胞誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。該區(qū)域積聚的DAMPs充當(dāng)腫瘤抗原的重要儲(chǔ)存庫，逐漸流向區(qū)域淋巴結(jié)，促進(jìn)DC細(xì)胞成熟，活化T細(xì)胞，激活機(jī)體抗腫瘤免疫。當(dāng)細(xì)胞死亡發(fā)生時(shí)，“第一反應(yīng)者”通常是非特異性免疫系統(tǒng)的代表，包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞。激活特異性免疫反應(yīng)有四個(gè)要求：抗原呈遞、T細(xì)胞的抗原識別、共刺激分子的相互作用和危險(xiǎn)信號的持續(xù)存在。共刺激是指T細(xì)胞上的CD28和DC上的B7分子的非抗原特異性標(biāo)志。熱消融術(shù)后1.5 h-8 wk機(jī)體血清中的促炎性細(xì)胞因子出現(xiàn)暫時(shí)性的升高，引起明顯的體溫升高伴腎上腺素水平升高，但不導(dǎo)致嚴(yán)重的全身性炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome, SIRS）與多器官功能衰竭和凝血功能障礙，但是體溫、平均動(dòng)脈壓、血清中腎上腺素、去甲腎上腺素、C反應(yīng)蛋白增加。

致死性高熱的常用閾值是50oC。高于50oC的溫度，由蛋白質(zhì)變性引起的凝固性壞死基本上立即發(fā)生；低于50oC的溫度，細(xì)胞死亡需要持續(xù)暴露。如果沒有實(shí)現(xiàn)立即細(xì)胞死亡，則在恢復(fù)到常溫條件后可以觀察到由于熱誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷引起的延遲響應(yīng)。在這種情況下，細(xì)胞死亡可以通過細(xì)胞凋亡發(fā)生，也可能由血管血栓形成導(dǎo)致組織缺血或再灌注損傷。消融過渡區(qū)由熱介導(dǎo)的溶酶體激活或線粒體損傷而不是壞死，細(xì)胞死亡可能是細(xì)胞凋亡，或者可以發(fā)生細(xì)胞恢復(fù)。凋亡細(xì)胞不釋放細(xì)胞內(nèi)容物，被DC細(xì)胞攝取后無“危險(xiǎn)信號”釋放，不能有效刺激DC細(xì)胞成熟，致使T細(xì)胞活化受限，無法形成有效的免疫應(yīng)答，甚至引起抑制性免疫反應(yīng)。

腫瘤細(xì)胞壞死與凋亡的平衡是熱消融治療后免疫應(yīng)答中的一個(gè)關(guān)鍵但很難表征（poorly characterized）的因素。正調(diào)節(jié)因素在細(xì)胞壞死時(shí)出現(xiàn)，包括炎性因子（IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、IFN-γ）、免疫細(xì)胞因子（CD40L/CD40）、死亡腫瘤釋放內(nèi)源性佐劑（CDN、ATP、HMGB1）、腸道微生物產(chǎn)物增加。負(fù)調(diào)節(jié)在細(xì)胞凋亡時(shí)出現(xiàn)，包括IL-10、IL-4、IL-13升高。

2.3 各自的免疫學(xué)機(jī)制 射頻消融[14-17]產(chǎn)熱區(qū)域只在電極附近幾毫米，熱量通過熱傳導(dǎo)方式緩慢向外傳遞，對微小血管損傷小，免疫細(xì)胞能更好地通過血管進(jìn)入腫瘤。射頻消融可以引起大量促炎性細(xì)胞因子升高，消融后數(shù)小時(shí)出現(xiàn)，持續(xù)數(shù)天。引起Treg（CD4+CD25+Foxp3+）細(xì)胞數(shù)量減少，抑制性免疫反應(yīng)減少，促進(jìn)抗腫瘤免疫。射頻消融也被證明會(huì)引起缺氧驅(qū)動(dòng)的遠(yuǎn)離治療部位（細(xì)胞凋亡）的轉(zhuǎn)移性腫瘤生長。

微波消融引起的免疫效應(yīng)與射頻消融類似，但是由于腫瘤抗原變性及凝固性壞死更徹底，不利于抗腫瘤免疫效應(yīng)激活，因此免疫效應(yīng)較射頻消融弱。

冷凍消融[18,19]可以引起的液化性壞死較凝固性壞死能更好地保存腫瘤抗原免疫原性，并且有利于DAMPs釋放以及免疫細(xì)胞浸潤、抗原呈遞及T細(xì)胞活化。冷凍比熱消融更能引起大量促炎性細(xì)胞因子升高，消融后數(shù)小時(shí)出現(xiàn)，持續(xù)數(shù)天。免疫效應(yīng)是激活還是抑制取決于腫瘤細(xì)胞壞死-凋亡的比例及Treg產(chǎn)生多少有關(guān)。

極高溫度誘發(fā)不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞損傷和凝固組織壞死。腫瘤抗原多變性，免疫原性差，凝固性壞死不利于DAMPs的釋放及免疫細(xì)胞的浸潤，因此熱消融免疫效應(yīng)較冷凍消融弱[10,13]。

3 腫瘤熱消融聯(lián)合腫瘤免疫

3.1 肺部腫瘤熱消融存在的問題 消融后循環(huán)腫瘤細(xì)胞增加是否促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[20]？消融過渡區(qū)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡（缺乏有效抗原釋放，對宿主免疫系統(tǒng)通常沒有損害）是否促進(jìn)腫瘤進(jìn)展復(fù)發(fā)[21-23]？

熱消融產(chǎn)生的抗腫瘤免疫異位效應(yīng)通常較弱，無法完全清除腫瘤細(xì)胞[19,24]。為此需要聯(lián)合免疫治療，降低轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。

3.2 腫瘤免疫治療 1868年，Wilhelm Busch首次報(bào)道使用丹毒感染癌癥患者后腫瘤顯著縮小。1891年，美國紐約紀(jì)念醫(yī)院骨科醫(yī)師William Coley開始用細(xì)菌來治療腫瘤的試驗(yàn)，經(jīng)歷了漫長的探索，遭遇重大挫折。直到1984年，美國國立癌癥研究院Steve Rosenberg團(tuán)隊(duì)成功地用高劑量IL-2治愈1例患者，給腫瘤免疫治療帶來一線曙光。此后，包括單克隆抗體、腫瘤疫苗不斷涌現(xiàn)，雖然對一些患者有效，但未被大規(guī)模應(yīng)用。

特異性主動(dòng)免疫治療主要是指腫瘤疫苗，通過給患者體內(nèi)導(dǎo)入腫瘤抗原，激發(fā)患者的特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)，具有特異性強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間長等優(yōu)點(diǎn)。比利時(shí)學(xué)者Thierry Boon教授長期研究癌細(xì)胞抗原問題。近年來，已經(jīng)涌現(xiàn)出細(xì)胞疫苗、全蛋白疫苗、多肽疫苗、核酸疫苗、重組病毒疫苗、基因修飾的瘤苗（將某些細(xì)胞因子基因、輔助刺激分子基因、MHC I類抗原分子基因等轉(zhuǎn)移入腫瘤細(xì)胞后，可降低其致瘤性，增強(qiáng)其免疫原性）、抗獨(dú)特性抗體瘤苗（抗獨(dú)特性抗體是抗原的內(nèi)影像，可以模擬腫瘤抗原成為瘤苗）、DC疫苗等。

特異性被動(dòng)免疫治療包括單克隆抗體的免疫治療[人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T lymphocyte associated protein 4, CTLA-4）、程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1, PD-1）/程序性死亡配體1（programmed cell death ligand 1, PD-L1）]、抗體導(dǎo)向藥物治療[過繼細(xì)胞免疫：巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokineinduced killer, CIK）細(xì)胞、腫瘤浸潤淋巴（tumor in filtrating lymphocyte, TIL）細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴（cytotoxic T lymphocyte, CTL）細(xì)胞、嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法（chimeric antigen receptor T, CAR-T）細(xì)胞和T細(xì)胞受體基因工程改造的T細(xì)胞（T cell receptor-gene engineered T,TCR-T）細(xì)胞]、細(xì)胞因子[ILs類：IL-2、IL-12；IFNs類IFN-α、IFN-β、IFN-γ；集落刺激因子（colony stimulating factor, CSF）類：粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte CSF,G-CSF）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocytemacrophage CSF, GM-CSF）；TNFs類：TNF-α、TNF-β；TGFs類：TGF-α、TGF-β）]。

非特異性免疫治療包括微生物及有關(guān)成分（卡介苗BCG、短小棒狀桿菌CP、溶血性鏈球菌制劑OK-432等）、多糖類（酵母多糖、云芝多糖PSK、香菇多糖Lentinan等）、胸腺肽α1、合成免疫調(diào)節(jié)劑（如聚肌胞苷酸、CpG-寡脫氧核苷酸CpG-ODN、左旋咪唑等）和重組人體乳轉(zhuǎn)鐵蛋白（talactoferrin, TLF）。

免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitor,ICI）的療效主要與以下因素相關(guān)：腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden, TMB）（≥20、6-19、≤5）、微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（microsatellite instability-high, MSI-H）、錯(cuò)配基因修復(fù)缺失（mismatch-repair deficiency, MMR）、腫瘤微環(huán)境中的PD-L1表達(dá)豐度及腫瘤局部浸潤淋巴細(xì)胞數(shù)量、腸道微生態(tài)、KRAS突變（同時(shí)攜帶KRAS和P53突變的患者對PD-1治療敏感；同時(shí)攜帶KRAS和STK11突變的患者對PD-1治療抵抗；其他患者對PD-1治療的有效率居中）。

3.3 聯(lián)合治療 熱消融作為微創(chuàng)且精準(zhǔn)的腫瘤治療技術(shù)，能否通過聯(lián)合腫瘤免疫治療提高協(xié)同作用是目前研究的熱點(diǎn)。多項(xiàng)研究證實(shí)熱消融聯(lián)合DC或免疫佐劑（CpGODN、OK-432、白介素、GM-CSF、趨化因子和TLR激動(dòng)劑）[25-32]、過繼免疫細(xì)胞（DC-CIK及NK細(xì)胞）[33,34]、CTLA-4單抗[35]、PD-1/PD-L1抗體[36]、Treg耗竭[35]等可以促使機(jī)體產(chǎn)生更加強(qiáng)大的抗腫瘤免疫效應(yīng)，從而獲得更好的療效。比如患者生活質(zhì)量的改善，CD3、CD4、CD8、CD4/CD8等免疫指標(biāo)的提升等，說明熱消融聯(lián)合免疫治療具有協(xié)同作用。但是上述研究仍處于初步研究階段，臨床效果有待于進(jìn)一步研究。

總之，熱消融聯(lián)合免疫治療能否提高肺部腫瘤患者的生存率？熱消融聯(lián)合免疫治療能否提高完全消融率？哪種消融聯(lián)合免疫治療最有效？等等問題還需要進(jìn)一步探討。目前正在進(jìn)行的I期/II期臨床注冊研究或許能夠回答這些疑問，免疫治療主要是針對PD-1/PD-L1，熱消融技術(shù)主要有冷凍、微波等，這些研究有NCT02469701、NCT02843815、NCT03290677、NCT03769129、NCT04049474、NCT04102982、NCT04201990、NCT04339218等，希望能盡快取得喜人的結(jié)果并指導(dǎo)臨床治療。