雙標(biāo)線性校正法用于川黃芩的多成分定性分析

張 毅，周洪旭，孟大利，侯立新*

（1. 重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，重慶 400000；2. 沈陽藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

中藥的質(zhì)量控制對中藥的安全性和有效性具有重要意義。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是中藥定性和定量分析的重要依據(jù)。隨著中藥質(zhì)量控制的發(fā)展，對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的需求越來越大，而中藥對照品由于其提取分離困難、成本高昂、不穩(wěn)定等諸多因素，極大地影響了中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和發(fā)展[1]。因此，建立中藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)替代測定法是解決以上問題的有效途徑之一。目前已開發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)替代測定法包括校正因子法[2]、一測多評法（quantitative analysis of multicomponents by single marker，QAMS）[3-4]、替代對照品法[5]、雙標(biāo)線性校正法（linear calibration using two reference substances，LCTRS）[6-10]等。雙標(biāo)線性校正法是用兩個(gè)對照品進(jìn)行色譜峰定位，顯著提高了定位的準(zhǔn)確度和色譜柱的適用性。

川黃芩為唇形科植物滇黃芩Scutellaria amoena C. H. Wright、連翹葉黃芩Scutellaria hypericifolia Levl.或韌黃芩展毛變種Scutellaria tenax W. W.Smith Var. patentipilosa (Hand. Mazz.) C. Y. Wu的干燥根。性味苦寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效[11]?，F(xiàn)代植物化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，川黃芩中主要成分為黃酮及黃酮苷類化合物、二氫黃酮及二氫黃酮醇類化合物、木質(zhì)素、酚苷、醇苷類化合物等[12-13]。已報(bào)道黃酮類成分主要包括黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A、漢黃芩素、黃芩素等。黃芩苷為川黃芩主要化學(xué)成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷具有抗氧化及清除自由基[14]、抗病毒[15-16]、抗腫瘤[17]、對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)[18]、保肝[19]、調(diào)節(jié)脂代謝[20]等藥理作用。

川黃芩現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（2015年版四川省中藥飲片炮制規(guī)范）中還未有定性鑒別內(nèi)容，因此本研究采用雙標(biāo)線性校正法對川黃芩中5個(gè)成分進(jìn)行定性鑒別，填補(bǔ)了川黃芩質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的空白。與相對保留時(shí)間法比較，雙標(biāo)線性校正法的預(yù)測精度更高，適用的色譜柱范圍更廣，明顯優(yōu)于相對保留時(shí)間法。雙標(biāo)線性校正法的建立可為后續(xù)川黃芩的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考和依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity II高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；Waters e2695-2998 PAD高效液相色譜儀（沃特世科技有限公司），3臺儀器依次稱為LC1～LC3。KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DP-02無油真空泵（天津市富城達(dá)科技有限公司）；ME204T/02萬分之一天平（梅特勒-托利多公司）；Mill-Q Synergy型超純水儀器（默克密理博公司）；HWS-26型恒溫水浴鍋（上海精密儀器有限公司）。色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）信息見表1。

表1 色譜柱信息

1.2 藥品與試劑

黃芩苷對照品（批號：110715-201720，含量：93.5 %，中國食品藥品檢定研究院）；黃芩素對照品（批號：111595-200905，含量：98.5 %，中國食品藥品檢定研究院）；漢黃芩苷（批號：111595-200905，含量：98.5 %，中國食品藥品檢定研究院）；千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（批號：F306-PS011092，含量：98.0 %，成都普思生物科技股份有限公司）；乙腈（色譜純，安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司）；甲醇（色譜純，安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司）；去離子水為經(jīng)Millipore超純水制備系統(tǒng)自制；三氟乙酸（分析純，Sigma-Aldrich）；甲醇（分析純，重慶川東化工集團(tuán)有限公司）。3批川黃芩藥材采集于四川、云南等地，經(jīng)重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院中藥室張毅副研究員鑒定為唇形科植物滇黃芩Scutellaria amoena C.H. Wright的干燥根。取干燥根適量，烘干至恒重，粉碎過篩，備用。

1.3 軟件

數(shù)字化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)大數(shù)據(jù)平臺（DRS Origin軟件）V1.0（中國食品藥品檢定研究院）。

2 方法

2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：以甲醇為流動相A，以0.1 %三氟乙酸溶液為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫（0～20 min，37 %A→39 %A；20～35 min，39 %A→45 %A；35～42 min，45 %A；42～50 min，45 %A→58 %A；50～58 min，58 %A；58～68 min，58 %A→80 %A；68～68.1 min，80 %A→90 %A；68.1～70 min，90 %A）；檢測波長：280 nm；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl；柱溫：30 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 取黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素對照品適量，精密稱定，置于100 ml量瓶中，加甲醇制成黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素含量分別為106.2，117.5，25.2，49.7 μg/ml的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品，干燥粉碎，過4號篩，稱取粉末約0.3 g，精密稱定，加70 %乙醇40 ml，加熱回流3 h，放冷，濾過，濾液置100 ml量瓶中，用少量70 %乙醇分次洗滌容器和殘?jiān)?，洗液濾入同一量瓶中，加70 %乙醇至刻度，搖勻。精密量取5 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度搖勻，過濾即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2.1項(xiàng)下混合對照品溶液10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6針，對4個(gè)對照品色譜峰的保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明各對照品的保留時(shí)間和峰面積積分值的RSD均小于2.0 %，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，精密吸取10 μl，注入液相色譜儀，測定。對4個(gè)成分色譜峰的保留時(shí)間和相對含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果表明各成分的保留時(shí)間和含量的RSD均小于2.0 %，表明重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液10 μl，注入液相色譜儀，測定。對4個(gè)成分色譜峰的保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，共考察24 h，以觀察供試品溶液在檢測過程中待測成分的穩(wěn)定性。結(jié)果表明各成分的保留時(shí)間和含量的RSD均小于2.0 %，表明待測成分穩(wěn)定性良好。

2.4 色譜柱耐用性試驗(yàn)

分別在20根色譜柱上進(jìn)行耐用性考察，其中在Col 10上出現(xiàn)缺峰現(xiàn)象（缺少黃芩苷峰前的未知峰），其余19根色譜柱上各成分分離度良好，異常結(jié)果見圖1。

圖1 正常色譜圖與異常色譜圖

2.5 雙標(biāo)線性校正法定性研究

將采集的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入DRS Origin軟件，通過關(guān)聯(lián)對照品，設(shè)定雙標(biāo)化合物，進(jìn)行雙標(biāo)線性校正法分析，得到保留時(shí)間回歸偏差、保留時(shí)間預(yù)測正確率和色譜柱符合率。同時(shí)，與相對保留時(shí)間法進(jìn)行優(yōu)劣比較。

3 結(jié)果與討論

在不同的C18色譜柱上，各個(gè)物質(zhì)的保留時(shí)間具有線性關(guān)系[8-9]。通過采用對照品的保留時(shí)間進(jìn)行色譜峰定位得到樣品實(shí)際保留時(shí)間，以19根色譜柱得到的實(shí)際保留時(shí)間的算數(shù)平均值作為預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)保留時(shí)間（standard retention time, SRT）。以5種成分的SRT為橫坐標(biāo)（X），分別為黃芩苷（32.08 min）、峰2（42.88 min）、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（45.81 min）、漢黃芩苷（47.54 min）、黃芩素（55.09 min）；以實(shí)際保留時(shí)間為縱坐標(biāo)，得到在各色譜柱上SRT與實(shí)際保留時(shí)間的擬合結(jié)果，各色譜柱的線性方程和相關(guān)系數(shù)見表2。由表2可見，上述5個(gè)成分在19根色譜柱上，SRT與實(shí)際保留時(shí)間線性關(guān)系良好（r＞0.99）。

表2 不同色譜柱保留時(shí)間的線性方程及相關(guān)系數(shù)

3.1 雙標(biāo)選擇與優(yōu)化

以DRS Origin軟件為平臺，得到保留時(shí)間的雙標(biāo)線性校正結(jié)果，通過軟件內(nèi)部的數(shù)據(jù)分析篩選出了10種雙標(biāo)選擇方案，其中峰1和峰5組合預(yù)測正確率和色譜柱符合率均為100 %。按雙標(biāo)化合物選擇盡量分布在保留時(shí)間區(qū)域兩端的原則[9-10]，選擇峰1（黃芩苷）和峰5（黃芩素）為雙標(biāo)化合物，雙標(biāo)線性校正法示意圖見圖2。

圖2 雙標(biāo)線性校正法示意圖

以雙標(biāo)化合物（黃芩苷和黃芩素）的SRT為橫坐標(biāo)，實(shí)際保留時(shí)間（以Col 7為例，黃芩苷27.91 min，黃芩素52.91 min）為縱坐標(biāo)，得到線性擬合方程：Y=1.1144X-12.1613，然后將其余3個(gè)成分的SRT值代入方程，得到峰2、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷的保留時(shí)間偏差的絕對值依次為0.202，0.422，0.296 min，滿足定性條件下SRT與實(shí)測保留時(shí)間的誤差應(yīng)不超過1 min的要求，說明該雙標(biāo)化合物的選擇在Col 7上預(yù)測效果良好。

3.2 雙標(biāo)線性校正法與相對保留時(shí)間法的對比

對雙標(biāo)線性校正法與相對保留時(shí)間法在川黃芩液相色譜中定性的優(yōu)劣進(jìn)行比較。雙標(biāo)線性校正法以黃芩苷和黃芩素為雙標(biāo)化合物，相對保留時(shí)間法以千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷為參照物，兩種方法對保留時(shí)間的預(yù)測結(jié)果見表3。由表3可見，雙標(biāo)線性校正法的保留時(shí)間預(yù)測值的絕對偏差波動范圍較小，且絕對偏差較低，明顯優(yōu)于相對保留時(shí)間法。

表3 雙標(biāo)線性校正法與相對保留時(shí)間法保留時(shí)間絕對偏差比較

3.3 樣品分析

按2.2.2項(xiàng)下方法，取3批川黃芩藥材制備供試品溶液，用2根新的色譜柱（Col 21，Col22）進(jìn)行檢測，將數(shù)據(jù)格式文件導(dǎo)入DRS Origin軟件中，加載已建立的方法體系，提取雙標(biāo)保留時(shí)間，并利用軟件功能對目標(biāo)物進(jìn)行保留時(shí)間預(yù)測。同時(shí)也用相對保留時(shí)間法處理數(shù)據(jù)。對雙標(biāo)線性校正法預(yù)測結(jié)果和相對保留時(shí)間法結(jié)果進(jìn)行比較分析，結(jié)果3批樣品的雙標(biāo)線性校正法檢測結(jié)果均滿足要求（ΔtR＜1 min），說明該體系可進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用。見表4。

表4 雙標(biāo)線性校正法和相對保留時(shí)間法在新色譜柱上保留時(shí)間絕對偏差比較

4 結(jié)論

本研究采用雙標(biāo)線性校正法建立川黃芩的多組分定性鑒別方法，能快速、準(zhǔn)確地定位川黃芩中5個(gè)成分。與相對保留時(shí)間法進(jìn)行比較，雙標(biāo)線性校正法的預(yù)測精度更高，適用的色譜柱數(shù)量更多，明顯優(yōu)于相對保留時(shí)間法。本研究采用的雙標(biāo)組合，綜合考慮了色譜柱適用率和預(yù)測準(zhǔn)確度等因素，最終選擇了黃芩苷和黃芩素兩個(gè)位于色譜峰兩端的色譜峰作為雙標(biāo)參照物，同時(shí)也滿足廉價(jià)易得等優(yōu)勢。但目前，由于整個(gè)研究還處在試驗(yàn)階段，下一步的應(yīng)用和推廣還有很多亟待解決的問題。