響應(yīng)面法優(yōu)化中性氧化鋁對(duì)積雪草提取物的脫色工藝研究

姚永謀，張遠(yuǎn)芳，劉芳，方會(huì)龍，劉青，劉澤，王俊杰，黃建華

（1.湘南學(xué)院藥學(xué)院，湖南 郴州 423000；2.湘南學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 郴州 423000；3.湘南學(xué)院護(hù)理學(xué)院，湖南 郴州 423000）

積雪草為傘形科植物積雪草［Centella asiatica（L.）Urb.］的干燥全草，用于濕熱黃疸、中暑腹瀉、石淋血淋、癰腫瘡毒、跌撲損傷［1］。在我國(guó)主要分布于華東、華南、中南及西南等地［2］。積雪草主要含有三萜及其苷類(lèi)、揮發(fā)油、黃酮類(lèi)、生物堿等化合物［3］，積雪草總苷作為其主要藥用活性成分近年來(lái)被研究的比較多，其中積雪草苷具有神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤、抗缺血再灌注損傷、抗支架再狹窄、保護(hù)肺臟等多方面作用［4］，羥基積雪草苷在臨床上被用于抗炎抗氧化、抗抑郁癥、抗腫瘤、皮膚增白、治療燒傷性瘢痕、增強(qiáng)記憶、防治冠心病、心肌梗死、腦血栓、腦梗死等［5-6］。目前對(duì)于積雪草中積雪草總苷等有效成分的脫色研究主要采用的是活性炭脫色，常用于化妝品工業(yè)中［7］。最近也有文獻(xiàn)報(bào)道氧化鋁對(duì)積雪草有效成分也具有脫色效果［8］，但這些研究?jī)?nèi)容均不夠詳細(xì)充分或者只對(duì)羥基積雪草苷等單一成分進(jìn)行了相關(guān)研究，而積雪草提取物含有的成分較多，影響其脫色等品質(zhì)提升的因素也較多，關(guān)于積雪草總苷提取物的脫色研究筆者尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。因此，本文在已有研究基礎(chǔ)上，以脫色率為主要考察指標(biāo)，結(jié)合積雪草總苷含量和回收率等結(jié)果，利用響應(yīng)面法［9-10］進(jìn)一步研究中性氧化鋁對(duì)積雪草總苷提取物的脫色效果，并對(duì)中性氧化鋁用量、溫度、時(shí)間以及pH值等影響條件進(jìn)行優(yōu)化，以期得到最優(yōu)的脫色條件。本研究可以為積雪草提取物的品質(zhì)提升和開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

2020年采自于湖南省郴州市蘇仙區(qū)白露塘地區(qū)的積雪草原料，經(jīng)湘南學(xué)院王俊杰教授鑒定為傘形科植物積雪草［Centella asiatica（L.）Urb.］的干燥全草，經(jīng)干燥破碎后，進(jìn)行乙醇回流提取，提取物再經(jīng)硅膠柱分離得到棕黃色的積雪草提取物粉末，其中積雪草總苷含量為65.4%，羥基積雪草苷為42.0%，積雪草苷為23.3%。

1.2 儀器與試劑

Agilent 1260 InfinityⅡ液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；AUW120D分析天平（島津儀器有限公司）；KQ-600DE超聲清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；RCT-B-S25恒溫磁力攪拌器（德國(guó)IKA公司）；UVmini-1280紫外分光光度計(jì)（島津儀器有限公司）；SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

羥基積雪草苷（純度＞98%，批號(hào)：PRF8032843，成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司）；積雪草苷（純度＞98%，批號(hào)：PRF7082702，成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司）；95%乙醇（分析純，湖南匯虹試劑有限公司）；怡寶純凈水（市購(gòu)）；中性氧化鋁（100～200目，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法

2.1 原料脫色

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2 g積雪草提取物粉末，用10 mL 50%乙醇超聲溶解，然后加入一定量過(guò)100～200目篩的中性氧化鋁粉末，并在一定的溫度、時(shí)間以及pH值等條件下進(jìn)行攪拌脫色得到脫色溶液，經(jīng)濃縮干燥后得到脫色產(chǎn)品。

2.2 脫色率的計(jì)算

取脫色溶液用50%乙醇稀釋150倍后在204 nm波長(zhǎng)下用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，扣除溶劑背景后計(jì)算脫色率。

脫色率［11］=（脫色前吸光度-脫色后吸光度）/脫色前吸光度×100%。

2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用中性氧化鋁用量、脫色溫度、脫色時(shí)間、pH值作為考察因素，根據(jù)“2.1”項(xiàng)操作進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察4個(gè)因素對(duì)積雪草總苷提取物脫色效果的影響。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步以X1（中性氧化鋁用量）、X2（脫色時(shí)間）、X3（脫色溫度）、X4（pH值）為考察因素，應(yīng)用Design-Expert 11軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇合適的響應(yīng)面因素和水平，以脫色率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Tab.1 Response surface test factor level

2.5 含量測(cè)定

2.5.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取積雪草苷4.25 mg、羥基積雪草苷7.86 mg置于同一個(gè)5 mL容量瓶中，加入色譜純甲醇超聲溶解后定容至刻度，即得1 mL中分別含積雪草苷0.85 mg、羥基積雪草苷1.572 mg的對(duì)照品混合溶液。

2.5.2 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取積雪草提取物粉末與脫色后的干燥產(chǎn)品各20 mg分別置于25 mL容量瓶中，加入色譜純甲醇超聲溶解后定容至刻度，混勻后過(guò)0.45 μm微孔濾膜，得供試品溶液。

2.5.3 色譜條件

采用島津InertSustain C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；以甲醇：乙腈：水（24：26：50）為流動(dòng)相；等度洗脫，流速為0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為204 nm；進(jìn)樣量為10 μL。對(duì)照品和積雪草提取物樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 積雪草苷、羥基積雪草苷的對(duì)照品（A）和樣品（B）色譜圖Fig.1 Chromatogram of control substances（A）and samples（B）of asiaticoside and madecassoside

2.5.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.5.1”項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液0.1、0.2、0.4、0.5、1.0、2.0 mL到10 mL容量瓶中，加入色譜甲醇定容至刻度，搖勻后按“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄各色譜峰面積。以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)（y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行回歸分析，得到積雪草苷、羥基積雪草苷的線性方程見(jiàn)表2，結(jié)果表明2個(gè)成分在各自的線性范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

表2 積雪草苷與羥基積雪草苷的線性關(guān)系考察Tab.2 The linearity of asiaticoside and madecassoside

2.5.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.5.1”項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液10 μL，按“2.5.3”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，經(jīng)測(cè)定積雪草苷、羥基積雪草苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD）分別為1.33%、0.32%，表明儀器的精密性良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液（“2.5.2”項(xiàng)下的積雪草提取物溶液），按“2.5.3”項(xiàng)色譜條件分別在0、4、8、12、16、24 h進(jìn)行測(cè)定，得到樣品中積雪草苷、羥基積雪草苷峰面積的RSD分別為0.76%、0.61%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.7 重復(fù)性試驗(yàn)

稱(chēng)取該積雪草提取物粉末6份，按“2.5.2”項(xiàng)下的方法制備得到6份供試品溶液，再按“2.5.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定分析，結(jié)果測(cè)得樣品中積雪草苷、羥基積雪草苷含量的RSD分別為1.03%、1.85%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.8 樣品回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取該積雪草提取物粉末6份，分別精密加入不同量的積雪草苷、羥基積雪草苷對(duì)照品，按“2.5.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，取對(duì)照品溶液和供試品溶液，依次進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量，并分別計(jì)算兩種成分的回收率。分別得到積雪草苷的平均回收率為99.50%，RSD=1.54%（n=6），羥基積雪草苷的平均回收率為102.10%，RSD=1.01%（n=6）。

2.5.9 樣品測(cè)定

稱(chēng)取“2.1”項(xiàng)下得到的脫色產(chǎn)品，按照“2.5.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定色譜峰面積，并計(jì)算樣品中積雪草苷、羥基積雪草苷的含量。

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1.1 脫色時(shí)間對(duì)積雪草提取物脫色效果的影響

積雪草提取物溶液在40℃，pH=7下加入0.8 g中性氧化鋁粉末，分別保溫脫色10、15、20、25、30 min時(shí)，得到的脫色效果如圖2A所示。由圖中可知，隨著脫色時(shí)間的增加，積雪草提取物的脫色率呈先上升后趨于平緩趨勢(shì)，其中當(dāng)脫色時(shí)間分別為10、15、20、25、30 min時(shí)，得到的脫色溶液顏色依次為黃色、黃色、淡黃色、略顯淡黃色、略顯淡黃色，且25 min與30 min的脫色時(shí)間對(duì)積雪草提取物的脫色效果相差不明顯，為節(jié)約時(shí)間，選擇脫色時(shí)間為25 min。

3.1.2 脫色溫度對(duì)積雪草提取物脫色效果的影響

積雪草提取物溶液在pH=7下加入0.8 g中性氧化鋁粉末，分別在脫色溫度為25℃、30℃、40℃、50℃、60℃時(shí)保溫脫色25 min，得到的脫色效果如圖2B所示，由圖中可知隨著脫色溫度的增加，積雪草提取物的脫色率呈先上升后下降趨勢(shì)，其中當(dāng)脫色溫度分別25℃、30℃、40℃、50℃、60℃時(shí)，得到的脫色溶液顏色依次為淡黃色、淡黃色、略顯淡黃色、接近無(wú)色、接近無(wú)色。結(jié)合脫色溫度為50℃時(shí)積雪草提取物的脫色率最高，因此選擇脫色溫度為50℃。

3.1.3 PH值對(duì)積雪草提取物脫色效果的影響

積雪草提取物溶液在50℃，分別在pH為5、6、7、8、9時(shí)加入0.8 g中性氧化鋁，保溫脫色25 min，得到的脫色效果如圖2C所示。由圖中可知隨著pH值增加，積雪草提取物的脫色率呈下降趨勢(shì)。其中pH值為5、6、7、8、9時(shí)，得到的脫色溶液顏色依次為無(wú)色、無(wú)色、接近無(wú)色、淡黃色、黃色。且pH值為5與6時(shí)對(duì)積雪草提取物的脫色效果相差不明顯，從條件的溫和程度和對(duì)設(shè)備的要求來(lái)看，選擇pH值為6。

圖2 不同因素對(duì)積雪草提取物脫色效果的影響Fig.2 Effects of different factors on the decolorization of C.asiatica extract

3.1.4 中性氧化鋁用量對(duì)積雪草提取物脫色效果的影響

積雪草提取物溶液在50℃，pH=6下分別加入0.2 g、0.4 g、0.8 g、1.6 g、3.2 g中性氧化鋁粉末時(shí)，保溫脫色25 min，得到的脫色效果如圖2D所示。由圖中可知，隨著中性氧化鋁用量增加，積雪草提取物的脫色率呈上升趨勢(shì)，其中當(dāng)中性氧化鋁用量分別為0.2 g、0.4 g、0.8 g、1.6 g、3.2 g時(shí)，得到的脫色溶液顏色依次為棕黃色、黃色、接近無(wú)色、無(wú)色、無(wú)色。可以看出積雪草提取物的脫色率與中性氧化鋁的用量呈正相關(guān)，但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)中性氧化鋁的用量越多，積雪草提取物中的積雪草總苷成分的損失也越明顯，綜合考慮選擇中性氧化鋁粉末用量為1.6 g，即積雪草提取物的8倍量。

3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到的積雪草提取物的脫色結(jié)果如表3所示。從表中數(shù)據(jù)可知，脫色率最高的為試驗(yàn)8，并結(jié)合脫色后總苷含量與總苷回收率等多個(gè)指標(biāo)，采用了綜合權(quán)重評(píng)分方法確定最優(yōu)的脫色條件。其中綜合權(quán)重評(píng)分=（脫色率×50%+總苷含量×25%+總苷回收率×25%），經(jīng)評(píng)分得到表中最優(yōu)的脫色條件為中性氧化鋁1.6 g、脫色溫度50℃、脫色時(shí)間25 min、pH為6，這與單因素試驗(yàn)的結(jié)果基本吻合，說(shuō)明該響應(yīng)面設(shè)計(jì)的29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)可信度較高。

3.2.2 回歸模型的方差分析

利用Design-Expert 11軟件對(duì)表3中脫色率數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，因總苷含量和總苷回收率數(shù)據(jù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，只需對(duì)脫色率數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得二次多元回歸方程：脫色率Y=40.17+15.46X1+1.07X2+2.11X3-4.22X4-4.11X1X4-4.28X2X3-。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The result of the response surface test

從表4中數(shù)據(jù)可知，該回歸模型P＜0.0001，表明該回歸模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而失擬項(xiàng)P＞0.05不顯著，同時(shí)R2=0.9499與Radj2=0.8998都接近1，表明該模型的可信度較高，對(duì)試驗(yàn)的擬合度較好，從而該回歸方程可代替實(shí)際值對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。另外從X1（中性氧化鋁的用量）與X4（pH值）對(duì)積雪草提取物的脫色效果的影響都極顯著，且結(jié)合F值可判斷4種因素對(duì)脫色效果的影響順序?yàn)椋篨1（中性氧化鋁的用量）＞X4（pH值）＞X3（脫色溫度）＞X2（脫色時(shí)間）。

表4 回歸方程方差分析Tab.4 Analysis of variance of regression equation

3.2.3 兩因素交互影響的響應(yīng)面分析

對(duì)脫色時(shí)間、中性氧化鋁的用量、脫色溫度、pH值四因素進(jìn)行交互作用分析的結(jié)果如圖3所示。依據(jù)響應(yīng)面的坡度和等高線的形狀，從圖中可知，中性氧化鋁用量的響應(yīng)面坡度最陡，pH值次之，再者是脫色溫度，脫色時(shí)間最緩。中性氯化鋁用量與pH值的等高線不呈圓形，交互作用很顯著，而脫色時(shí)間與脫色溫度的等高線呈圓形，交互作用不顯著。分析其原因可能主要是中性氧化鋁作為一種常用的吸附性脫色材料，其作用類(lèi)似于活性炭，用量與脫色效果呈正相關(guān)；同時(shí)積雪草提取物中除了主要的積雪草總苷成分外，可能還有酚酸類(lèi)物質(zhì)的色素，在酸性條件下更有利于中性氧化鋁對(duì)這些色素成分的吸附，使得中性氧化鋁的用量和pH值對(duì)積雪草提取物的脫色起決定性作用。

圖3 不同影響因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface diagram of the interaction of different influencing factors

綜上得到積雪草提取物脫色最優(yōu)條件為：中性氧化鋁為1.562 g、脫色時(shí)間為25.7 min、脫色溫度為50.7℃、pH值為6。

3.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

將響應(yīng)面法得到的積雪草提取物脫色最優(yōu)條件按“2.1”項(xiàng)操作進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到樣品的脫色率實(shí)測(cè)值為81.1%（n=3），與理論值相近，說(shuō)明該方法具有一定的參考性，且脫色后得到的產(chǎn)品中積雪草總苷含量達(dá)到了74.9%，明顯高于原料含量，同時(shí)積雪草總苷的回收率可達(dá)76.4%。

4 討論

本研究首次采用響應(yīng)面法優(yōu)化了中性氧化鋁對(duì)積雪草提取物的脫色條件，得到的脫色效果顯著，發(fā)現(xiàn)影響積雪草提取物脫色效果的主要因素及優(yōu)先順序?yàn)橹行匝趸X的用量＞pH值＞脫色溫度＞脫色時(shí)間，其中中性氧化鋁的用量與pH值是極顯著因素。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中雖然中性氧化鋁的用量越多，積雪草提取物的脫色效果越好，但也發(fā)現(xiàn)積雪草總苷的吸附損失量與中性氧化鋁的用量呈正比，所以綜合脫色效果和目標(biāo)成分來(lái)看，選擇8倍量的中性氧化鋁用量較為合適。同時(shí)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)酸性環(huán)境有利于積雪草提取物的脫色，這可能與積雪草提取物中含有的酚酸類(lèi)物質(zhì)有關(guān)，但溶液酸性不能過(guò)強(qiáng)，當(dāng)pH＜3時(shí)脫色后的產(chǎn)品會(huì)發(fā)生變化并產(chǎn)生新的深顏色物質(zhì)，結(jié)合實(shí)際應(yīng)用考慮選擇pH為6左右較為合適。最后通過(guò)本研究最優(yōu)脫色條件的驗(yàn)證試驗(yàn)，證明了該工藝條件穩(wěn)定可靠，脫色后積雪草提取物品質(zhì)得到了明顯的提升，且在考察積雪草提取物脫色率的同時(shí)，建立了一種積雪草總苷的含量測(cè)定方法，為積雪草提取物的品質(zhì)提升和開(kāi)發(fā)利用提供了一定的科學(xué)依據(jù)和參考。