直腸癌DCE-MRI 紋理分析預測Ki67 表達狀態(tài)的價值

劉宇卉，陳安良，武敬君，劉鐵利，趙 瑩，王 凱，劉愛連

（1.大連醫(yī)科大學醫(yī)學影像學院，遼寧 大連 116044；2.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院放射科，遼寧 大連 116011）

分子生物學標記物近年來被廣泛應用在評估直腸癌術前輔助治療病理反應和預后預測中[1-5]。直腸癌的發(fā)生、發(fā)展與腸上皮細胞的凋亡、增殖速度密切相關，增殖細胞核抗原Ki67 是一種非組蛋白核蛋白，在除細胞靜止期（G0 期）以外的細胞周期的每個活躍期表達，也是分裂細胞中核糖體合成的重要因素，Ki67 蛋白被蛋白酶降解后半衰期縮短，其能用來判斷腫瘤細胞的增殖活性[6]，有研究證實Ki67 在直腸癌及其他癌癥中的表達可在一定程度上反映患者的預后[7]。目前Ki67 的檢測主要依賴于手術切除樣品或活檢的免疫組化分析，考慮到腫瘤的異質性，特別是較大的腫瘤，這種方法有一定的局限性。動態(tài)對比增強磁共振成像（Dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging，DCE-MRI）技術是檢出直腸病變的高敏感技術，可從形態(tài)學及血流動力學等方面探索癌灶內部的生物學特征，反映腫瘤血管生成的程度以及血管通透性。直腸癌腫瘤新生血管的血管壁成熟性差、動靜脈血管間相交通、基底膜完整且血管通透性高等特點，可造成直腸癌微循環(huán)不均衡現(xiàn)象的出現(xiàn)，而DCE-MRI 評價直腸癌微循環(huán)的病理基礎與此存在關聯(lián)，間接反映組織生物學行為。但目前仍缺少DCE-MRl 紋理分析在直腸癌中的研究。本研究應用DCE-MRI 紋理分析方法得出DCE-MRI 紋理特征參數(shù)與直腸癌中生物學標志物Ki67 的可能關聯(lián)，在術前預測直腸癌Ki67 表達狀態(tài)，從而為直腸癌的治療以及術后評估等提供更多的參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象

回顧性收集2015 年9 月—2020 年3 月于大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院行盆腔DCE-MRI 掃描的原發(fā)性直腸腺癌患者91 例。其中，Ki67 高表達組56例（男42例，女14例，平均年齡（66.29±10.92）歲），低表達組35 例（男25例，女10例，平均年齡（63.69±8.29）歲）。本研究經過大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（批準文號：PJ-KSKY-2019-49），免除知情同意。納入標準：①經手術病理檢查結合分子生物學標記物Ki67 的免疫組化檢測，病理為直腸腺癌；②MRI 檢查后1 月內進行手術治療，未經任何免疫治療及新輔助放化療；③臨床、病理、影像資料完整。排除標準：①MRI 檢查前已行抗癌治療或手術治療；②病理類型非腺癌（包含腺鱗癌、鱗狀細胞癌、印戒細胞癌等）；③圖像質量不佳或病灶顯示不佳，不利于感興趣區(qū)的勾畫；④有遠隔轉移，不易手術。

1.2 掃描方法及參數(shù)

評估患者無MRI 檢查禁忌及相關病史后，囑咐患者于檢查前3 d 低脂、少渣飲食，檢查前6 h 禁食水。選用3.0T MR（Signa HDxt，GE MedicalSystems，Milwaukee，WI，USA）掃描儀，配體部8 通道相控陣表面線圈，指導患者采取仰臥位。自兩側骶髂關節(jié)連線水平至恥骨聯(lián)合下緣水平范圍內，對患者行盆腔掃描，掃描序列為常規(guī)DWI、T2WI、DCE-MRI。掃描參數(shù)見表1，掃描啟動時間是1 期之后，灌注期相39，本研究選用的對比劑為GE 藥業(yè)生產的釓雙胺注射液（Gd-DTPA-BMA，歐乃影），通過靜脈注射的方式，按照0.1 mmol/kg 的劑量，以2.5 mL/s 的速率，將對比劑注入肘靜脈，注射后用20 mL 生理鹽水沖管。

表1 3.0T MRI 掃描序列及參數(shù)

1.3 圖像分析與測量

將DCE-MRI 圖像導入GE Functool 4.6 工作站后，通過GenIQ 軟件進一步完成DCE-MRI 的后處理，以DICOM 格式導出轉運常數(shù)（Ktrans）、速率常數(shù)（Kep）、血管外細胞間隙體積百分數(shù)（Ve）圖像，并導入ITK-SNAP 3.6 軟件（https：//www.softpedia.com/get/Science-CAD/itk-Snap.shtml），由兩名影像診斷醫(yī)師（年資分別為8 年和5 年）勾畫病灶，紋理分析過程中，采用雙盲法在每例患者的DCE-MRI Ktrans、Kep、Ve后處理圖像中，選取包括病灶的最佳、最大層面和相鄰上下兩個層面增厚腸壁的邊緣，并將3 個層面的感興趣區(qū)（Region of interest，ROI）融合成1 個容積感興趣區(qū)（Volume of interest，VOI），包含腫瘤壞死、出血及鈣化區(qū)域，并盡量避開周圍脂肪及內容物，分別測量并記錄Ki67 高低表達組基于Ktrans、Kep、Ve后處理圖像的紋理特征參數(shù)，包括最大強度值（Max intensity）、中等強度（Median intensity）、均值（Meanvalue）、最小強度值（Min intensity）、偏度（Skewness）、峰度（Kurtosis）、熵（Entropy）、能量（Energy）、群集顯著性（Cluster prominence）、集群陰影（Cluster shade）、相關性（Correlation）、慣性矩（Inertia）（圖1）。

1.4 Ki67 免疫組化蛋白檢測

本研究中所有直腸癌患者的手術病理標本均由本院病理科醫(yī)生統(tǒng)一檢測完成。

Ki67 陽性表達定位于細胞核，于100 倍光鏡下任選5 個視野進行觀察，同時分別計數(shù)5 個視野中100 個細胞的陽性細胞數(shù)。陽性細胞數(shù)的判定標準如下：<5%為（-），5%～<25%為（+），25%～<50%為（++），50%～<75%為（+++），≥75%為（++++）。當P53 的陽性細胞數(shù)<50%時，屬于低表達組，反之為高表達組[8-9]（圖2）。

1.5 統(tǒng)計學分析

運用SPSS 23.0 統(tǒng)計學軟件進行相關數(shù)據的統(tǒng)計分析。采用組內相關系數(shù)（Intraclass correlation coefficients，ICC）對兩位觀察者所測數(shù)據的一致性進行檢測，當ICC值>0.75，即一致性良好時，采用高年資醫(yī)師測量數(shù)據進行后續(xù)比較。比較兩位觀察者所測數(shù)據的正態(tài)性，采用Shapiro-Wilk 正態(tài)性檢驗。數(shù)據滿足正態(tài)分布時，采用獨立樣本t 檢驗，統(tǒng)計描述為均數(shù)±標準差（），統(tǒng)計量為t值；反之，采用Mann-Whitney U 檢驗，統(tǒng)計描述為中位數(shù)（25%，75%），統(tǒng)計量為Z值。應用受試者工作特征（Receiver operating characteristic，ROC）曲線分析DCEMRI 的有統(tǒng)計學差異的紋理特征參數(shù)的鑒別效能、靈敏度、特異度及95%置信區(qū)間（Confidence interval，CI）；應用二元Logistics 回歸分析聯(lián)合DCEMRI 紋理特征參數(shù)進行效能分析，用Delong 檢驗對各單一參數(shù)模型的AUC 進行比較，并對聯(lián)合模型AUC 與各單一參數(shù)模型的AUC 進行比較，P<0.05時差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

直腸癌患者Ki67 低表達組和高表達組的臨床一般資料及比較結果見表2。

表2 Ki67、P53 低表達組和高表達組患者的臨床一般資料

2.2 兩名觀察者測量數(shù)據的一致性檢驗

觀察者一和觀察者二所測量的DCE-MRI 紋理特征參 數(shù)Max intensity、Median intensity、Mean val ue、Min intensity、Skewness、Kurtosis、Entropy、Energy、Cluster prominence、Cluster shade、Correlation、Inertia的ICC值分別 為0.997、0.964、0.948、0.874、0.992、0.893、0.996、0.903、0.995、0.994、0.993、0.986，一 致性良好，ICC值均＞0.75。

2.3 Ki67 兩組紋理特征參數(shù)的測量結果比較

Ki67 高表達組紋理參數(shù)Max intensityKtrans（1.48（0.99，2.71））、EnergyKtrans（4.76±1.45）、Maxi ntensityKep（10.01±6.31）、EnergyKep（3.28±2.44）、EntropyKep（5.28（4.80，5.52））值均大于低表達組Max intensityKtrans（0.92（0.53，1.34））、EnergyKtrans（1.90±2.49）、Max intensityKep（7.30±5.35）、EnergyKep（1.66±2.17）、EntropyKep（4.65（4.14，5.25）），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表3）。

表3 Ki67 低表達組和高表達組的紋理特征參數(shù)的測量結果比較

2.4 Ki67 高低表達組紋理特征參數(shù)的效能分析

通過對Ktrans、Ve、Kep3 個后處理圖像的紋理特征參數(shù)進行效能分析，得到有統(tǒng)計學差異的紋理特征參數(shù)的曲線下面積（AUC）分別為0.758（Max intensityKtrans）、0.826（EnergyKtrans）、0.650（Max intensityKep）、0.748（EnergyKep）、0.716（EntropyKep），其中單個參數(shù)診斷效能最高的是EnergyKtrans，AUC 為0.826。聯(lián)合有統(tǒng)計學差異的紋理特征參數(shù)得到聯(lián)合診斷效能，AUC 為0.947，靈敏度91.1%（表4，圖3）。經Delong 檢驗，Ki67 兩組間差異有統(tǒng)計學意義的紋理特征參數(shù)聯(lián)合模型的AUC 大于單一參數(shù)模型Max intensityKtrans、EnergyKtrans、Max intensityKep、EnergyKep、EntropyKep的AUC，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表5）。

表4 Ki67 低表達組和高表達組紋理特征參數(shù)的效能分析

表5 Ki67 兩組間參數(shù)聯(lián)合和單一參數(shù)經Delong 檢驗結果比較

采用Logistic 回歸分析，將Ki67 兩組間差異有統(tǒng)計學意義的紋理特征參數(shù)依據加權系數(shù)進行聯(lián)合，回歸模型：-15.978+1.228×Max intensityKtrans+2.110×EnergyKtrans-0.102×Max intensityKep-1.443×EnergyKep+2.531×EntropyKep。

3 討論

近年來DCE-MRI 在直腸癌診療中的得到廣泛應用，它通過分析對比劑進出腫瘤的過程，提供腫瘤組織血管特性的定量指標，是一種血流動力學和形態(tài)學相結合的功能性影像技術[10]。在常規(guī)MRI 和DCE-MRI 的基礎上利用人工智能方法分析直腸癌腫瘤異質性[11-13]，挖掘直腸癌病變信息，使DCE-MRI 數(shù)據能夠量化的反映組織灌注和毛細血管通透性等病理特征，多用于臨床病例的智能診斷、評估和預測等研究[14]。

本研究采用紋理分析方法研究直腸癌Ki67 表達與DCE-MRI 定量成像特征之間的潛在聯(lián)系，研究結果發(fā)現(xiàn)Ki67 高表達組的Max intensity值相對更高，表明其ROI 的強度分布特征更強，表達程度與體素值呈正相關。Ki67 高表達組Energy、Entropy高于低表達組，強度水平分布的均勻性可通過Energy 測量獲得，如果能量值較高值為高，那么分布會有較小數(shù)量的強度水平；強度水平上的系數(shù)值分布的隨機性則是通過Entropy 測量獲得，如果Entropy的值高，則該分布會出現(xiàn)在圖像中更多高強度水平之間，在簡單的圖像中，Entropy值較低，而在復雜圖像中，Entropy值較高。以上結果說明Ki67 在腫瘤細胞中高表達時，隨腫瘤細胞分化程度降低，腫瘤紋理特性更強，圖像紋理信息量越大，從而潛在地描述了腫瘤的異質性，揭示了發(fā)生Ki67 高表達組的直腸癌腫瘤與正常腸壁組織的病理生理上的改變，推測可能與腫瘤組織的血供改變、出血壞死區(qū)域分布、乏氧狀態(tài)甚至基因改變等因素相關[15-17]。在胰腺癌和乳腺癌中均有研究表明，病理分級越高的腫瘤可表現(xiàn)出更高的Entropy值和更高的Max intensity值，且表明乳腺癌Ki67 低表達組的Energy、Entropy值均小于Ki67 高表達組，與本研究的結果相似[18-19]。

這些特征的表示表明Ki67 高表達的病變更有可能是異質性的，腫瘤的異質性一方面與血管外細胞外基質、血管生成和細胞結構有關，另一方面還與腫瘤內出血和壞死區(qū)域的不均勻不一致的變化特點有關，這可以解釋為Ki67 高表達者具有更多的生物增殖特性，攝取的體素更均勻，像素灰度頻率的分布特征更高[20]。然而，這些發(fā)現(xiàn)需要在未來通過更多的研究進一步評估。

本研究的主要不足有以下兩點：一是樣本量相對較小，選擇的研究方式為回顧性研究，因此最終獲得的研究成果可能存在一定的偏差，今后的研究中應增大樣本量，保證研究的科學性、可靠性，同時開展前瞻性研究，結果更有說服力；二是結合腫瘤相鄰上下兩個層面以及最大層面的情況可以看出，通過人工的方式對ROI 進行勾畫，可能存在主觀性判斷的問題。

本研究結果顯示，當僅考慮直腸癌組織的某個紋理特征參數(shù)時，多數(shù)情況下其評估價值有限，而把Ki67 高低表達組有統(tǒng)計學差異的紋理特征參數(shù)聯(lián)合分析，其診斷效能提升至0.947，此時判斷Ki67 表達的靈敏度為91.1%，因此利用有組間差異的紋理特征參數(shù)進行聯(lián)合分析有望作為預測直腸癌Ki67表達狀態(tài)的一個良好的影像學方法。