耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的耐藥性及耐藥基因分布特點研究

王艷艷，高翔宇，王穎君，呂瑩瑩，韓艷秋，蘭海霞，王俊瑞*

1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，呼和浩特 010050；2解放軍第九六九醫(yī)院兒科，呼和浩特 010051

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）為非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然界，是定植于人體呼吸道及皮膚表面等部位的條件致病菌，在宿主免疫力低下等情況下易引起多種感染性疾病，如呼吸道感染、泌尿生殖道感染、傷口感染和敗血癥等［1-3］。近年來，碳青霉烯類抗菌藥物被廣泛用于治療細菌感染性疾病，耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）感染患者數(shù)呈逐年增多的趨勢，多重耐藥（multi-drug resistant，MDR）及泛耐藥（pan-drug resistant，PDR）鮑曼不動桿菌的廣泛流行給臨床抗感染治療帶來巨大挑戰(zhàn)［4-7］。有研究顯示，產(chǎn)碳青霉烯酶是鮑曼不動桿菌最主要的耐藥機制之一［8］。本研究擬通過對本院2013年9月～2021年2月分離的100株CRAB菌株的分布及耐藥性進行統(tǒng)計，分析其耐藥基因分布情況，并初步探究菌株對碳青霉烯類藥物的耐藥機制，為CRAB的有效治療及醫(yī)院感染防控提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

選取從2013年9月～2021年2月期間本院收治患者的臨床標本中分離的100株CRAB菌株，剔除同一患者重復菌株。

1.2 儀器與試劑

IMH750-S型微生物培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；VITEK2-Compact全自動微生物鑒定儀及其配套試劑（法國Bio-M é rieux公司）；microTyper MALDI-TOF質(zhì)譜儀（江蘇天瑞儀器有限公司廈門分公司）；Effiency96型PCR擴增儀（北京領宇科技有限公司）；PowerPacTMBasic型電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Gel Doc XR+型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

MH瓊脂粉（英國Oxoid公司，批號：2846108）；替加環(huán)素藥敏試劑（溫州康泰生物科技有限公司，批號：VG1213JA）；VITEK2-Compact全自動微生物鑒定儀及配套試劑GN16卡（法國Bio-M é rieux公司，批號：1132013503）；藥敏試紙［溫州康泰生物科技有限公司，批號：331353（美羅培南）、3354894（頭孢哌酮/舒巴坦）］；引物、MasterMix、DNA Marker（大連TaKaRa生物工程有限公司，批號：#S7621）；細菌基因組 DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，批號：W0130）；質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853，均購自國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心。

1.3 細菌鑒定及藥敏試驗

菌株的分離、培養(yǎng)參照《臨床微生物檢驗標準化操作》（第三版）［9］進行，采用 VITEK 2-Compact全自動微生物鑒定/藥敏系統(tǒng)及microTyper MALDI-TOF質(zhì)譜儀進行鑒定和復核。藥敏試驗中，頭孢哌酮/舒巴坦、美羅培南采用K-B紙片擴散法進行藥敏試驗；替加環(huán)素采用微量肉湯稀釋法進行藥敏試驗；其他抗菌藥物采用VITEK 2-Compact全自動微生物系統(tǒng)鑒定/藥敏系統(tǒng)進行藥敏試驗。抗菌藥物濃度均為GN16卡片中的濃度范圍：頭孢吡肟（2～16μg/ml）、亞胺培南（1～32μg/ml）、妥布霉素（4～16μg/ml）、阿米卡星（16～64μg/ml）、復方磺胺甲唑（ 甲氧芐啶2～4mg/ml、磺胺甲唑 38～76μg/ml）、慶大霉素（4～16μg/ml）、環(huán)丙沙星（1～4μg/ml）、頭孢曲松（1～4μg/ml）、左氧氟沙星（2～8μg/ml）和替加環(huán)素（0.5～8μg/ml）。結(jié)果判定參照美國臨床與實驗室標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M100-S32 版文件［10］。

1.4 碳青霉烯酶基因檢測

按照DNA提取試劑盒的操作步驟，提取100株CRAB菌株的全基因組DNA，并置于-20℃保存?zhèn)溆?。引物及反應條件參照文獻進行設計［11-15］，包括D類碳青霉烯酶基因（blaOXA-23，blaOXA-24，blaOXA-51，blaOXA-58，blaOXA-143和blaOXA-48）、B 類碳青霉烯酶基因（blaIPM，blaVIM，blaNDM，blaGIM和blaSIM）、A 類碳青霉烯酶基因（blaKPC-2）［8］和插入序列（ISAba1）共13對引物序列，詳見表1。

表1 PCR引物序列

1.5 統(tǒng)計學方法

采用WHONET 5.6軟件對藥敏結(jié)果進行分析，計數(shù)資料以n（%）表示。

2 結(jié)果

2.1 CRAB菌株的標本來源分布

100株CRAB菌株來源于8種不同的臨床標本，其中痰液標本最多（75株，75.0%）；其次是尿液標本（8株，8.0%）；傷口分泌物和膿汁標本均為6株（6.0%）。具體標本來源分布及構成比見表2。

表2 CRAB菌株的標本來源分布情況

2.2 CRAB菌株的臨床科室來源分布

100株CRAB菌株的主要臨床科室來源為重癥加強護理病房（intensive care unit，ICU），有30株（30.0%）；其次為神經(jīng)外科（24株，24.%）、康復科（13株，13.0%）、呼吸內(nèi)科（9株，9.0%）。CRAB菌株的臨床科室來源分布及構成比詳見表3。

表3 CRAB菌株的臨床科室來源分布情況

續(xù)表

2.3 CRAB對常用抗菌藥物耐藥情況

本研究中，100株CRAB菌株對頭孢曲松、頭孢吡肟和環(huán)丙沙星的耐藥率均為100%；慶大霉素耐藥率為90.0%；頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率為62.0%，中介率為35.0%，敏感率僅為3.0%（以頭孢哌酮折點為參考判斷敏感或耐藥）；阿米卡星耐藥率較低，僅為33.0%；未發(fā)現(xiàn)對替加環(huán)素耐藥的菌株。CRAB對常用抗菌藥物的耐藥情況見表4。

表4 CRAB對常用抗菌藥物的耐藥情況 n（%）

2.4 碳青霉烯酶基因檢測結(jié)果

PCR檢測結(jié)果顯示，100株CRAB菌株中，97株擴增出blaOXA-23（97.0%）；94株擴增出blaOXA-51（94.0%）；1 株擴增出blaOXA-58（1.0%）；4株擴增出blaNDM（4.0%）；1株擴增出blaIPM（1.0%）；99株擴增出ISAba1（99.0%）；另外，blaOXA-24、blaOXA-143、blaOXA-48、blaKPC-2、blaSIM、blaVIM和blaGIM均未檢出，結(jié)果見圖1。

圖1 碳青霉烯類基因檢測陽性率情況

3 討論

鮑曼不動桿菌是不動桿菌屬中最常見的一種革蘭陰性桿菌，具有較強的存活力和抵抗力，已成為威脅全球人類健康的一類重要病原菌，尤其對老年、患危重疾病、機體抵抗力弱及進行各種侵入性操作、長期使用廣譜抗菌藥物治療的患者威脅更大［2，14-15］。2020年全國細菌耐藥監(jiān)測報告顯示［16］，鮑曼不動桿菌的分離率在革蘭陰性菌中排名第4位，其對碳青霉烯類藥物的耐藥率基本穩(wěn)定，全國平均耐藥率為53.7%，較2019年下降了2.3%；地區(qū)間有一定的差別，其中河南省最高（78.5%），青海省最低（18.2%）；值得注意的是，內(nèi)蒙古地區(qū)處在中間水平，平均耐藥率為54.7%，但較2019年下降了1.8%。世界衛(wèi)生組織（WHO）于2017年公布的新型抗菌藥物研發(fā)重點病原體清單中，CRAB居革蘭陰性菌之首。CRAB感染不僅可造成較高的病死率、提高醫(yī)療保健和治療費用負擔，還給遏制微生物耐藥性和耐藥菌傳播、臨床感染防控等方面帶來了嚴峻挑戰(zhàn)［17-18］。

因鮑曼不動桿菌具有極強的獲得耐藥能力，已成為醫(yī)院內(nèi)暴發(fā)感染的重要致病菌，且分離率不斷提高、耐藥程度越來越嚴重［2］。CRAB對多種常用抗菌藥物均耐藥，呈PDR或全耐藥趨勢［19］。本研究對100株CRAB菌株進行耐藥性分析，結(jié)果顯示CRAB對頭孢吡肟、頭孢曲松、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率均為100%，與國內(nèi)部分研究報道一致［20-21］；對阿米卡星、妥布霉素、復方磺胺甲唑、頭孢哌酮/舒巴坦和慶大霉素的耐藥率均低于國內(nèi)其他地區(qū)相關報道［20-21］，這可能與內(nèi)蒙古地區(qū)的特殊地理位置、人口構成或本研究納入菌株數(shù)有限有關。此外，由于自動化儀器法檢測替加環(huán)素耐藥性的局限性，本研究采用微量肉湯稀釋法進行檢測，發(fā)現(xiàn)本院CRAB菌株對替加環(huán)素仍保持高敏感性，未發(fā)現(xiàn)中介或耐藥株。

鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物的耐藥機制包括產(chǎn)碳青霉烯酶、青霉素結(jié)合蛋白改變、膜孔道蛋白缺失、藥物主動外排泵的過度表達等，產(chǎn)碳青霉烯酶是其主要機制之一［8］。根據(jù)Ambler分類法，碳青霉烯酶可以分為A、B、C和D共4類。目前，在鮑曼不動桿菌臨床株中，主要有A、B和D這3類碳青霉烯酶［8］。A類碳青霉烯酶的活性位點含絲氨酸殘基，故也稱為絲氨酸酶。B類碳青霉烯酶是依賴于金屬鋅的β內(nèi)酰胺酶，命名為金屬β內(nèi)酰胺酶（metallo beta lactamase，MBL），典型代表為VIM、IPM和NDM型酶等。到目前為止，VIM、IPM和NDM已在我國、亞洲其他國家、歐洲等多個國家和地區(qū)的鮑曼不動桿菌中檢出，并出現(xiàn)多起醫(yī)院感染的暴發(fā)流行［22］。另外，MBL可通過整合子或質(zhì)粒介導方式進行水平傳播，容易引起更廣泛地傳播。D類碳青霉烯酶被稱為苯唑西林酶（oxacilllinase，OXA），與MBL相比，OXA對碳青霉烯類藥物的水解活性低，但當編碼基因的上游或下游存在插入序列（insertion sequence，IS）時，耐藥基因可高度表達，表現(xiàn)出對碳青霉烯類藥物的高水平耐藥［23］。由于各個國家和地區(qū)使用的抗菌藥物存在差異，不同地區(qū)的鮑曼不動桿菌耐藥譜也有不同，其所攜帶的耐藥基因構成比亦不同［8］，故本研究檢測了12種主要編碼碳青霉烯酶的耐藥基因以及1種插入序列，以分析本醫(yī)院分離CRAB中碳青霉烯酶基因分布特點。研究結(jié)果顯示，D類碳青霉烯酶是鮑曼不動桿菌中分布最多的β-內(nèi)酰胺酶。本研究結(jié)果顯示94.0%的CRAB菌株攜帶blaOXA-51基因，與已有研究結(jié)果相同［22］，提示blaOXA-51樣碳青霉烯酶在鮑曼不動桿菌中普遍存在。據(jù)報道，許多鮑曼不動桿菌株常攜帶2種或2種以上碳青霉烯酶［20］，blaOXA-51樣碳青霉烯酶是否以固有方式存在仍有待進一步證實。同時，該菌對碳青霉烯類耐藥可能并不完全由blaOXA-51樣碳青霉烯酶介導，因為大部分CRAB常常同時產(chǎn)生blaOXA-23樣、blaOXA-24樣、blaOXA-58樣碳青霉烯酶，而文獻報道這些酶的產(chǎn)生可以提高CRAB菌株對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥程度［24］。本研究顯示，在100株CRAB中，97株（97.0%）檢出了blaOXA-23型基因，1株（1.0%） 檢出了blaOXA-58型基因，分離率與國內(nèi)相關報道一致［19-20］，提示blaOXA-23同樣是本院分離的CRAB攜帶的主要碳青霉烯類基因，這可能是引起鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物耐藥的主要原因之一。目前，可水平傳播的MBL在銅綠假單胞菌、腸桿菌科菌株及鮑曼不動桿菌中可快速增加，最常見的酶是IPM、VIM、SIM、NDM［25］。本研究中NDM和IPM型酶較少，檢出率分別為4.0%和1.0%。另外，有2株CRAB未檢出上述耐藥基因，提示可能存在其他類型的碳青霉烯基因，或具有外膜蛋白缺失、主動外排泵過度表達等其他耐藥機制，仍有待進一步驗證。

2001年，研究人員在鮑曼不動桿菌中發(fā)現(xiàn)了一個新的插入序列ISAba1，該序列位于編碼blaADC基因［25］和blaOXA-23基因的上游。該序列包括2個開放閱讀框（open reading frame，ORF），在形成有效和有功能的轉(zhuǎn)座酶時可出現(xiàn)移碼，表明其具備調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的功能［25］。blaOXA-51樣碳青霉烯酶往往表達很弱，但上游啟動子存在插入序列ISAba1時其表達可明顯上調(diào)。已有研究證實，ISAba1一旦位于特定基因的上游就會發(fā)揮啟動子功能，促進該基因的表達［24，26］。本研究中，ISAba1檢出率為99.0%，說明ISAba1可能在CRAB株中對D類碳青霉烯酶編碼基因的轉(zhuǎn)錄起著重要的調(diào)控作用。

綜上所述，本院分離的CRAB菌株對多種非β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物均耐藥，僅對替加環(huán)素完全敏感，產(chǎn)OXA-23和OXA-51型酶可能是介導本院CRAB菌株對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機制之一。在臨床診療過程中，需對ICU、神經(jīng)外科患者進行重點監(jiān)測，做好醫(yī)院感染防控措施，合理使用抗菌藥物，減少CRAB的進一步傳播。