基于內源酶活性變化的冷藏哈氏仿對蝦肌肉品質研究

周 婷，水珊珊,2, ，李志鵬，吳盈茹，丁怡萱，張 賓,

（1.浙江海洋大學，食品與藥學學院，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江舟山 316021）

哈氏仿對蝦（Parapenaeopsis hardwickii）屬十足目，對蝦科，仿對蝦屬，俗稱九蝦、珠蝦、劍蝦、滑皮蝦、青皮等，為廣溫廣鹽暖水性中型蝦類，主要分布于印度、馬來西亞、加里曼丹、新加坡、日本以及我國黃海南部、東海及南海附近海域[1]。哈氏仿對蝦肌肉鮮嫩，可以生食，也可制成海產品，深受消費者的喜愛，是江浙沿海一帶漁民用來生產的主要蝦類品種[2]。哈氏仿對蝦在捕撈后離開其適應的水環(huán)境很容易死亡，而死亡后的蝦極易發(fā)生物理損傷、蛋白質降解及微生物侵襲作用等，導致其肌肉品質下降迅速。冰鮮蝦類在貯藏過程中也易發(fā)生腐敗，主要原因是蝦死后組織器官中內源酶的降解作用，導致蝦體肌肉分解不斷加速[3]。

蝦體肌肉軟化由多種原因造成，主要是由自身存在的內源酶而引起，如胰蛋白酶、組織蛋白酶和鈣蛋白酶等。其中，胰蛋白酶作為一種重要的消化性蛋白酶，主要存在于蝦頭胰腺組織中。陳詩妍[4]研究發(fā)現(xiàn)，在凡納濱對蝦貯藏過程中，蝦頭中胰蛋白酶可能會逐步遷移到蝦肌肉中，進而對肌肉品質產生較大影響。此外，各種組織蛋白酶對蝦肌肉品質的影響逐漸被人們所關注，尤其在蝦類離水死后貯藏初期，組織蛋白酶可導致肌肉細胞骨架蛋白的破壞，因此被認為是誘導肌肉蛋白質降解的重要影響因素之一[5]。盧涵[6]研究發(fā)現(xiàn)，低溫條件下鳙魚肉在代謝過程中，肌肉中組織蛋白酶主要分布于肌原纖維蛋白周圍，其與肌漿蛋白的降解以及肌肉質構、肌纖維微觀結構的變化均有關聯(lián)。此外，有研究表明，鈣蛋白酶首先攻擊肌原纖維的肌節(jié)部分，釋放肌原纖維，可降解原肌球蛋白、肌鈣蛋白 T、絲蛋白、結合蛋白及肌鈣蛋白，同時還可以降解肌肉纖維骨骼蛋白，如肌動蛋白。據(jù)推測，鈣蛋白酶首先攻擊肌原纖維的肌節(jié)部分，釋放肌原纖維，將它們分解成更小的碎片，最后將碎片化的肌原纖維捕獲在溶酶體中分解[7-8]。孫蕾蕾等[9]研究發(fā)現(xiàn)宰后魚肉能量的代謝和質構變化與肌肉中的肌鈣蛋白酶有關。目前，國內外對水產品內源酶的研究報道主要集中于魚類內源酶，而關于蝦類尤其是海水哈氏仿對蝦，尚缺少系統(tǒng)性研究。

本文以哈氏仿對蝦為對象，分為完整蝦組和去頭蝦組，通過比較分析冷藏過程中蝦肌肉組織理化特性及各內源酶活性變化情況，闡述多種內源酶與蝦肌肉品質特性之間的相互關系，旨在為后續(xù)通過抑制內源酶活性，進而保障海水蝦類品質的提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的哈氏仿對蝦（體長約8 cm） 購于舟山市沈家門水產碼頭，放入準備好的泡沫箱內并封存，半小時內運回實驗室；組織蛋白酶ELISA檢測試劑盒

上海繼錦化學科技有限公司；蛋白定量測試盒、胰蛋白酶測試盒 南京建成生物工程研究所；三氯乙酸（TCA）、三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、乙二醇雙四乙酸（EGTA）、氯化鎂等國藥集團化學試劑有限公司。

751UVGD型紫外-可見分光光度計 上海第三分析儀器廠；Synergy H1全功能酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；DiRECT-Q超純水裝置 美國MILLIPORE公司；MDF-U53V型超低溫冰箱 日本SANYO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 前處理與分組 選取個頭相似的新鮮哈氏仿對蝦，分為完整蝦組和去頭蝦組。將整蝦和去頭蝦分裝后，用標簽記錄并置于0 ℃冰箱中低溫保存。分別在0、2、4和6 d，取出相對應時間的樣本，對其進行后續(xù)指標的測定。

1.2.2 指標測定

1.2.2.1 質構特性測定 參照祁雪兒等[10]報道，并稍作修改。采用TPA模型進行檢測，測定參數(shù)如下：P/50平底圓柱體探頭，測試速度為1.0 mm/s，測定哈氏仿對蝦肌肉第2腹節(jié)，樣品壓縮變形量為30%，測試力0.6 N。采用FTC-PRO軟件從每個蝦肉樣品產生的力與時間曲線中，計算出蝦肉的硬度、粘附性、內聚性、彈性、膠黏性和咀嚼性。

1.2.2.2 TCA-可溶性肽含量的測定 參考劉芳芳等[11]報道方法并稍作修改。稱取2.0 g切碎后樣本，加入18 mL預冷至4 ℃的5% TCA溶液中，11000 r/min均質2 min，4 ℃靜置1 h后，置于離心機中8000 r/min離心15 min（4 ℃）。利用雙縮脲法測定上清液中TCA-可溶性肽含量，結果用μmol/g表示。

1.2.2.3 肌原纖維蛋白含量及小片化指數(shù)測定 肌原纖維蛋白含量測定：參考柳佳彤等[12]報道的方法并稍加調整。稱取2.0 g蝦肉，加入9倍體積的20 mmol/L Tris-馬來酸緩沖液（含50 mmol/L KCl，pH7.0）后進行均質，10000 r/min離心15 min（4 ℃），棄去上清液，獲得沉淀采用相同緩沖液洗滌2次；收集沉淀，加入9倍體積的20 mmol/L Tris-馬來酸緩沖液（含0.6 mol/L KCl，pH7.0）后進行均質，4 ℃下靜置提取1 h，10000 r/min離心15 min（4 ℃），取上清液采用雙縮脲法測定其吸光度。

肌原纖維小片化指數(shù)（MFI）：參考張斌斌等[13]的方法并做適當修改。準確稱取2.0 g樣本，切碎后加入40 mL預冷的MFI提取緩沖液（含100 mmol/L KCl、11.2 mmol/L K2HPO4、8.8 mmol/L KH2PO4、1 mmol/L EGTA和1 mmol/L MgCl2），高速均質后，4000 ×g離心15 min（4 ℃），離心后棄去上清液。向沉淀中加入30 mL預冷的MFI提取緩沖液，溶解混勻，4000×g離心15 min（4 ℃），離心后棄去上清液，重復一次上述步驟。所得沉淀用上述MFI緩沖液制成蛋白濃度為（0.50±0.05） mg/mL的懸濁液，用雙縮脲法測定其540 nm處的吸光度值A540，計算肌原纖維小片化指數(shù)MFI=A540×200。

1.2.2.4 胰蛋白酶活性測定 參考陳詩妍等[4]實驗方法并稍作修改。分別取冷藏哈氏仿對蝦蝦頭的胰腺部分、整蝦與去頭蝦腹部第2節(jié)肌肉樣品各2.0 g，按樣本:緩沖液=1:4（m:v）的比例加入4 ℃預冷的磷酸鹽緩沖液，冰浴條件下進行機械勻漿，3000 r/min離心10 min（4 ℃），取上清液，即為粗酶液，并根據(jù)試劑盒說明書并稍加修改進行胰蛋白酶活性測定。

1.2.2.5 組織蛋白酶B、D、H、L及鈣蛋白酶活性測定 取2.0 g樣本，按照樣本:緩沖液=1:4（m:v）的比例加入0.9% NaCl，均質2～3次，每次20 s，間隔10 s，3000 r/min離心20 min（4 ℃），取上清液進行測定，操作過程依據(jù)試劑盒說明書進行。

1.2.2.6 亞細胞各部分中組織蛋白酶B、D、H及L活性測定 參考Ertbjerg等[14]的方法并稍加調整。取2.0 g樣本與10 mL緩沖液A（含100 mmol/L蔗糖、100 mmol/L KCl、50 mmol/L Tris、10 mmol/L Na4P2O7·10 H2O、1 mmol/L Na2EDTA，pH7.2）混合均質后，用尼龍網(wǎng)過濾去除結締組織，將混合物在1100×g下離心10 min（4 ℃），所得沉淀部分為肌原纖維。上清液部分繼續(xù)在3000×g下離心10 min，所得沉淀為線粒體部分。上清液繼續(xù)在16000×g下離心30 min，所得沉淀為溶酶體部分，上清液部分為肌漿。將線粒體及溶酶體部分置于貯藏緩沖液B（含85 mmol/L CH3COONa、15 mmol/L CH3COOH和1 mmol/L EDTA-2Na）后，立即檢測各組織蛋白酶的活性，具體操作依據(jù)試劑盒說明書進行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Origin 2018、Excel 2010和SPSS 25進行統(tǒng)計分析，結果均采用平均值±標準差形式表述。比較平均值采用單因素ANOVA檢驗中的最小顯著差異法（LSD）和沃勒-鄧肯（W），P＜0.05視為顯著差異。

2 結果與分析

2.1 冷藏過程中哈氏仿對蝦肌肉質構特性變化

質構特性是水產品貯藏過程中評價產品質量和可接受程度的重要指標。由表1可知，通過對整蝦肉和去頭蝦肉的對比發(fā)現(xiàn)，0 ℃條件下的兩組樣品，在冷藏過程中各項質構指標均有明顯差異。質構的各項指標均能較好地體現(xiàn)肌肉組織的狀況，其中硬度和彈性與蝦肌肉品質相關性較為緊密，這與王偉等[15]的研究結果相類似。隨著貯藏時間的延長，蝦肉蛋白質被逐漸分解，導致蝦肉軟化，冷藏6 d后，完整蝦肉與去頭蝦肉的硬度分別降至為5.707、6.513 N；而彈性則分別從1.000、1.083 mm下降至0.750、0.793 mm。結果表明，在低溫存放過程中，隨著蝦新鮮度逐漸降低，整蝦肉和去頭蝦肉的各個質構特性會出現(xiàn)不同程度的波動，且去頭蝦組往往指標表現(xiàn)更好些，可能是因為整蝦組中存在較多的內源酶，更易引起蛋白質和結締組織的自溶降解[16]。

表1 不同冷藏天數(shù)對哈氏仿對蝦質構的影響Table 1 Effects of different cold storage days on the texture of Parapenaeopsis hardwickii

2.2 冷藏過程中哈氏仿對蝦TCA-可溶性肽含量變化

蛋白質分解產生大量肽，TCA-可溶性肽的變化趨勢可以一定程度上反映出蛋白質的分解情況，其值越高，蛋白質分解的程度就越嚴重[17]。蝦頭中存在較多的內臟及活性物質，在冷藏過程中可能會發(fā)生較大的作用，并對蝦肌肉中TCA-可溶性肽含量產生一定影響。如圖1所示，完整蝦組肌肉與去頭蝦組肌肉中TCA-可溶性肽含量隨著冷藏時間延長而上升，在6 d后顯著上升（P ＜0.05），表明蝦體內的蛋白降解在持續(xù)進行。完整蝦組蝦頭中TCA-可溶性肽含量先下降后上升，可能是在冷藏前期，蝦頭中的內源酶參與了蝦肉蛋白質降解，影響蝦頭中的蛋白質降解速度，到了冷藏后期，整蝦組蝦頭中的TCA-可溶性肽含量的上升趨勢遠大于整蝦組肌肉，可能是蝦頭中的蛋白質降解機制被激活，促進了蛋白質加速降解，造成TCA-可溶性肽急劇上升。TCA-可溶性肽含量前期增加的原因可能是內源性蛋白酶導致，后期在內源酶及微生物共同作用下發(fā)生蛋白質降解，這與張楠楠[18]發(fā)現(xiàn)魚肉在貯藏過程中被內源酶和微生物外源酶分解的研究結果一致，與張喜才[19]報道的石斑魚冷藏過程中的TCA-可溶性肽含量變化的結論一致。

圖1 哈氏仿對蝦體內TCA-可溶性肽含量變化Fig.1 Changes of TCA-soluble peptide content in Parapenaeopsis hardwickii

2.3 冷藏過程中哈氏仿對蝦肌原纖維蛋白含量及小片化指數(shù)變化

肌原纖維蛋白是蝦肉中含量最高的蛋白質，是蝦肌肉蛋白質的重要組成部分，其含量的高低可能表明蝦肌肉質量存在一些差異[20]。如圖2（a）所示，隨著冷藏時間的延長，哈氏仿對蝦肌肉中的肌原纖維蛋白含量持續(xù)下降。新鮮的蝦肉中肌原纖維蛋白含量為89.22 mg/g；在冷藏6 d時完整蝦組肌肉與去頭蝦組肌肉中的肌原纖維蛋白含量分別下降了56.65%和44.63%，且在6 d后，完整蝦組的肌原纖維蛋白含量顯著低于去頭蝦組（P＜0.05），可能是在貯藏過程中，整蝦中存在較多的微生物及其他活性物質促進蝦肉中的肌原纖維蛋白降解，造成組間肌原纖維蛋白降解差異[4]。

圖2 哈氏仿對蝦體內肌原纖維蛋白（a）及其小片化指數(shù)（b）變化情況Fig.2 Changes of myofibrillar protein (a) and its fragmentation index (b) in Parapenaeopsis hardwickii

蝦在冷藏過程中肌聯(lián)蛋白和伴肌動蛋白逐漸降解，這兩類蛋白質均位于肌原纖維蛋白肌節(jié) Ⅰ 帶，而MFI值反映了肌節(jié)Ⅰ帶附近關鍵細胞骨架蛋白的降解程度，MFI值越大，說明肌原纖維內部結構完整性的破壞程度就越大[20-21]。由圖2（b）可知，整蝦肉及去頭蝦肉在冷藏初期均為24.7，隨著冷藏時間的延長，兩組的MFI值均呈上升趨勢，且在6 d的冷藏周期內，兩組樣品之間均存在顯著性差異（P＜0.05），可能是因為隨著冷藏時間的增加，蛋白質逐漸氧化，同時蝦頭中的某些活性成分緩慢遷移到蝦肉中，從而加劇了蝦肉蛋白的結構破壞和降解，這與柳佳彤等[12]凍藏過程中羅氏沼蝦蝦頭中內源酶遷移至蝦肉中，進而破壞蝦肉蛋白的研究結果一致。Kaale等[22]研究發(fā)現(xiàn)，大西洋鮭魚在微凍保藏過程中，魚肉肌原纖維發(fā)生碎片化。Fang等[23]在草魚魚片的超冷儲存過程中發(fā)現(xiàn)，剪切力與MFI的數(shù)據(jù)呈比較清晰的負相關，可以反映肌原纖維結構蛋白的降解程度。

2.4 冷藏過程中哈氏仿對蝦胰蛋白酶活性變化

哈氏仿對蝦消化系統(tǒng)內含有各種消化酶，具有很強的自溶能力[24]，其中胰蛋白酶是蝦頭中主要的消化酶，在蝦頭中可能存在較高的活性會對蝦肌肉中的胰蛋白酶活性值產生一定影響。由圖3可見，哈氏仿對蝦頭部的胰蛋白酶活性最高，新鮮蝦頭的胰蛋白酶活性高達68.83 U/mg，整蝦肉和去頭蝦肉中胰蛋白酶活性分別為15.89和15.41 U/mg，蝦頭中的胰蛋白酶活性超過蝦肉的4倍。隨著冷藏時間的增加，蝦頭中胰蛋白酶活性呈現(xiàn)出較顯著的下降趨勢（P＜0.05），到達6 d，蝦頭胰蛋白酶活性降至50.23 U/mg，下降了27.03%，但仍高于蝦肉；整蝦肉中的胰蛋白酶活性在6 d后上升至31.83 U/mg，這種現(xiàn)象被認為是由于蝦頭中所含的一些胰蛋白酶在儲存過程中逐漸移動到蝦肉中所致，這一觀點與陳詩妍[4]發(fā)現(xiàn)蝦頭胰蛋白酶在貯藏期間能向肌肉擴散和遷移，并參與肌原纖維蛋白的降解，導致組織軟化的研究結果一致。去頭蝦肉中的胰蛋白酶活性在冷藏期間處于下降趨勢，在6 d后降至13.07 U/mg，下降幅度較小，可能是貯藏期間蛋白質發(fā)生降解而引起的胰蛋白酶減少，這與TCA-可溶性肽的變化趨勢一致，同時也印證了肌原纖維蛋白含量的下降。

圖3 哈氏仿對蝦體內胰蛋白酶活性變化情況Fig.3 Changes of trypsin activity in Parapenaeopsis hardwickii

2.5 冷藏過程中哈氏仿對蝦鈣蛋白酶活性變化

蝦肌肉細胞含有許多蛋白酶系統(tǒng)，鈣蛋白酶被認為是誘導死后蝦蛋白水解的主要途徑之一[25]。圖4展示了0℃冷藏條件下，完整蝦肉及去頭蝦肉中鈣蛋白酶活性的變化。隨著冷藏時間的增加，兩組蝦肉中的鈣蛋白酶活性呈現(xiàn)出下降趨勢，分別從6.06、5.84 U/L下降至3.70、3.87 U/L，下降率分別為38.9%、33.7%，且存在顯著性差異（P＜0.05）。完整蝦肉中鈣蛋白酶活性變化程度大于去頭蝦組，可能是由于蝦頭中的內源酶遷移而導致蝦肉中更多的鈣蛋白酶被激活而發(fā)生自溶。師希雄等[26]報道鈣蛋白酶活性的降低是由于其在被鈣離子激活的同時發(fā)生了自溶，最終導致活力的損失，也是其水解肌原纖維蛋白的結果。蝦死后隨著ATP的消耗和pH下降，細胞膜的完整性被破壞，釋放肌質網(wǎng)肌小泡內積蓄的鈣離子，鈣激活蛋白酶被活化發(fā)生自溶[25]。

圖4 哈氏仿對蝦體內鈣蛋白酶活性變化情況Fig.4 Changes of calpain activity in Parapenaeopsis hardwickii

2.6 冷藏過程中哈氏仿對蝦組織蛋白酶B、D、H和L活性變化

組織蛋白酶B、D、H及L是引起蝦死后肌肉降解的主要酶類[27]。從圖5可看出，組織蛋白酶B、D、H、L的活性均隨冷藏時間的延長而下降。從圖5（a）可得，在0～4 d冷藏期間整蝦肉的組織蛋白酶B高于去頭蝦肉，但在6 d后整蝦肉中組織蛋白酶B的活性低于去頭蝦肉?？赡苁且驗槔洳厍捌谡r肉組織蛋白酶B在內源酶的共同作用下，產生較為激烈的分解作用，使得組織蛋白酶B的活性高于去頭蝦肉。在6 d后，在蛋白分解的過程中，組織蛋白酶作為一種蛋白質，也逐漸被分解，其活性則逐漸降低。如圖5（b）所示，組織蛋白酶D在蝦肉中存在比較明顯的變化，整蝦肉與去頭蝦肉分別下降了32.05%、30.07%；在整個冷藏過程中，圖5（c）整蝦肉中組織蛋白酶H的活性始終高于去頭蝦肉，整蝦肉下降了43.23%，而去頭蝦肉下降了76.87%；圖5（d）表明組織蛋白酶L在整蝦肉及去頭蝦肉中的活性分別從9.94 U/L下降到4.16 U/L，從9.63 U/L下降到4.57 U/L。根據(jù)Bechet等[28]的報道，可能是在冷藏前期，隨著蝦肉pH值的下降，蝦肉中的酶原被激活，與運輸至溶酶體的組織蛋白酶反應，從而使組織蛋白酶的活性升高，與Aoki等[29]和李來好等[30]報道的組織蛋白酶可能直接參與哈氏仿對蝦死后冷藏期間肌肉軟化的研究結果一致。

圖5 哈氏仿對蝦體內組織蛋白酶的活性變化情況Fig.5 Changes of cathepsin activities in Parapenaeopsis hardwickii

2.7 亞細胞各部分中組織蛋白酶B、D、H及L活性變化

肌原纖維、線粒體、溶酶體及肌漿中的組織蛋白酶活性的變化趨勢是相似的，在整個貯藏過程中均不斷下降，這與邱恒恒[31]在低溫貯藏白斑狗魚過程中的研究結果一致。在冷藏6 d，溶酶體中的組織蛋白酶活性均顯著下降（P＜0.05），其中下降最明顯的是溶酶體中的組織蛋白酶L的活性，完整蝦組與去頭蝦組分別從下降了61.20%和57.14%，而活性最高的是組織蛋白酶D，完整蝦組與去頭蝦組分別從65.59、61.75 U/L下降至34.63、33.40 U/L，推測是由于組織蛋白酶從破裂的溶酶體中釋放出去，轉移到了其他的亞細胞結構。同理，冷藏后的線粒體及肌原纖維中的組織蛋白酶活性要顯著低于新鮮的哈氏仿對蝦（P＜0.05），這可能是由低溫抑制酶活所引起的。如圖6～圖9所示，在冷藏過程中，完整蝦組與去頭蝦組肌漿中組織蛋白酶活性呈不斷下降趨勢，且在貯藏后期，去頭蝦組肌漿中組織蛋白酶活性顯著低于完整蝦組，在冷藏6 d后，完整蝦組和去頭蝦組肌漿中活性最高的組織蛋白酶D分別下降了50.26%和65.94%。組織蛋白酶D是在生物界中廣泛存在的一種重要的胞內天冬氨酸蛋白酶，從活性高低來看，組織蛋白酶D的活性遠高于另外三種組織蛋白酶，這表明在哈氏仿對蝦死后組織蛋白酶D起著重要的作用[32]。

圖6 哈氏仿對蝦蝦肉各亞細胞組分中組織蛋白酶B的活性變化情況Fig.6 Changes of cathepsin B activity in each subcellular component of Parapenaeopsis hardwickii

圖9 哈氏仿對蝦蝦肉各亞細胞組分中組織蛋白酶L的活性變化情況Fig.9 Changes of cathepsin L activity in each subcellular component of Parapenaeopsis hardwickii

3 結論

通過對哈氏仿對蝦在冷藏過程中品質特性和多種內源酶活性變化研究，發(fā)現(xiàn)隨著貯藏時間的延長，哈氏仿對蝦肌肉的硬度、彈性、內聚性、膠黏性、肌原纖維蛋白含量、鈣蛋白酶和組織蛋白酶活性均下降，其粘附性、TCA-可溶性肽、肌原纖維小片化指數(shù)不斷升高；其中蝦頭及去頭蝦肉中的胰蛋白酶活性隨著冷藏時間的推移下降，而整蝦肉中的活性則是處于上升狀態(tài)；蝦頭胰蛋白酶在貯藏期間能向肌肉擴散和遷移，并參與肌原纖維蛋白的降解，使其酶的活性下降；去頭蝦肉中胰蛋白酶作為一種蛋白質在貯藏的過程中逐漸被分解，使得胰蛋白酶的活性下降。在亞細胞各部分中，完整蝦組的酶活性均高于去頭蝦組。由此可得，冷藏條件下去頭的方式更適合哈氏仿對蝦的貯藏。

圖8 哈氏仿對蝦蝦肉各亞細胞組分中組織蛋白酶H的活性變化情況Fig.8 Changes of cathepsin H activity in each subcellular component of Parapenaeopsis hardwickii