歐洲花楸無(wú)性快繁體系的建立研究

沙 巖

(黑龍江省林口縣林業(yè)和草原局，黑龍江 林口 157600)

歐洲花楸(SorbusaucupariaL.)原產(chǎn)亞洲和歐洲，為落葉喬木，樹(shù)冠較窄呈圓錐形，枝條呈平直狀，樹(shù)皮淺灰色、光滑，羽狀復(fù)葉?；ò咨?，復(fù)傘房花序、濃密、多花；果實(shí)扁球形，顏色橙、紅色，冬季宿存。歐洲花楸屬于陽(yáng)性或半耐蔭樹(shù)種，能適應(yīng)不同立地條件。多散生或混生在一些林分之中，較少營(yíng)造成片純林，且樹(shù)體高度有限、競(jìng)爭(zhēng)力相對(duì)較小，混交株數(shù)比例隨著樹(shù)木年齡增加和樹(shù)體增大而迅速減少，因此，不會(huì)出現(xiàn)無(wú)法控制的生物入侵現(xiàn)象。

1 材料選取

選取歐洲花楸US-05-01作為實(shí)驗(yàn)材料。

2 試驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基采用常規(guī)的配制方法，按要求添加不同的激素。繼代培養(yǎng)時(shí)，光源采用日光燈，光強(qiáng)為3000lx，光照10h/黑暗14h。培養(yǎng)溫度為24～28℃。

2.2 外植體選擇

1)選擇歐洲花楸US-05-01的健壯休眠枝條，浸泡催芽，兩天換一次清水，在20～25℃，7d左右開(kāi)始萌芽；腋芽萌發(fā)后，分別選取葉片、帶芽莖段做為供試材料進(jìn)行外植體誘導(dǎo)；將供試外植體沖洗干凈，用75%乙醇消毒30s，再用0.1%氯化汞間斷滅菌4min。

2)外植體為帶芽莖段。剪取長(zhǎng)約0.5cm帶芽莖段，接種于MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.05mg/L +蔗糖25g/L+日產(chǎn)瓊脂粉6g/L的培養(yǎng)基中，pH值調(diào)至5.8；外植體為葉片。選取2～5節(jié)葉片，在葉片遠(yuǎn)軸面中脈處橫切兩刀，切成0.5cm×0.5cm小塊，把葉片遠(yuǎn)軸面接種到培養(yǎng)基上。

3)每種外植體接種10瓶，每瓶5個(gè)處理，30d后調(diào)查各供試外植體的誘導(dǎo)情況。

2.3 外植體滅菌

剪取歐洲花楸US-05-01一年生枝條，洗去浮土，剪成1.5～2.0cm帶腋芽幼莖并沖洗干凈。按以下幾種方法滅菌：①75%乙醇滅菌20s；②75%乙醇滅菌30s；③75%乙醇滅菌40s；④75%乙醇滅菌30s+0.1%氯化汞連續(xù)滅菌2min；⑤75%乙醇滅菌30s+0.1%氯化汞連續(xù)滅菌4min；⑥75%乙醇滅菌30s+0.1%氯化汞間斷滅菌4min；⑦飽和濃度次氯酸鈉滅菌5min；⑧飽和濃度次氯酸鈉滅菌10min；⑨飽和濃度次氯酸鈉滅菌15min。每個(gè)處理10個(gè)莖段，2周后觀察效果。

2.4 基本培養(yǎng)基的選擇

滅菌后接種于以下4種基本培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)：①N6；②MS；③WPM；④H。與上述2.1相同，待培養(yǎng)20天調(diào)查其生長(zhǎng)指標(biāo)。

2.5 歐洲花楸誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)

歐洲花楸芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.05mg/L，將外植體接種于此誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待莖段的腋芽萌發(fā)后轉(zhuǎn)接到以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加：①6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L、②6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L、③6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L、④6-BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L、⑤6-BA2.0mg/L+NAA0.05mg/L、⑥6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L、⑦6-BA2.0mg/L+NAA0.4mg/L的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)。每個(gè)處理接種10瓶，每瓶5個(gè)單芽莖段，3次重復(fù)，培養(yǎng)30d后調(diào)查增殖效果。

2.6 歐洲花楸生根培養(yǎng)

1)剪取高2.0cm左右的分化苗，分別按梯度(0.1、0.5、1.0、1.5、2.0)mg/L接種于MS+IAA；MS+NAA；MS+IBAmg/L；MS+NAA0.01mg/L+IBA；MS+NAA0.03mg/L+IBA；MS+NAA0.05mg/L+IBA；MS+NAA0.10mg/L+IBA的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。

2)以上培養(yǎng)基均加蔗糖20g/L，瓊脂5.5g/L，pH為5.8。每個(gè)處理接種10瓶，培養(yǎng)50d后調(diào)查生根狀況。

2.7 歐洲花楸生根苗移栽

將約4cm的歐洲花楸生根苗置于溫室，逐漸揭開(kāi)瓶蓋煉苗5-7d，洗去培養(yǎng)基，用0.1%多菌靈溶液浸泡10min，洗凈后分別移栽到基質(zhì)中。每種處理移栽生根苗100棵。移栽后每?jī)芍軡补?/2倍大量元素培養(yǎng)液1次，噴殺菌劑1次。

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

所得數(shù)據(jù)采用Excel軟件和SPSS13.0分析軟件，進(jìn)行方差分析及多重比較分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 最佳外植體的選擇

在培養(yǎng)30d后，莖段的誘導(dǎo)率較高，褐化率相對(duì)較低；葉片的褐化率較高，莖段為歐洲花楸組培的最佳外植體(表1)。

表1 不同外植體對(duì)芽苗生長(zhǎng)的影響Tab.1 Effects of Different Explants on the Growth of Buds and Seedlings

3.2 不同滅菌劑與方法的滅菌效果

經(jīng)滅菌后發(fā)現(xiàn)，滅菌不徹底的莖段開(kāi)始出現(xiàn)污染，污染率最高的處理方法是75%乙醇滅菌20s；處理4為75%乙醇滅菌30s+0.1%氯化汞滅菌2min方法污染率也很高；處理5污染率最低；處理6污染率較低，且沒(méi)有褐變現(xiàn)象。說(shuō)明莖段采用75%酒精滅菌30s，再用0.1%氯化汞間斷滅菌4min的滅菌方法效果最好(表2-6)。

表2 不同滅菌劑與方法的滅菌效果Tab.2 Sterilization Effect of Different Sterilization Agents and Methods

表3 不同滅菌劑與方法污染率方差分析Tab.3 Analysis of Variance of Contamination Rate of Different Disinfectants and Methods

表4 不同滅菌劑與方法污染率多重比較Tab.4 Multiple Comparisons of Contamination Rates of Different Disinfectants and Methods Duncan

表5 不同滅菌劑與方法出芽率方差分析Tab.5 Variance Analysis of Buding Rate of Different Sterilizers and Methods

表6 不同滅菌劑與方法出芽率多重比較Tab.6 Multiple Comparison of Germination Rate of Different Disinfectants and Methods

3.3 基本培養(yǎng)基的篩選

將芽苗培養(yǎng)20d，表現(xiàn)各不相同(表7)。MS培養(yǎng)基生長(zhǎng)較快，可觀察到明顯的莖尖伸長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀況最好；在N6培養(yǎng)基中植株生長(zhǎng)較差；在WPM培養(yǎng)基上生長(zhǎng)慢，葉片有黃化死亡現(xiàn)象；在H培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的植株生長(zhǎng)最差。所以選用MS為基本培養(yǎng)基。

表7 不同種類基本培養(yǎng)基試管苗生長(zhǎng)狀況Tab.7 Growth of Plantlets in Vitro on Different Basic Media

3.4 增殖培養(yǎng)結(jié)果

經(jīng)過(guò)30d增殖培養(yǎng)后，均有不同程度的增殖。組合2增殖效果最好，且苗木粗壯；組合3相對(duì)增殖率也較高，生長(zhǎng)較旺盛。綜合試驗(yàn)結(jié)果，最適增殖培養(yǎng)基應(yīng)為處理2，可達(dá)到最佳培養(yǎng)效果(表8-10)。

表8 不同培養(yǎng)基的芽增殖倍數(shù)Tab.8 Bud Multiplication Times of Different Media

表9 不同培養(yǎng)基的芽增殖系數(shù)方差分析Tab.9 Variance Analysis of Bud Multiplication Coefficient in Different Media

表10 不同培養(yǎng)基的芽增殖系數(shù)多重比較Tab.10 Multiple Comparison of Bud Multiplication Coefficients in Different Media Duncan

3.5 生根培養(yǎng)結(jié)果

試管苗經(jīng)過(guò)生根培養(yǎng)，50d后調(diào)查其生根率。結(jié)果顯示：?jiǎn)我惶砑由L(zhǎng)素IBA時(shí)，生根率明顯高于單一添加IAA、NAA的生根率，單一添加1.5mg/LIBA的生根率為單一激素最高；激素組合為NAA0.05mg/L+IBA1.5 mg/L的生根率最高。添加不同激素組合的生根率均明顯高于添加單一激素的生根率。最適生根培養(yǎng)基為MS+IBA1.5mg/L+NAA0.05 mg/L(表11-12)。

表11 單一激素不同濃度對(duì)歐洲花楸生根率影響Tab.11 Effect of Different Concentrations of Single Hormone on Rooting Rate of Sorbus Europaea

表12 不同激素組合對(duì)歐洲花楸生根率影響Tab.12 Effect of Different Hormone Combinations on Rooting Rate of Sorbus Europaea

3.6 生根苗移栽

3.6.1 試管苗生根培養(yǎng)天數(shù)對(duì)移栽成活率的影響

隨機(jī)抽取生根培養(yǎng)少于30d、30-40d、多于40d的試管苗各50瓶(5株/瓶)，相同培養(yǎng)基質(zhì)、不同生根培養(yǎng)天數(shù)，移栽成活率相差較大。其中生根培養(yǎng)30-40d移栽效果最好(表13-14)。

表13 不同生根培養(yǎng)天數(shù)試管苗移栽成活率比較結(jié)果Tab.13 Comparison of Survival Rate of Test Tube Plantlets Transplanted in Different Rooting Culture Days

表14 不同生根培養(yǎng)天數(shù)試管苗移栽成活率方差分析Tab.14 Variance Analysis of Survival Rate of Test Tube Plantlets Transplanted in Different Rooting Culture Days

3.6.2 不同配比基質(zhì)對(duì)移栽成活率的影響

以珍珠巖+草炭土(1∶1)、腐殖土+珍珠巖+蛭石(1∶1∶1)、蛭石+草炭土(1∶1)作為移栽基質(zhì)，移栽基質(zhì)不同，移栽成活率相差很大。隨機(jī)抽取生根培養(yǎng)30-40d試管苗為樣本，結(jié)果得出腐殖土+珍珠巖+蛭石(1∶1∶1)配比基質(zhì)中移栽苗的每瓶生根數(shù)、移栽成活率均高于其他基質(zhì)配比，且移栽后苗木生長(zhǎng)狀況更好(表15-17)。

表15 不同基質(zhì)試管苗移栽成活情況Tab.15 Transplantation Survival of Test Tube Plantlets from Different Substrates

表16 不同基質(zhì)試管苗移栽成活率方差分析Tab.16 Variance Analysis of Transplanting Survival Rate of Test tube Seedlings in Different Substrates

表17 不同基質(zhì)試管苗移栽成活率多重比較Tab.17 Multiple Comparison of Survival Rate of Transplanting Test Tube Plantlets from Different Substrates Duncan

3.6.3 不同根系狀況對(duì)移栽成活率的影響

試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，根系正常、根系污染、根少、僅有愈傷組織而無(wú)根4種根系狀況的試管苗，移栽成活率相差較大。根系正常的試管苗，移栽成活率最高；根系污染但苗木長(zhǎng)勢(shì)良好的，通過(guò)多菌靈處理可以成活近50%以上；根系較少的，通過(guò)細(xì)致地培育管理，其成活率可能超過(guò)污染苗的成活率；而無(wú)根苗移栽成活率最低(表18-20)。

表18 不同根系狀況試管苗移栽成活情況Tab.18 Transplantation Survival of Test Tube Seedlings under Different Root Conditions

表19 不同根系狀況試管苗移栽成活率方差分析Tab.19 Variance Analysis of Transplanting Survival Rate of Test Tube Seedlings under Different Root Conditions

表20 不同根系狀況試管苗移栽成活率多重比較Tab.20 Multiple Comparison of Survival Rate of Transplanting Test Tube Seedlings under Different Root Conditions Duncan

3.6.4 不同溫度對(duì)移栽成活率的影響

試管苗其生長(zhǎng)環(huán)境與自然條件相差較大。因此，溫濕度和光照條件對(duì)移栽成活率的影響更明顯。以腐殖土+珍珠巖+蛭石(1∶1∶1)為基質(zhì)，生根培養(yǎng)30-40d且根系正常的試管苗在不同溫度條件下的生長(zhǎng)狀況不同(表21)。

表21 不同溫度條件下試管苗生長(zhǎng)狀況Tab.21 Growth of Plantlets in Vitro at Different Temperatures

3.6.5 移栽過(guò)程中溫濕度及光照條件的控制

1)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)控水、減肥、增光、降溫等措施，可使其逐漸適應(yīng)外界環(huán)境條件。移栽后，應(yīng)給予較高的空氣濕度在90%以上；溫度控制在18～20℃；保證弱光照射。

2)小苗開(kāi)始生長(zhǎng)后溫度最好在25～28℃，濕度則保持在75%左右。經(jīng)過(guò)這些過(guò)程使試管苗逐漸適應(yīng)自然條件，便可順利完成移栽。

4 結(jié)論

1)帶腋芽莖段為優(yōu)良品系歐洲花楸US-05的最佳外植體，沖洗干凈后，用75%酒精滅菌30s，再用0.1%氯化汞間斷滅菌4min的滅菌方法效果最好。利用植物組織培養(yǎng)方法，以優(yōu)良?xì)W洲花楸品系的優(yōu)良單株US-05-01的帶芽莖段作為外植體，不僅可以節(jié)省供試材料，而且不受條件的限制，誘導(dǎo)率高、褐化率低，能在較短的時(shí)間內(nèi)培育出大量的優(yōu)質(zhì)種苗。掌握外植體的滅菌時(shí)間是獲得無(wú)菌芽苗的基礎(chǔ)，采集時(shí)期、材料的幼嫩程度不同，對(duì)滅菌劑的耐受力也不盡相同。消毒時(shí)間太短滅菌不徹底，易造成污染；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則可能導(dǎo)致生長(zhǎng)受阻，甚至死亡。

2)MS培養(yǎng)基是腋芽生長(zhǎng)最適基本培養(yǎng)基。培養(yǎng)基除了向植物提供無(wú)機(jī)鹽，必要的維生素和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)，還具有維持植物細(xì)胞的滲透壓，酸堿度和供給水分等作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，以高濃度的NO3-N存在的MS類型培養(yǎng)基比較適合培養(yǎng)歐洲花楸。

3)歐洲花楸最適增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，增殖率為85%，增殖系數(shù)為18.60，且苗木粗壯、生長(zhǎng)旺盛。

4)添加不同激素組合的生根率均明顯高于添加單一激素的生根率。生長(zhǎng)素類型與生長(zhǎng)素濃度交互效應(yīng)是顯著的。最適生根培養(yǎng)基為MS+IBA1.5mg/L+NAA0.05 mg/L。

5)歐洲花楸組培生根苗移栽的關(guān)鍵是選取適宜的基質(zhì)類型和控制好環(huán)境的溫濕度。經(jīng)試驗(yàn)，歐洲花楸生根苗移栽的最適條件為：生根培養(yǎng)30-40d的生根苗；移栽基質(zhì)為腐殖土+珍珠巖+蛭石(1∶1∶1)，環(huán)境溫度控制在28℃，濕度控制在75%，此時(shí)歐洲花楸生根苗移栽成活率最高。