術前預測肝細胞癌微血管侵犯的研究進展*

周曉涵 臺蘊澤 綜述 周娟 審校

肝癌是世界范圍內發(fā)病率第六位、死亡率第三位的惡性腫瘤[1]。其中，肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的類型，約占90%。研究表明外科手術是HCC 的主要治療方式，但復發(fā)轉移是影響患者術后長期生存的主要因素之一[2]。微血管侵犯（microvascular invasion,MVI）被認為是HCC 復發(fā)轉移的獨立危險因素，與患者不良預后密切相關[3]。但目前MVI 只能通過術后病理檢查確認，若能術前預測MVI，將有助于對HCC 患者的精準治療，提高患者生存率及篩選最佳肝移植受者。本文對術前預測HCC患者MVI 狀態(tài)的相關研究及最新進展進行綜述，總結了多指標聯(lián)合預測模型良好的MVI 預測能力，并評估了液體活檢在MVI 預測方面的較大潛力。

1 MVI 定義、發(fā)生率及其與HCC 預后的關系

原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版) 中采用“七點基線取材”法對MVI 進行定義：在顯微鏡下于內皮細胞襯覆的血管腔（以癌旁門靜脈分支為主，含包膜內血管）內發(fā)現(xiàn)癌細胞巢團，且無肉眼可見的腫瘤血管侵犯[4]。Rodríguez-Perálvarez 等[5]通過對20 多項研究進行系統(tǒng)評價，發(fā)現(xiàn)HCC 中MVI 的發(fā)生率介于15%～57.1%，這可能是MVI 采樣標準缺乏共識導致。Yamashita 等[6]通過對414 例具有單個≤3 cm 小HCC患者進行研究，發(fā)現(xiàn)其MVI 陽性率達40.6%，說明即使在小HCC 患者中，也存在著顯著的MVI 風險。研究表明，MVI 是影響HCC 患者預后的重要因素。Feng 等[7]根據(jù)浸潤深度以及腫瘤栓子與血管壁之間的關系，將MVI 分為四種組織學類型：游離型、粘附型、侵襲型與突破型。其中前兩種屬于非侵襲型MVI，后兩種屬于侵襲型MVI；進而將患者分為M0（無MVI）、M1（非侵襲型MVI≤5）、M2（非侵襲型MVI＞5或侵襲型MVI≤5）和M3（侵襲型MVI＞5）4 類，且其總生存期依次降低。Chen 等[8]分別比較了36 項研究中單發(fā)小HCC 患者MVI 陽性組和陰性組的總生存及無疾病生存，結果表明即使對于小HCC 患者，MVI也是其預后差的危險因素。

2 MVI 狀態(tài)與HCC 精準治療

HCC 患者的治療方案包括肝切除、肝移植、輔助治療等。研究發(fā)現(xiàn)，MVI 狀態(tài)與HCC 患者的術式選擇、術中切緣選擇及輔助治療方案的選擇相關。肝切除是HCC 患者的主要治療方式。研究表明，對于MVI 陽性的HCC 患者，解剖學切除比非解剖學切除預后更好[9]；此外，考慮到MVI 的侵襲性、分化程度等因素，學者們提出對于合并MVI 的HCC 患者建議行腫瘤切緣較寬的切除術，以期改善患者長期預后[10]。但在一些只能選擇窄切緣切除術（如腫瘤靠近肝內大血管或需要保證患者有足夠的肝功能等）的情況下，患者可能會因為MVI 導致術后腫瘤早期復發(fā)，應用125I粒子植入能降低這種風險[11]。此外，“EASL 臨床實踐指南（2018年版）”中提出，可用射頻消融（radiofrequency ablation，RFA）替代手術切除作為小HCC 患者的一線治療方案[12]；但對于MVI 陽性的小HCC 患者，接受RFA 治療比手術切除更易復發(fā)，不推薦RFA治療[13]。

此外，術前預測MVI 有助于篩選最佳肝移植受者。對于符合米蘭標準的HCC 患者，肝移植是一種更徹底的手術方式；但由于肝移植供體有限及存在移植后復發(fā)的問題[14]，應將器官分配給具有最佳長期生存機會的患者。研究發(fā)現(xiàn)，對于MVI 陽性的HCC 患者，采用解剖切除和肝移植的5年生存率相似[15]，考慮到肝移植供體有限，對此類患者應首先考慮解剖切除而非肝移植。

綜上，術前預測MVI，有助于HCC 患者的精準治療，幫助提高患者生存率及篩選最佳肝移植受者。但目前MVI 只能在術后病理檢查中確認，因此，如何在術前準確預測MVI 的發(fā)生顯得尤為重要。

3 術前MVI 的預測

目前，國內外學者主要從影像學、常規(guī)血清蛋白標志物、新型分子標志物等方面對MVI 進行術前預測，并致力于構建效能更高的MVI 預測模型。

3.1 影像學

先前的研究大多致力于探索腫瘤的大小、數(shù)量、邊緣狀態(tài)、包膜完整度等影像學特征在MVI 預測方面的意義，這在先前發(fā)表的研究[16]中已有總結，此處不再贅述。近年來，有研究深入探討新型影像學分析技術在預測MVI 方面的價值。Cao 等[17]發(fā)現(xiàn)擴散峰度成像（diffusion kurtosis imaging，DKI）對預測HCC的MVI 和組織學分級具有重大的診斷價值。Zhu 等[18]通過對比增強磁共振成像（contrast-enhanced magnetic resonance imaging，CE-MRI）紋理分析提取了58 個特征，發(fā)現(xiàn)CE-MRI 紋理分析可作為預測MVI 的潛在工具。相比于傳統(tǒng)影像學預測指標（如腫瘤邊緣、包膜形成等），紋理分析可以從放射影像中自動提取定量特征，解決了影像學指標解讀主觀性強、可靠性差的問題。Sabaté-Llobera 等[19]通過分析HCC 患者PET/CT 圖像中2-[18F]FDG 的攝取情況來識別腫瘤的組織學特征，發(fā)現(xiàn)病變處注射FDG 60 min 后的標準化攝取值峰值（standardized uptake value peak，SULpeak）及瘤肝比（tumor-to-liver ratio,TLR）是預測MVI的最佳參數(shù)。

3.2 常規(guī)血清蛋白標志物

目前也有研究致力于尋找預測MVI 的血清學標志物。研究表明，AFP≥200 ng/mL[20]、異常凝血酶原（DCP，又稱PIVKA-Ⅱ）＞40 mAU/mL[21]可以預測MVI 的發(fā)生，但以上指標在肝硬化等患者中也可能升高，其預測MVI 發(fā)生的特異性不高。Ding 等[22]則發(fā)現(xiàn)血清對氧磷酶1（PON1）＜191.12 ng/mL 可以預測MVI 的發(fā)生，其曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.754；當聯(lián)合PON1 和AFP 兩個血清學指標預測MVI 時，其AUC 提高到0.785。

3.3 新型分子標志物

隨著分子生物學技術的發(fā)展，一些新型分子標志物在MVI 預測方面的價值逐漸受到重視。微小RNA（microRNA,miRNA）是小的非編碼RNA，其通過抑制信使RNA（messenger RNA,mRNA）翻譯或促進mRNA 降解在轉錄后水平調節(jié)基因表達，在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著作用。Liu 等[23]發(fā)現(xiàn)miR-125b 是MVI 的獨立預測因素，其預測MVI 發(fā)生的特異性為51.32%，敏感性為87.50%。研究表明，血管增生與MVI 的發(fā)生密切相關[24]，低水平miR-497 可能通過影響VEGF 信號通路參與HCC 的腫瘤血管生成，進而促進MVI 的發(fā)生，但其預測MVI 的能力有待進一步研究[25]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是轉錄長度超過200 nt 的非編碼RNA，通過與蛋白質、RNA 或DNA 相互作用調節(jié)基因表達，促進或抑制癌癥的發(fā)生發(fā)展。Lu 等[26]發(fā)現(xiàn)Lnc-TSPAN12 可以將HCC 中的MVI 和非MVI 患者區(qū)分開來，其AUC 達到0.855。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是真核生物中具有組織特異性和細胞特異性表達模式的共價封閉內源性RNA 分子，通過調節(jié)翻譯過程或影響蛋白質功能在癌癥中發(fā)揮作用。Wang等[27]則發(fā)現(xiàn)circSETD3 是MVI 發(fā)生的獨立危險因素，其與PIVKA-Ⅱ聯(lián)合預測MVI 的AUC 為0.736。

3.4 多指標聯(lián)合預測模型

近年來，越來越多的研究致力于構建多指標聯(lián)合預測模型對MVI 進行預測，以期提高MVI 預測的準確性。Deng 等[28]首次將NLR 納入MVI 預測模型，并結合腫瘤大小和術前AFP 水平建立了諾模圖，該模型的靈敏度和特異性分別為61.64%和71.53%；基于此模型預測的MVI 低危亞組患者，即使不符合米蘭標準也可以接受肝移植。另有一些模型以影像學指標為主，趙暉等[29]研究結合瘤內動脈（動脈期或門靜脈期腫瘤內部出現(xiàn)的非連續(xù)的、扭曲的強化動脈）、無完整瘤周高密度環(huán)影（在靜脈期或延遲期包繞腫瘤的完整的、薄層的高密度環(huán)）和不規(guī)則的腫瘤邊界三個因素建立了MVI 預測模型，其AUC 高達0.856；此模型的預測評分≥3 分提示MVI 高風險，推薦行解剖學切除治療。還有研究構建了基于機器學習算法的MVI預測模型，Yao 等[30]利用基于SR 和LibSVM 的影像組學分析系統(tǒng)從多模式超聲圖像中提取了2 560 個特征并建立了影像組學模型對MVI 進行術前預測，其中SR 算法可以過濾冗余特征，有效避免過度擬合問題；LibSVM 分類器可以解決樣本類別分布不均衡的問題，與之前的影像學研究相比，此模型表現(xiàn)出更好的MVI 預測性能（AUC=0.98）。Jiang 等[31]開發(fā)了一種整合影像組學特征（機器自動識別特征）、放射學特征（手動提取特征）和臨床變量的RRC 模型和一種由單個神經(jīng)網(wǎng)絡自動提取特征和構建模型的更高效的3D-CNN 模型，這兩種機器學習模型均表現(xiàn)出較好的MVI 預測性能，其AUC 分別達到0.887 和0.906。其中，相比于依賴專家定義進行特征提取的RRC 模型，3D-CNN 模型只需輸入圖像即可實現(xiàn)MVI 的智能識別，有利于MVI 最佳預測模型的構建，并節(jié)約了人力物力資源。

綜上，現(xiàn)階段已經(jīng)涌現(xiàn)出大量的MVI 預測指標，但目前這些指標尚存在較多不足：1）目前研究涉及的MVI 預測指標的準確度尚未達到臨床要求，亟需找到靈敏度高、特異性好的新型MVI 預測標志物。2）現(xiàn)有預測指標及其閾值大多由單一機構研究確立，樣本量不足且缺乏臨床實踐檢驗，需要更多外部驗證并檢驗其可靠性。3）不同預測模型納入的預測因素各不相同，難以相互比較，且部分影像學指標的判讀主觀性較強，難以進行標準化。

4 液體活檢在MVI 預測方面的潛在價值

目前尚未找到靈敏度高、特異性好的MVI 預測標志物，加之HCC 具有較高的腫瘤異質性[32]，進一步增大了尋找可靠預測MVI 標志物的難度。近年來液體活檢的發(fā)展為腫瘤診斷帶來了巨大機遇，它是指從人體體液（如血液、尿液、唾液和腦脊液等）中獲取疾病信息的技術，其檢測對象主要包括循環(huán)腫瘤DNA、循環(huán)腫瘤細胞和外泌體，具有快速、簡便、無創(chuàng)傷、實時動態(tài)的優(yōu)勢，且可以克服腫瘤異質性[33]。

4.1 循環(huán)腫瘤DNA

循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是指外周血中存在的帶有腫瘤特異性的遺傳或表觀遺傳學改變的DNA 片段，無創(chuàng)易得且術前即可通過外周血富集得到。已有研究表明，腫瘤細胞DNA 突變可以賦予腫瘤細胞更強的侵襲能力[34]，且理論上發(fā)生血管侵犯后ctDNA 更易檢出[35]，加之ctDNA 突變可以克服腫瘤異質性及與HCC 腫瘤組織突變具有良好的一致性[36]，能夠更加全面地反映HCC 腫瘤基因組的全貌，提示其是一種極具潛力的MVI 預測標志物。Wang 等[35]發(fā)現(xiàn)術前ctDNA 陽性及術后ctDNA 突變等位基因頻率（mutant allele frequency，MAF）升高與MVI 的發(fā)生有關，但該研究僅納入四個熱點突變，可能會導致檢出率較低，且無法全面反映腫瘤相關基因和通路在MVI 發(fā)生中的潛在作用機制。Wang 等[37]通過對術前外周血和術中腫瘤組織中1 021 個與實體瘤相關的基因進行靶向深度測序，證實ctDNA 等位基因頻率（allele frequency，AF）與MVI 的相關性。以ctDNA AF＞0.83%為臨界值來預測MVI 的發(fā)生，其靈敏度達78.6%，特異度達81.8%，但此研究為中等隊列研究，亟需擴大樣本量對研究結果進行驗證。

4.2 循環(huán)腫瘤細胞

循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）是在腫瘤發(fā)生過程中由原發(fā)腫瘤或轉移灶脫落釋放入外周血的腫瘤細胞，可以直觀反映出患者體內活體腫瘤細胞的特性。已有研究表明，CTC 與HCC 不良預后和術后復發(fā)轉移相關，有學者進一步探索了CTC 與HCC MVI 之間的關系。Zhou 等[38]發(fā)現(xiàn)術前CTC 數(shù)量≥5 個/5 mL 是HCC 中MVI 發(fā)生的獨立預測因素，且其預測MVI 發(fā)生的能力（AUC=0.856）比AFP（AUC=0.636）和腫瘤直徑（AUC=0.604）的預測能力更高。He 等[39]則發(fā)現(xiàn)，當CTC 數(shù)量≥3 個/3.2 mL 時，其預測HCC 中MVI 發(fā)生的AUC 值達到0.857，進一步將其納入包含AFP、DCP、CTC、最大腫瘤直徑和腫瘤邊緣不光滑度5 個指標在內的MVI 預測模型中，其靈敏度和特異性分別達到86.49% 和90.20%?，F(xiàn)階段CTC 已經(jīng)表現(xiàn)出較好的HCC MVI 預測價值，但尚缺少高靈敏度的CTC 檢出方法[40]，CTC 在MVI 預測中的作用仍需進一步探索。

4.3 外泌體

外泌體是體內幾乎所有細胞（包括腫瘤細胞）分泌的一類包含多種生物分子,如mRNA、miRNA、lncRNA 和蛋白質等在內的細胞外膜性囊泡，含量豐富，且其磷脂雙層膜可以保護外泌體內容物不被降解，穩(wěn)定性高，是極具潛力的腫瘤診斷標志物。外泌體可被附近或遠處的細胞吸收后發(fā)揮調節(jié)作用，在重塑腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）、免疫調節(jié)反應和腫瘤轉移等方面有著重要作用[41]。有研究表明，外泌體可以促進HCC 的生長和侵襲轉移[42]。Chen 等[42]研究發(fā)現(xiàn)外泌體可以實現(xiàn)高轉移性MHCC97H 細胞和低轉移性HCC 細胞之間的通訊交流，從而增加低轉移性HCC 細胞的侵襲轉移能力。Li 等[43]發(fā)現(xiàn)外泌體中存在的LOXL4 可以通過FAK/Src 途徑和促進HCC 血管生成來促進HCC 的肝內轉移。因此推測，外泌體也可能是一種極具潛力的MVI 預測標志物，但目前尚無相應研究，其價值有待挖掘。

值得注意的是，現(xiàn)階段液體活檢在預測MVI 發(fā)生中的相關研究主要涉及血液中相關標志物，尚無研究探索血液以外的其他體液（如唾液、尿液等）中的MVI 預測標志物。已有研究證實了唾液中l(wèi)nc-PCDH9-13:1、尿液中TP53突變及RASSF1A和GSTP1異常甲基化在預測HCC 發(fā)生和復發(fā)中的作用[44-45]，但唾液和尿液中是否存在預測MVI 發(fā)生的可靠標志有待進一步研究。

5 總結與展望

目前術前預測HCC 中MVI 的研究已經(jīng)取得很大進展，但仍存在一些問題亟需解決：1）MVI 采樣方法尚無國際統(tǒng)一標準[46]。由于MVI 發(fā)生位置不確定，采樣方法不規(guī)范會導致MVI 漏檢，影響MVI 研究結論的可靠性。2015年之前，尚無針對HCC MVI 檢測的采樣指南，也很少有報道闡述MVI 檢測的病理采樣過程，直到2015年，在中國發(fā)布的原發(fā)性肝癌病理診斷的實踐指南中才明確提出了MVI 檢測的“七點基線采樣法”[47]，但該指南目前僅應用于中國[46]，僅在一些大型醫(yī)院得到執(zhí)行，且該采樣方法的可靠性尚未得到驗證，其具體實施仍有待落實。2）缺乏大樣本驗證和多中心研究：現(xiàn)階段關于MVI 預測的研究大多是單一機構研究，樣本量不足且缺乏臨床實踐檢驗，需要更多外部驗證檢驗其可靠性。3）現(xiàn)有研究探索的部分相關指標并不能特異性預測MVI，提示整體惡性程度高[20,22]，仍需要進一步尋找與MVI 直接相關的特異性指標。4）MVI 預測對HCC 精準治療的應用價值仍需探索：目前MVI 僅能通過術后病理檢查確認，因此現(xiàn)階段MVI 狀態(tài)與HCC 術式選擇仍處于回顧性研究階段。MVI 預測對指導HCC 精準治療的真實臨床價值，還需在建立起可靠的MVI 術前預測模型的基礎上進行前瞻性研究。

目前已發(fā)現(xiàn)大量指標與MVI 有關，但仍難以準確預測MVI，新型分子預測標志物尤其是液體活檢的出現(xiàn)及基于機器學習算法建立模型對術前預測MVI提供了可行的思路。未來還需進一步規(guī)范MVI 采樣、探索MVI 新標志物、聯(lián)合新標志物構建預測性能更好的預測模型并進行多中心驗證，前瞻性評價其臨床應用價值。