人滋養(yǎng)層干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

陳娟 馬征來 盧永收 潘文霞 武傳葉 孫美英 李超

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科，山東 青島 266003； 2 臨沂市婦幼保健院產(chǎn)科)

細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞(CTB)來自于胚胎的滋養(yǎng)外胚層[1-2]，被稱為人滋養(yǎng)層干細(xì)胞(hTSCs),在胚胎植入早期可分化為兩種表型，一種是彼此融合形成的合體滋養(yǎng)細(xì)胞(ST)，參與胎盤的營(yíng)養(yǎng)、代謝、內(nèi)分泌等過程；另一種是絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞(EVT)，位于胎盤絨毛的尖端處，具有從胎盤尖端向子宮間質(zhì)和肌層血管遷移和侵襲性生長(zhǎng)的能力[3]。滋養(yǎng)層細(xì)胞(TB)是胎盤功能的主要承擔(dān)者[4-5]，反復(fù)自然流產(chǎn)、早產(chǎn)、妊娠期高血壓、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限等均與TB生物學(xué)功能異常有關(guān)[6-7]。由于人類胎盤的體內(nèi)研究存在倫理學(xué)問題[8]，因此通過體外培養(yǎng)方法獲得足夠數(shù)量且可靠穩(wěn)定的hTSCs成為TB生物學(xué)功能研究的關(guān)鍵[9-10]。目前已經(jīng)成功構(gòu)建了大鼠、小鼠、恒河猴等多種動(dòng)物的胎盤模型[1，11]。1998年首次從小鼠的囊胚和胚外外胚層中分離出小鼠滋養(yǎng)層干細(xì)胞(mTSCs)[12]。2018年又從人類妊娠早期的絨毛組織中分離出具有分化為TB潛能的細(xì)胞株，命名為TSCT，接著通過該培養(yǎng)體系又從人類囊胚培養(yǎng)獲得與TSCT形態(tài)相似的細(xì)胞株，命名為TSblast，且TSblast的分子特征、轉(zhuǎn)錄水平以及分泌功能與妊娠早期胎盤的TB相似[13-14]。本研究在綜合分析先前培養(yǎng)方案的基礎(chǔ)上，對(duì)培養(yǎng)方法進(jìn)行改進(jìn)，以分離培養(yǎng)hTSCs，為TB相關(guān)生理和病理機(jī)制的研究提供體外模型?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

收集臨沂市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科患者自愿捐贈(zèng)常規(guī)體外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期為5～6 d的新鮮正常囊胚8枚，置于玻璃化冷凍后液氮罐中長(zhǎng)期保存。Y-27632購(gòu)自美國(guó)Stemgent公司，山羊抗小鼠IgG(H&L)(Alexa Fluor?488)、山羊小鼠IgG(H&L)多克隆二抗(Alexa Fluor?555)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，SB 431542購(gòu)自英國(guó)Tocris公司，ITS-X supplement、A83-01、VPA購(gòu)買于日本W(wǎng)ako公司，β-estradiol購(gòu)于德國(guó)Sigma公司，Anti-HLA-G購(gòu)自美國(guó)MBL公司。

1.2 方法

1.2.1hTSCs的培養(yǎng)與細(xì)胞核型分析 hTSCs培養(yǎng)基由DMEM/F12(體積分?jǐn)?shù)0.94)、β-硫基乙醇(0.1 mmol/L)、胎牛血清(體積分?jǐn)?shù)0.20)、青霉素鏈霉素雙抗(體積分?jǐn)?shù)0.005)、牛血清白蛋白(體積分?jǐn)?shù)0.03)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒培養(yǎng)基補(bǔ)充劑(體積分?jǐn)?shù)0.01)、維生素C(1.5 mg/L)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(50 μg/L)、CHIR99021(2 μmol/L)、A83-01(0.5 μmol/L)、Y27632(5 μmol/L)、SB431542(1 μmol/L)及VPA(0.8 mmol/L)共同配制而成。①hTSCs培養(yǎng)：囊胚解凍后置于囊胚培養(yǎng)液中再培養(yǎng)2 h，去除透明帶，轉(zhuǎn)移至hTSCs培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至第6天獲得第1代hTSCs，于體式鏡下用顯微切割針將貼壁生長(zhǎng)組織切割成4～8塊，接種于4孔培養(yǎng)皿中；培養(yǎng)至第14天得到第2代hTSCs，以TryPLE消化成單細(xì)胞，接種于3.5 cm培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)、傳代、凍存，供后續(xù)試驗(yàn)使用。②細(xì)胞核型分析：選擇處于指數(shù)增殖期且生長(zhǎng)旺盛的第7代hTSCs，以秋水仙素處理后，拍照觀察細(xì)胞核型。

1.2.2細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)hTSCs中轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白2C(TFAP2C)、細(xì)胞角蛋白7(CK7)以及轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合蛋白3(GATA-3)的表達(dá) 以40 g/L多聚甲醛固定第8代hTSCs 15 min，再用3 g/L Triton X-100孵育透膜1 h；以體積分?jǐn)?shù)0.10的FBS+體積分?jǐn)?shù)0.03的BSA室溫封閉0.5 h；然后分別加一抗(1∶200)、二抗(1∶1 000)，加入DAPI襯染細(xì)胞核后共聚焦顯微鏡觀察拍照，隨機(jī)選取100個(gè)hTSCs，計(jì)算熒光細(xì)胞數(shù)量，以百分比表示。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)hTSCs中相關(guān)基因的表達(dá) 取第8、16代 hTSCs，分別采用 Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，以此為模板進(jìn)行RT-qPCR。根據(jù)試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，以U6作為內(nèi)參照，每個(gè)樣品分別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。采用2-△△CT計(jì)算樣本中TFAP2C、CK7、GATA-3以及TEA轉(zhuǎn)錄因子4(TEAD4)基因的相對(duì)表達(dá)水平。引物名稱及其序列見表1。

表1 引物名稱及其序列

1.2.4Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)hTSCs侵襲能力 將第9代hTSCs以每孔2.5×104個(gè)細(xì)胞接種于Trasnwell上室，下室為hTSCs培養(yǎng)基(未分化組)，同時(shí)再將第9代hTSCs以每孔2.5×104個(gè)細(xì)胞接種于Trasnwell上室，下室為分化培養(yǎng)基(分化組)，分別培養(yǎng)2、4、6 d。分化培養(yǎng)基的配制方法為：DMEM/F12(體積分?jǐn)?shù)0.90)、β-硫基乙醇(0.1 mmol/L)、青霉素鏈霉素雙抗(體積分?jǐn)?shù)0.005)、牛血清白蛋白(體積分?jǐn)?shù)0.03)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒培養(yǎng)基補(bǔ)充劑(體積分?jǐn)?shù)0.01)、A83-01(7.5 μmol/L)、Y27632(2.5 μmol/L)、NRG1(100 mg/L，第3天撤掉)、KOSR(體積分?jǐn)?shù)0.04，第6天撤掉)。分別以免疫熒光法檢測(cè)兩組hTSCs培養(yǎng)至第2、4、6天時(shí)穿過transwell微孔的細(xì)胞數(shù)量，以及穿過transwell微孔的細(xì)胞中膠質(zhì)細(xì)胞缺失因子1(GCM1)的表達(dá)情況，計(jì)算表達(dá)GCM1的細(xì)胞比例。實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔重復(fù)測(cè)量4次，結(jié)果取均值。

1.2.5hTSCs分化能力以及內(nèi)分泌功能的檢測(cè)按照培養(yǎng)基不同將第9代hTSCs設(shè)置為分化組(hTSCs培養(yǎng)基)與未分化組(分化培養(yǎng)基)，分別采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)兩組細(xì)胞中CK7、多配體蛋白聚糖-1(SDC-1)、人絨毛膜促性腺激素(β-hCG)和整合素α5(ITGA5)基因的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔重復(fù)測(cè)量4次，結(jié)果取均值。待兩組第9代hTSCs細(xì)胞密度約達(dá)80%時(shí)，將1×105個(gè)細(xì)胞分別接種于hTSCs培養(yǎng)基與分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，使用全自動(dòng)免疫檢驗(yàn)系統(tǒng)檢測(cè)兩組培養(yǎng)第2～6天時(shí)培養(yǎng)基中雌二醇和孕酮的濃度。實(shí)驗(yàn)設(shè)8個(gè)復(fù)孔，每孔重復(fù)測(cè)量4次，結(jié)果取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 hTSCs細(xì)胞核型分析

8枚正常囊胚成功培養(yǎng)出4株hTSCs。對(duì)第7代hTSCs進(jìn)行核型分析，結(jié)果顯示為雌性(46，XX)3株，雄性(46，XY)1株，均具有正常細(xì)胞核型。

2.2 hTSCs中TFAP2C、CK7、GATA3檢測(cè)結(jié)果

免疫熒光技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，95%以上第8、16代hTSCs均表達(dá)TFAP2C、CK7和GATA3(圖1)。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，第8代hTSCs中CK7、GATA3、TFAP2C、TEAD4的相對(duì)表達(dá)量分別為0.41±0.11、0.15±0.03、0.16±0.08、0.03±0.11，第16代hTSCs中CK7、GATA3、TFAP2C、TEAD4的相對(duì)表達(dá)量分別為0.52±0.86、0.14±0.01、0.16±0.02、0.02±0.13，兩代間各基因表達(dá)量比較差異無顯著性(P>0.05)。

A：TFAP2C的表達(dá)情況，B：CK7的表達(dá)情況，C：GATA的表達(dá)情況，D：DAPI襯染細(xì)胞核，免疫熒光法，400倍

2.3 hTSCs侵襲能力檢測(cè)結(jié)果

析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示，時(shí)間、組別及時(shí)間組別的交互作用對(duì)穿過trasnswell微孔的細(xì)胞數(shù)量均存在有明顯影響(F組別=316.37，F(xiàn)時(shí)間=414.64，F(xiàn)交互=19.29，P<0.05)；單獨(dú)效應(yīng)分析顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組穿過trasnswell微孔的細(xì)胞數(shù)量差異有顯著性(F=255.81、178.12，P<0.05)；第2、4、6天兩組穿過trasnswell微孔的細(xì)胞數(shù)量比較差異具有顯著性(F=53.31～234.55、67.10，P<0.05)。析因設(shè)計(jì)方差分析表明，分組、時(shí)間及其交互作用對(duì)穿過trasnswell微孔的細(xì)胞表達(dá)GCM1的比例有顯著影響(F分組=114.58，F(xiàn)時(shí)間=338.80，F(xiàn)交互=33.40，P<0.05)；單獨(dú)效應(yīng)分析顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，兩組穿過trasnswell微孔的細(xì)胞表達(dá)GCM1的比例差異具有顯著性(F=288.92、83.28，P<0.05)，第4、6天兩組差異有顯著性(F=50.25、131.13，P<0.05)。見表2。

表2 分化組與未分化組hTSCs侵襲能力比較

2.4 hTSCs體外分化能力及內(nèi)分泌功能檢測(cè)結(jié)果

RT-qPCR的檢測(cè)結(jié)果顯示，未分化組中CK7、SDC-1、β-hCG和ITGA5表達(dá)水平分別為9.2±2.3、7.1±1.4、34.4±3.2和27.2±1.9，分化組CK7、SDC-1、β-hCG和ITGA5表達(dá)水平分別為15.1±5.2、13.2±2.4、62.1±4.2和32.2±3.4。與未分化組相比較，分化組中各基因的表達(dá)水平均顯著升高(t=-6.78～-2.51，P<0.05)。析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示，分組、時(shí)間及其交互作用均對(duì)培養(yǎng)基中雌二醇的濃度具有顯著影響(F分組=387.87，F(xiàn)時(shí)間=33.68，F(xiàn)交互=17.56，P<0.05)；單獨(dú)效應(yīng)分析顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)兩組培養(yǎng)基中雌二醇的濃度差異有顯著性(F=42.03、9.21，P<0.05)，第2、4、6天兩組培養(yǎng)基中雌二醇的濃度比較差異均具有顯著性(F=43.68～210.18，P<0.05)。析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示，分組、時(shí)間及其交互作用均對(duì)培養(yǎng)基中孕酮的濃度有顯著影響(F分組=637.87，F(xiàn)時(shí)間=71.31，F(xiàn)交互=17.56，P<0.05))；單獨(dú)效應(yīng)分析顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)兩組培養(yǎng)基中孕酮的濃度比較差異有顯著性(F=87.66、125.32，P<0.05)，第2、4、6天分兩組培養(yǎng)基中孕酮的濃度比較差異均具有顯著性(F=25.06～225.62，P<0.05)。見表3。

表3 分化組與未分化組hTSCs內(nèi)分泌功能檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

TB在人類囊胚植入、胎盤形成以及妊娠維持過程中起到非常重要的作用,妊娠早期TB的異常分化會(huì)導(dǎo)致胎盤相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生[15-16]。然而，受倫理和技術(shù)方面的限制，臨床中要想獲得足夠數(shù)量的早期妊娠原代TB非常困難。目前關(guān)于小鼠TB發(fā)育機(jī)制的研究取得了一定的進(jìn)展，但人和小鼠的胎盤形成存在差異。因此，迫切需要一種可靠、穩(wěn)定的可用于體外研究的人類TB[5,17]。

本研究中，使用8枚正常囊胚成功培養(yǎng)出4株hTSCs，對(duì)第7代hTSCs進(jìn)行細(xì)胞核型分析，結(jié)果顯示為雌性(46，XX)3株，雄性(46，XY)1株，均具有正常核型。研究顯示，mTSCs的形成和腫瘤壞死因子-β(TGF-β)、成纖維生長(zhǎng)因子(FGF)信號(hào)通路有關(guān)，而hTSCs的形成則和Wing-less/Integrated(Wnt)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)信號(hào)通路有關(guān)，因此無法直接套用小鼠的培養(yǎng)體系獲取hTSCs。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)期間首先使用小鼠的mTSCs培養(yǎng)體系獲取hTSCs，細(xì)胞呈現(xiàn)克隆樣生長(zhǎng)，表達(dá)TB標(biāo)記物并且可以穩(wěn)定傳代。當(dāng)更換為hTSCs的培養(yǎng)體系后，hTSCs呈現(xiàn)纖維細(xì)胞樣上皮形態(tài)，仍然可以穩(wěn)定表達(dá)TB標(biāo)記物并且穩(wěn)定傳代。此現(xiàn)象能夠表明hTSCs的細(xì)胞內(nèi)既存在TGF-β、FGF信號(hào)通路，也存在WNT、EGF信號(hào)通路，具體的信號(hào)調(diào)節(jié)通路仍待進(jìn)一步探究。

先前的研究顯示，TFAP2C、GATA3、CK7等為hTSCs特有標(biāo)記物[18]。本研究免疫熒光顯示95%以上第8、16代hTSCs能夠表達(dá)TFAP2C、CK7以及GATA3；RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果則顯示，CK7、GATA3、TFAP2C、TEAD4基因的相對(duì)表達(dá)量分別在兩代中無顯著性的差異。免疫熒光技術(shù)以及RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，本研究培養(yǎng)獲得的細(xì)胞均表達(dá)以上標(biāo)記物，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)穩(wěn)定，因此可鑒定為hTSCs細(xì)胞。目前，許多細(xì)胞系，包括絨毛膜癌細(xì)胞系、永生化細(xì)胞系和BMP4處理的人胚胎干細(xì)胞(ESC)等，均已被用作TB細(xì)胞的模型。然而此類永生化細(xì)胞系(如HTR8/SVneo)和BMP4處理的人類ESC均不符合LEE等[19]于2016年提出的hTSCs標(biāo)記物鑒定標(biāo)準(zhǔn)。一些絨毛膜癌細(xì)胞系雖然符合上述標(biāo)準(zhǔn)，但它們的轉(zhuǎn)錄組譜被認(rèn)為與原代TB的轉(zhuǎn)錄組譜截然不同。而通過激活Wnt、EGF信號(hào)通路，并抑制TGF-β、組蛋白脫乙酰化酶、Rho相關(guān)蛋白激酶信號(hào)通路，可從人類妊娠早期的絨毛組織獲得具有分化為三種主要TB的細(xì)胞株，將其命名為TSCT細(xì)胞，與此同時(shí)通過該培養(yǎng)體系也可以從人類囊胚培養(yǎng)獲得與TSCT細(xì)胞相似的細(xì)胞株，將其命名為TSblast細(xì)胞，該細(xì)胞的分子特征、轉(zhuǎn)錄水平及分泌功能與妊娠早期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞相似[13-14]。但本團(tuán)隊(duì)按照上述培養(yǎng)方法進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，均無法培養(yǎng)獲得hTSCs，在綜合分析了以上研究的培養(yǎng)方案后，又根據(jù)我院實(shí)驗(yàn)室前期的工作基礎(chǔ)對(duì)培養(yǎng)方法進(jìn)行了改進(jìn)和探索。

本研究Trasnswell結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，分化組第2、4、6天穿過trasnswell微孔的細(xì)胞數(shù)量均多于未分化組，表明與未分化組相比，分化組具有更強(qiáng)的侵襲能力。GCM1是一種胎盤特異性轉(zhuǎn)錄因子，在CTB、ST和EVT中均有表達(dá)[20-21],GCM1通過調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白表達(dá)來介導(dǎo)TB融合和侵襲[22-23]。因此，GCM1對(duì)胎盤細(xì)胞分化和侵襲至關(guān)重要。本研究中，第2天分化組與未分化組中穿過trasnswell微孔的細(xì)胞表達(dá)GCM1比例無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，第4、6天分化組均顯著高于未分化組，表明隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，分化組hTSCs中的GCM1表達(dá)比例顯著高于未分化組，與體內(nèi)胎盤發(fā)育規(guī)律相一致。

胎盤作為內(nèi)分泌器官，將激素分泌到母體和胎兒循環(huán)中，從而影響妊娠結(jié)局[24]。ST是正常妊娠所需的關(guān)鍵激素，如人絨毛膜促性腺激素(hCG)和胎盤催乳素[25]、雌二醇、孕酮、神經(jīng)遞質(zhì)以及抑制素等[19]。hCG是一種由α亞單位和β亞單位組成的二聚體，由CGB基因編碼。hCG在刺激孕酮生成中起著關(guān)鍵作用，是反應(yīng)妊娠發(fā)生的重要檢測(cè)指標(biāo)，本研究所收集的培養(yǎng)基上清液中hCG濃度低于我院檢驗(yàn)科儀器的最低檢測(cè)濃度，故本研究沒有對(duì)該指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)培養(yǎng)基中雌二醇和孕酮的濃度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示分化組第2、4、6天培養(yǎng)基當(dāng)中雌二醇、孕酮濃度均高于未分化組，符合胚胎著床時(shí)期激素分泌規(guī)律。

綜上所述，本研究培養(yǎng)獲得的hTSCs具有正常核型，免疫熒光技術(shù)以及RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，hTSCs均表達(dá)hTSCs特有標(biāo)記物，侵襲能力、分化能力、分泌功能等方面的檢測(cè)結(jié)果也顯示與體內(nèi)TB相似，證明培養(yǎng)成功，所構(gòu)建的培養(yǎng)體系適合hTSCs生長(zhǎng)，這將為進(jìn)一步研究人類TB的發(fā)育和功能提供有力的工具。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest：All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有試驗(yàn)均已通過臨沂市婦幼保健院科學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)(文件號(hào)：KYL-YXLL-2021014)。所有試驗(yàn)過程均遵照《人體醫(yī)學(xué)研究的倫理準(zhǔn)則》的條例進(jìn)行。受試對(duì)象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

EthicsApprovalandPatientConsent：All experimental protocols in this study were reviewed and approved by The Sicentific Ethics Committee of Linyi Maternal and Child Healthcare Hospital(Approval Letter No.KYL-YXLL-2021014), and all experimental protocols were carried out by following The Ethical Guidelines for Human Medical Research.Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻(xiàn)：陳娟、馬征來、盧永收、潘文霞、武傳葉、孫美英和李超均參與了研究設(shè)計(jì)以及論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions：CHENJuan,MAZhenglai,LUYongshou,PANWenxia,WUChuanye,SUNMeiying, andLIChaoall participated in the research design, as well as the writing and revision of the paper.All the authors have read the last version of the paper and consented submission.