赤霉素對(duì)鹽脅迫誘導(dǎo)黍子幼苗根氧化損傷的影響

王金香，幸麗璇，王艷芝，周利青，王志超

（山西大同大學(xué)農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院/設(shè)施農(nóng)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，山西 大同，037009）

鈉是植物體內(nèi)必需的離子，同時(shí)更是土壤環(huán)境中對(duì)植物生長(zhǎng)影響范圍廣泛的一種生態(tài)因子。一定的鹽量是植物進(jìn)行生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，但鹽濃度增大則影響植物生長(zhǎng)。北方地區(qū)降雨量少、水分蒸發(fā)大，大量鹽分沉積在淺層土壤中，加劇土壤的干旱和鹽堿化。除沿海地區(qū)外，我國(guó)鹽堿土地主要分布于降雨量較少的西北、華北和東北區(qū)域。山西地處我國(guó)華北地區(qū)，現(xiàn)有鹽堿地26萬(wàn)hm2，其中93%集中分布在大同、忻州、晉中、運(yùn)城四大盆地；輕度和中度鹽堿地分別占比42%及22%，其余為重度鹽堿地和鹽堿荒地[1]。土壤鹽漬化對(duì)農(nóng)作物造成離子脅迫和滲透脅迫，抑制組織、器官的生長(zhǎng)，加速植物衰老，導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)等[2]。此外，鹽脅迫會(huì)伴隨活性氧(ROS)的產(chǎn)生，對(duì)植物細(xì)胞不同組分造成氧化損傷，從而破壞機(jī)體正常的生命代謝活動(dòng)，引發(fā)次生氧化脅迫[3]。

黍子(Panicum miliaceumL.)是北方地區(qū)一種特色小雜糧作物，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和益生作用，在山西以北地區(qū)黍子被廣泛種植?！G寶’糯黍子口感好、產(chǎn)量高，頗受人們喜愛(ài)，但該品種對(duì)鹽堿地的適應(yīng)能力有待研究。赤霉素（Gibberellins，GA3）是一種植物內(nèi)源性激素，在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中有著重要作用。有研究顯示，GA3可緩解鹽脅迫對(duì)水稻（Oryza sativaL.）和番茄（Solanum lycopersicum）種子萌發(fā)的抑制作用，有利于甜玉米（Zea mayL.）和黃芪（Astragalus membranaceus）苗期的發(fā)育[4-7]。本研究選用‘綠寶’糯黍子為試驗(yàn)材料，用不同濃度的NaCl溶液對(duì)幼苗進(jìn)行脅迫處理，探討鹽脅迫對(duì)幼苗生長(zhǎng)和根系氧化脅迫作用，確定‘綠寶’糯黍子對(duì)鹽的適應(yīng)能力；鹽脅迫同時(shí)施加GA3進(jìn)一步探究激素對(duì)鹽脅迫引發(fā)的氧化脅迫的影響，為利用外源調(diào)節(jié)物質(zhì)提高作物耐鹽性、有效利用鹽堿土地進(jìn)行農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘綠寶’糯黍子，購(gòu)買(mǎi)于山西省晉中市太谷縣。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 鹽脅迫處理 挑選籽粒飽滿的種子，用5%NaClO消毒、清水沖洗后，將種子均勻鋪灑在育苗盤(pán)中，放入25℃培養(yǎng)箱、黑暗條件下萌發(fā)生長(zhǎng)。每盤(pán)保留長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，分別置于0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%NaCl溶液（用Hoagland溶液配制）處理[光周期12 h，溫度28/23℃(晝/夜)，光照強(qiáng)度200 mol·m-2·s-1]，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每天更換培養(yǎng)液。鹽處理第3天測(cè)量幼苗的根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)，連續(xù)統(tǒng)計(jì)5 d，確定幼苗的鹽耐受濃度。鹽處理至第8天取根，進(jìn)行抗氧化酶[過(guò)氧化氫酶(CAT)和過(guò)氧化物酶(POD)]、過(guò)氧化氫(H2O2)、丙二醛(MDA)及電導(dǎo)率檢測(cè)。

1.2.2 GA3處理0.2% NaCl溶液中添加濃度為120 mg·L-1的GA3對(duì)黍子幼苗進(jìn)行NaCl+GA3混合處理，進(jìn)行鹽脅迫緩解試驗(yàn)，分別以0、0.2%NaCl為對(duì)照，培養(yǎng)條件同上，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。在處理第5天測(cè)量根長(zhǎng)，連續(xù)統(tǒng)計(jì)4 d，NaCl+GA3處理8 d進(jìn)行抗氧化酶、H2O2、MDA，以及電導(dǎo)率檢測(cè)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)測(cè)定 每一處理組隨機(jī)挑取10株幼苗進(jìn)行根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)的測(cè)量，根冠比為同一株植物根長(zhǎng)與芽長(zhǎng)的比值，試驗(yàn)結(jié)果為平均值±S.E.。

1.3.2 抗氧化酶活性、H2O2和MDA含量及電導(dǎo)率測(cè)定CAT活性測(cè)定采用KMnO4滴定法，POD活性測(cè)定利用愈創(chuàng)木酚氧化法，H2O2含量根據(jù)硫酸鈦-硫酸法，MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[8]。電導(dǎo)率測(cè)定利用DDS-22C電導(dǎo)率儀測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS（21.0）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，采用Excel 2010進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)‘綠寶’糯黍子幼苗生長(zhǎng)影響

2.1.1 鹽脅迫對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響 如圖1-A所示，鹽脅迫對(duì)‘綠寶’糯黍子苗期芽的生長(zhǎng)產(chǎn)生強(qiáng)烈抑制作用，鹽濃度越高，芽的生長(zhǎng)越緩慢、抑制作用越明顯，鹽脅迫第8天，5個(gè)鹽脅迫組芽長(zhǎng)分別是對(duì)照組的87%、81%、64%、56%、54%。圖1-B為根的長(zhǎng)度，對(duì)照組幼苗的根平均以0.74 cm·d-1的生長(zhǎng)速度向下延伸，根的伸長(zhǎng)作用明顯；鹽脅迫處理后幼根生長(zhǎng)速度明顯減緩，在試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)的3～8 d，每個(gè)鹽脅迫組幼苗根的長(zhǎng)度都顯著低于對(duì)照組，在3個(gè)低鹽濃度組（0.1%、0.2%和0.3%）幼根分別以0.32、0.32、0.24 cm·d-1的平均速度生長(zhǎng)，而0.4%和0.5%脅迫組幼根的生長(zhǎng)速度僅為0.12、0.11 cm·d-1。圖1-C為幼苗根冠比，幼苗生長(zhǎng)第8天，對(duì)照組根冠比接近0.90，鹽脅迫組根冠比顯著下降，低鹽組（0.1%、0.2%和0.3%）根冠比約0.51，鹽濃度繼續(xù)升高，根冠比降至0.36。上述結(jié)果表明，幼苗芽和根的生長(zhǎng)因鹽脅迫受到抑制，鹽濃度越高生長(zhǎng)越緩慢，且當(dāng)鹽濃度≥0.4%時(shí)，根的生長(zhǎng)幾乎停止，根冠比顯著下降。0.3%為‘綠寶’糯黍子苗期根系耐受鹽脅迫的最高濃度。

圖1 鹽脅迫對(duì)‘綠寶’糯黍子幼苗生長(zhǎng)的影響

2.1.2 鹽脅迫對(duì)幼苗根中抗氧化酶活性的影響 由圖2-A可知，鹽脅迫后根中CAT活性顯著低于對(duì)照，且活性與鹽濃度呈負(fù)相關(guān)性，0.3%鹽脅迫組CAT活性最低，僅為對(duì)照組的25%。與CAT活性變化不同，對(duì)照組POD活性處于較低水平，鹽脅迫后根中POD活性顯著增加，0.1%鹽脅迫組POD活性比對(duì)照增加了63%，0.2%和0.3%鹽脅迫組活性分別增加了70%、107%（圖2-B）。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明，在非脅迫環(huán)境中‘綠寶’糯黍子幼苗CAT活性保持較高水平、POD活性較低，CAT主要負(fù)責(zé)機(jī)體中H2O2分解和清除，維持機(jī)體低氧狀態(tài)；鹽脅迫后CAT活性降低而POD活性顯著升高，這表明長(zhǎng)時(shí)間鹽脅迫引起CAT活性降低和抗氧化功能下降，而鹽脅迫誘導(dǎo)POD活性升高并有效分解H2O2，減輕逆境對(duì)幼苗的損傷。

圖2 鹽脅迫對(duì)‘綠寶’糯黍子幼苗根中CAT和POD活性的影響

2.1.3 鹽脅迫對(duì)幼苗根中H2O2、MDA含量及電導(dǎo)率的影響 鹽脅迫后，幼苗根的生長(zhǎng)明顯減緩且根部發(fā)黃，根部H2O2含量變化顯示（圖3-A），鹽脅迫引發(fā)根中H2O2含量顯著增加并與鹽濃度呈正相關(guān)性，鹽濃度為0.3%時(shí)，根中H2O2含量達(dá)到最高，為對(duì)照2.48倍。如圖3-B所示，對(duì)照組MDA含量低、膜脂過(guò)氧化程度低、細(xì)胞膜完整；隨著鹽脅迫濃度的增高，鹽脅迫組MDA含量不斷增加，鹽濃度為0.1%時(shí)，根中MDA含量增加7.4%，與對(duì)照無(wú)顯著差異；當(dāng)鹽濃度為0.2%、0.3%時(shí)，根中MDA含量顯著增加，分別為對(duì)照的164%、167%。由圖3-C可知，幼苗受到0.1%、0.2%鹽脅迫后，根系電導(dǎo)率與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，鹽濃度為0.3%時(shí)根系膜透性增加，電導(dǎo)率明顯升高，比對(duì)照組增加了約29%。以上結(jié)果表明，鹽脅迫誘導(dǎo)根中ROS的產(chǎn)生和積累，引發(fā)膜脂過(guò)氧化反應(yīng)，膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；當(dāng)鹽濃度達(dá)到0.3%時(shí)，MDA含量增加和電導(dǎo)率值的顯著升高都表明鹽脅迫后細(xì)胞膜的完整性在一定程度上被破壞，膜的通透性增加。

圖3 鹽脅迫對(duì)‘綠寶’糯黍子幼苗根中H2O2、MDA含量和電導(dǎo)率的影響

2.2 赤霉素對(duì)鹽脅迫下‘綠寶’糯黍子幼苗生長(zhǎng)及抗氧化反應(yīng)的影響

2.2.1 赤霉素對(duì)鹽脅迫下幼苗生長(zhǎng)的影響 如4所示，0.2%鹽脅迫處理下，幼苗的生長(zhǎng)受到顯著抑制，幼根與幼芽的長(zhǎng)度低于對(duì)照幼苗；鹽脅迫同時(shí)施加120 mg·L-1GA3能促進(jìn)根與芽的生長(zhǎng)，緩解鹽脅迫對(duì)幼苗生長(zhǎng)的抑制作用。由圖5-A可知，鹽脅迫同時(shí)加入GA3可促進(jìn)根系生長(zhǎng)，生長(zhǎng)至第8天時(shí)根長(zhǎng)是鹽脅迫的138%，是對(duì)照組的63%。由圖5-B可知，鹽脅迫降低了幼苗的根冠比，添加GA3后根冠比沒(méi)有顯著提升。以上結(jié)果表明，GA3能夠在一定程度上能夠緩解鹽脅迫對(duì)根系生長(zhǎng)的抑制。

圖5 GA3對(duì)鹽脅迫下‘綠寶’糯黍子幼苗生長(zhǎng)的影響

2.2.2 赤霉素對(duì)鹽脅迫下幼苗根中抗氧化酶活性的影響 由圖6-A可知，單獨(dú)鹽脅迫組CAT活性低于對(duì)照組，GA3+NaCl處理后根中CAT活性顯著升高，活性分別比單鹽脅迫和對(duì)照提高了205%、52.5%。與CAT活性變化不同，幼苗在受到鹽脅迫后，根中POD活性明顯升高，是對(duì)照組的170%，GA3+NaCl處理根中POD活性顯著下降，低于鹽脅迫組，與對(duì)照組POD活性一致（圖6-B）。上述結(jié)果表明，鹽脅迫處理后，CAT活性被抑制，POD被誘導(dǎo)激活、抗氧化能力提高；添加GA3能有效改善鹽脅迫下根系的氧化還原狀態(tài)，H2O2量減少，POD活性降低；GA3促進(jìn)了CAT的抗氧化作用，降低根系的氧化損傷，促進(jìn)植物根的生長(zhǎng)。

圖6 GA3對(duì)鹽脅迫下‘綠寶’糯黍子幼苗根中CAT和POD活性的影響

2.2.3 赤霉素對(duì)鹽脅迫下幼苗根系H2O2、MDA含量和電導(dǎo)率的影響 圖7為根系顏色變化，對(duì)照組幼根長(zhǎng)且發(fā)白、末端稍有黃色，鹽脅迫后根短小、顏色變黃加深，鹽脅迫同時(shí)添加GA3幼苗根系顏色呈現(xiàn)乳白色。圖8-A為根系H2O2含量變化圖，鹽脅迫誘導(dǎo)根中H2O2積累，添加了GA3后H2O2含量顯著降低。由圖8-B可知，鹽脅迫引起幼苗根中MDA含量顯著提高、膜脂過(guò)氧化水平升高，外施GA3后根中MDA含量比單獨(dú)鹽脅迫組下降58.5%，含量接近對(duì)照組。同時(shí)鹽脅迫也引起根中電導(dǎo)率上升，外施GA3后根的電導(dǎo)率下降至對(duì)照水平（圖8-C）。根系顏色和H2O2含量的變化都表明鹽脅迫誘導(dǎo)根系ROS水平上升，膜結(jié)構(gòu)受到氧化損傷、膜透性增加；鹽脅迫同時(shí)添加GA3根中H2O2含量減少，膜的損傷減弱，即GA3緩解了鹽脅迫產(chǎn)生的次生氧化脅迫。

3 結(jié)論與討論

土壤干旱、鹽堿化等非生物脅迫是制約植物生長(zhǎng)發(fā)育、影響作物品質(zhì)和產(chǎn)量的主要環(huán)境因子。根系直接與土壤接觸，負(fù)責(zé)水分和無(wú)機(jī)鹽的吸收，土壤鹽脅迫直接作用于植物的根系，對(duì)根系的生長(zhǎng)發(fā)育與形態(tài)建成都具有重大的影響。水稻和玉米幼苗在受到鹽脅迫后根的生長(zhǎng)受到抑制，根長(zhǎng)、體積、干質(zhì)量及根冠比均顯著下降，根系性狀的變化影響最終產(chǎn)量[9-10]。與以上研究一致，鹽脅迫抑制了‘綠寶’糯黍子幼苗的生長(zhǎng)，當(dāng)濃度高于0.3%時(shí)，芽的生長(zhǎng)減緩，根的生長(zhǎng)幾乎停滯，根冠比下降。鹽脅迫的毒性在于它打破了機(jī)體離子平衡和滲透平衡，同時(shí)引起根系氧化還原狀態(tài)的失衡，誘導(dǎo)ROS積累[9]。根系大量ROS產(chǎn)生和積累會(huì)迅速引發(fā)生物大分子尤其是膜脂氧化和膜結(jié)構(gòu)的破壞，這種細(xì)胞損傷可以直接導(dǎo)致膜透性改變、根系電解質(zhì)外滲[2，11]。鹽脅迫8 d引起苜蓿（Medicago sativaL.）幼苗根系H2O2、羥自由基(·OH)含量升高和超氧陰離子(O2·-)產(chǎn)生速率增加，同時(shí)膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量顯著增加[12]。玉米及水稻幼苗遭受鹽脅迫時(shí)根系發(fā)生氧化脅迫，細(xì)胞膜透性增加，MDA含量顯著升高[13-14]。在本研究中，黍子幼苗在受到鹽脅迫后不僅根生長(zhǎng)緩慢，同時(shí)根系出現(xiàn)不同程度的褐化（褐化是生物氧化的一種表現(xiàn)），H2O2含量檢測(cè)也表明鹽脅迫加劇了根系H2O2的產(chǎn)生。H2O2大量產(chǎn)生、MDA含量和電導(dǎo)率顯著升高都表明，鹽脅迫對(duì)黍子幼苗根系細(xì)胞造成氧化脅迫，膜受到破壞、完整性降低，根系活力下降。

增加抗氧化物質(zhì)含量或提高抗氧化酶活性是植物受到鹽脅迫后產(chǎn)生的主要應(yīng)激反應(yīng)，以應(yīng)對(duì)鹽脅迫產(chǎn)生的氧化脅迫，降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。因此，抗氧化酶活性高低直接反映作物對(duì)鹽脅迫的耐受性[15]。低鹽脅迫（50 mM）會(huì)使綠豆（Vigna radiata）幼苗的SOD和POD活性升高[16]；玉米幼苗根系在受到80 mM鹽處理后，SOD、CAT和POD活性顯著增加[13]。藜麥（Chenopodium quinoa）在低鹽脅迫時(shí)CAT和POD活性升高，高鹽濃度時(shí)2種酶活性降低[17]。本研究表明，‘綠寶’糯黍子幼苗在鹽脅迫（0.1%～0.3%）8 d后，CAT活性出現(xiàn)下降，但POD活性升高，即長(zhǎng)時(shí)間鹽脅迫CAT抗氧化能力逐漸下降，POD作為一種誘導(dǎo)性酶在鹽脅迫后期活性升高，分解H2O2、減輕逆境對(duì)幼苗的損傷。以上試驗(yàn)現(xiàn)象表明，2種抗氧化酶在鹽脅迫的不同階段發(fā)揮抗氧化作用，在鹽脅迫早期，機(jī)體內(nèi)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)主要通過(guò)調(diào)節(jié)CAT活性，提高機(jī)體抗氧化能力；當(dāng)脅迫持續(xù)進(jìn)行時(shí)，信號(hào)通路激活POD參與ROS的清除，降低鹽脅迫造成的氧化損傷。與上述試驗(yàn)結(jié)果一致，小麥根系在受到鹽脅迫后CAT活力首先上升，處理6 d后CAT活力迅速降低；POD活力變化表現(xiàn)為1～6 d活力下降，6 d后緩慢上升[18]。當(dāng)鹽脅迫誘導(dǎo)H2O2產(chǎn)生超出2種抗氧化酶的清除能力，H2O2不斷積累導(dǎo)致根系細(xì)胞受損，細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)停滯，根的生長(zhǎng)減緩甚至停滯。

GA是一種植物激素，能促進(jìn)種子萌發(fā)、植物開(kāi)花和果實(shí)發(fā)育等，在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫抑制擬南芥（Arabidopsis thaliana）根的生長(zhǎng)與GA在根中含量下降和DELLA蛋白積累密切相關(guān)，而DELLA作為一種轉(zhuǎn)錄蛋白則抑制細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)[19]。外施GA緩解水稻幼苗受到的鹽傷害，提高水稻幼苗苗高、主胚根長(zhǎng)、地上部和地下部干質(zhì)量，GA3處理效果最佳[20]。GA可提高玉米幼苗SOD和CAT的活性，有效緩解鹽脅迫的氧化傷害[7]。本研究表明，外施GA3一定程度緩解鹽脅迫對(duì)‘綠寶’糯黍子根系生長(zhǎng)的抑制作用，CAT活性明顯升高、而POD活性恢復(fù)至對(duì)照水平，根的褐化作用減弱且H2O2含量明顯減少，MDA含量和電導(dǎo)率降低，氧化損傷減弱。這些結(jié)果顯示，GA3能提高抗氧化酶活性,緩解鹽脅迫對(duì)根的氧化損傷，提高耐鹽性，一定程度上保證了幼苗根部細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的正常，有助于黍子在低鹽土壤中的生存。綜上所述，‘綠寶’糯黍子幼苗期耐鹽性較弱，0.3%的鹽濃度為該品種的耐受濃度；鹽脅迫顯著抑制根的生長(zhǎng)，根系抗氧化能力下降，活性氧積累、膜發(fā)生氧化損傷、細(xì)胞通透性降低；GA3能夠充分緩解鹽脅迫對(duì)根的抑制作用，降低次生氧化脅迫對(duì)根的危害，提高‘綠寶’糯黍子的耐鹽性。