人工老化對不同含水量西洋參種子生理生化指標的影響

隋昕，邢麗偉，于海嬌，于營，魯海坤，郭靖※

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112；2.呼倫貝爾市海拉爾區(qū)農(nóng)牧技術推廣中心，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021000；3.吉林省知識產(chǎn)權保護中心，吉林 長春 130000）

西洋參（Panax quiquefolium L.）亦稱花旗參，為五加科人參屬植物，以根入藥，性涼，味微苦，有補氣養(yǎng)陰、清熱生津的功效，具有較高的藥用價值[1]。西洋參原產(chǎn)地為美國及加拿大，我國于20世紀70年代引種成功，并發(fā)展成為西洋參主產(chǎn)國。種子是西洋參的繁殖材料和遺傳載體，在其種質(zhì)保存和播種之前都需要一定的貯藏過程。種子貯藏過程中的老化是不可逆的，貯藏期間種子活力下降，種子內(nèi)部發(fā)生復雜的生理生化變化。種子含水量是影響種子貯藏壽命的主要因素之一，因此研究貯藏過程中不同含水量西洋參種子的生理生化變化，可明確種子貯藏的適宜含水量，揭示西洋參種子的老化機制，對西洋參生產(chǎn)和種質(zhì)資源的保存具有重要意義。

大量研究證明，采用人工老化處理的種子與自然老化的種子生理生化變化并無明顯差異[2-4]。因此，可通過對種子人工老化模擬自然貯藏時種子的生理生化變化[5]。本實驗采用高溫（48℃±0.5℃）加速種子老化，研究不同含水量的西洋參種子的生理生化變化規(guī)律，為西洋參種子的種質(zhì)保存和常規(guī)貯藏提供理論和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

1.1.1 試驗材料 試驗所用西洋參種子采購于吉林省通化縣富強鎮(zhèn)富裕村，千粒重為36.73 g。

1.1.2 不同含水量種子制備 參照國家《農(nóng)作物種檢驗規(guī)程水分測定》（GB/T 3543.6-1995）測定西洋參種子含水量。測得初始含水量為5.43%，參考夏方山等[6]的方法進行處理，分別獲得含水量為3.27%、8.44%的種子，將含水量分別為3.27%、5.43%和8.44%的西洋參種子裝入鋁箔袋中密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 種子的人工老化 參考夏方山等的方法進行種子老化，略有改動[6]。將含水量分別為3.27%、5.43%和8.44%的西洋參種子每150 g為一袋密封于錫紙袋中，置于恒溫水浴鍋中（48℃±0.5℃）進行老化，分別在0d、5d、10d、15d 取出種子，待種子溫度降至室溫后于 20℃冰箱保存。

1.2.2 發(fā)芽指標的測定 將西洋參種子和沙子消毒后按1:3 比例攪拌均勻，然后置于恒溫箱中，19 ℃± 1 ℃下層積處理120 d 左右，每7 d 翻倒一次種子，沙子含水量保持在20%左右，待西洋參種子裂口后參照李紅鈺等[7]的方法進行發(fā)芽試驗，在7 d 時統(tǒng)計種子發(fā)芽勢，14 d 時統(tǒng)計種子發(fā)芽率。

1.2.3 生理生化指標的測定 可溶性糖含量采用苯酚 硫酸法進行測定[8]。相對電導率參照姚俠妹等[9]的方法進行測定。丙二醛（MDA）含量采用2-硫代巴比妥酸法進行測定[10]。超氧陰離子（O2-）產(chǎn)生速率使用Solarbio 公司提供的超氧陰離子含量檢測試劑盒進行測定。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑（NBT）光還原法進行測定[10]。過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法進行測定[10]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 軟件進行多重比較及方差分析，使用Excel 2016 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、計算及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工老化對西洋參種子發(fā)芽指標的影響

由圖1可知，不同含水量（3.27%、5.43%和8.44%，下同）的西洋參種子隨著老化時間的延長，其發(fā)芽率及發(fā)芽勢均呈現(xiàn)下降趨勢，且含水量低的種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢下降幅度小。在老化0d時，不同含水量的西洋參種子發(fā)芽率為81%左右，發(fā)芽勢為70%左右。老化5 d后，含水量3.27%和8.44%的種子差異顯著（P＜0.05），二者發(fā)芽率相差6.13%，發(fā)芽勢相差3.33%。老化10 d后，含水量3.27%和5.43%的種子發(fā)芽率雖無明顯差異（P＞0.05），但發(fā)芽勢呈顯著差異（P＜0.05），說明含水量3.27%的種子活力要優(yōu)于含水量5.43%的種子。在老化15 d 后，不同含水量種子的發(fā)芽率及發(fā)芽勢差異顯著（P＜0.05），發(fā)芽率分別下降了30.44%、34.95%和40.01%，發(fā)芽勢分別下降了28%、34%和38%。

圖1 人工老化對不同含水量西洋參種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的影響Fig.1 Effects of artificial aging on the germination rate and germination potential of American ginseng seeds with the different water content

2.2 人工老化對西洋參種子可溶性糖含量的影響

由圖2（a）可知，隨著老化時間的延長，含水量3.27%和5.43%的西洋參種子可溶性糖含量呈下降趨勢；含水量8.44%的種子可溶性糖含量呈先下降后上升的趨勢，且在老化10 d 時下降幅度最大。老化0 d、5 d時，含水量3.27%和8.44%的西洋參種子可溶性糖含量差異顯著（P＜0.05）。老化10 d后，含水量3.27%和5.43%的種子可溶性糖含量差異顯著（P＜0.05）；含水量8.44%的種子可溶性糖含量為91.33 mg/g，較老化前下降了14.99 mg/g。老化15 d后，含水量3.27%和5.43%的種子可溶性糖含量分別下降了14.68 mg/g和19.81 mg/g；含水量8.44%的種子可溶性糖含量較老化10 d 時上升了4.4 mg/g。

圖2 人工老化對不同含水量西洋參種子可溶性糖含量和相對電導率的影響Fig.2 Effects of artificial aging on soluble sugar content and relative conductivity of American ginseng seeds with different water content

2.3 人工老化對西洋參種子相對電導率的影響

由圖2（b）可知，不同含水量的西洋參種子隨著老化時間延長，其相對電導率呈上升趨勢，且種子含水量越高，上升幅度越大。在老化0 d 時，不同含水量種子的相對電導率在50%左右。老化5 d后，含水量3.27%和8.44%的種子之間差異顯著（P＜0.05），二者差距為2.47%。老化10 d 后，不同含水量種子相對電導率差異顯著（P＜0.05）。在老化15 d 后，含水量8.44%的種子相對電導率上升幅度最大，不同含水量種子相對電導率分別上升了19.07%、23.92%和27.32%。

2.4 人工老化對西洋參種子MDA含量的影響

由圖3（a）可知，隨著老化時間的延長，不同含水量的西洋參種子MDA 含量均呈上升趨勢，且MDA含量隨種子含水量的升高而增大。在老化0 d時，不同含水量的西洋參種子MDA含量無顯著差異（P＞0.05）。老化5 d 后，含水量3.27%的種子與含水量5.43%和8.44%的種子MDA 含量有顯著差異（P＜0.05），且含量相對較低，分別相差0.93、1.54mol/g。老化10 d后，不同含水量的種子之間的差異越來越顯著（P＜0.05）。老化15 d 后，含水量3.27%的種子MDA 含量最低，含水量8.44%的種子MDA 含量最高，二者相差5.53mol/g。不同含水量的種子MDA 含量分別上升了5.94mol/g、8.53mol/g 和11.32mol/g。

圖3 人工老化對不同含水量西洋參種子MDA 含量和O2-產(chǎn)生速率的影響Fig.3 Effects of artificial aging on MDA content and O2-production rate in American ginseng seeds with different water content

2.5 人工老化對西洋參種子超氧陰離子產(chǎn)生速率的影響

由圖3（b）可知，在老化0 d 時，不同含水量西洋參種子之間O2-產(chǎn)生速率無顯著差異（P＞0.05）。在老化5 d 后，含水量3.27%和5.43%的種子差異不顯著（P＞0.05），但含水量8.44%的種子與二者差異顯著（P＜0.05），其O2-產(chǎn)生速率上升幅度較大。在老化10 d 后，不同含水量的種子O2-產(chǎn)生速率差異顯著（P＜0.05）。在老化15 d 后，含水量8.44%的種子O2-產(chǎn)生速率最高，含水量3.27%的種子O2-產(chǎn)生速率最低，二者相差12.43 nmol/（min g）。隨著老化時間的延長，不同含水量的西洋參種子O2-產(chǎn)生速率均呈上升趨勢，且O2-產(chǎn)生速率積累速率逐漸加快。種子含水量越高，O2-產(chǎn)生速率上升幅度越大，不同含水量種子分別上升了17.98 nmol/（min g）、23.97 nmol/（min g）和30.32 nmol/（min g）。

2.6 人工老化對西洋參種子抗氧化酶的影響

由圖4（a）可知，不同含水量的西洋參種子SOD活性在老化過程中都呈現(xiàn)出下降趨勢。至老化完成時，不同含水量的種子SOD 活性分別下降了52.68 U/g、60.46 U/g 和72.01 U/g。在老化0 d 時不同含水量的種子SOD活性差異不顯著（P＞0.05）。在老化5d 后，含水量3.27%和8.44%的種子之間有顯著差異（P＜0.05），二者相差10.96 U/g。在老化10 d 后，含水量3.27%和5.43%的種子之間無顯著差異（P＞0.05），二者與含水量8.44%的種子差異顯著（P＜0.05）。在老化15d 后，不同含水量的種子SOD 活性差異顯著（P＜0.05），含水量高的種子SOD 活性相對較低，含水量8.44%的種子SOD 活性最低，為159.16 U/g。

圖4 人工老化對不同含水量西洋參種子抗氧化酶活性的影響Fig.4 Effects of artificial aging on the activities of antioxidant enzymes of American ginseng seeds with different water content

由圖4（b）可知，隨著老化時間的延長，不同含水量的西洋參種子CAT 活性呈下降趨勢，且下降速度逐漸加快。在老化0 d時，不同含水量的種子無顯著差異（P＞0.05）。在老化5 d 后，含水量8.44%的種子較其他含水量種子CAT 活性下降更顯著（P＜0.05）。在老化10 d 后，含水量5.43%和8.44%的種子之間無顯著差異（P＞0.05），但二者CAT 活性低于含水量3.27%的種子。在老化15 d后，不同含水量的種子之間CAT 活性差異顯著（P＜0.05），且含水量8.44%的種子CAT 活性最低。不同含水量種子的CAT 活性分別下降了203.87 U/g、262.48 U/g 和287.96 U/g，可見含水量高的種子隨老化時間的延長下降幅度相對較小，含水量3.27%的種子CAT 活性下降最小。

3 討論與結(jié)論

研究表明，含水量對種子貯藏期間的壽命有直接影響，種子含水量在5%～14%時，每升高1%，種子的壽命就縮短一倍[11]。種子的老化是一個復雜且逐漸變化的過程，伴隨著許多生理生化反應，種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢可以直觀地表現(xiàn)出種子的活力水平及萌發(fā)能力。本實驗西洋參種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢的測定結(jié)果表明，在種子老化過程中，發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)隨含水量的增加而降低。在老化15 d 后，含水量3.27%的西洋參種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢最高，分別為50.77%和41.78%；含水量8.44%的種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢最低，分別為41.33%和32%。魯海坤等[12]在研究不同含水量蒙古黃芪種子人工老化的變化時發(fā)現(xiàn)相同規(guī)律。

可溶性糖作為種子重要的貯藏物質(zhì)之一，是種子呼吸作用的主要底物，為種子的生命活動提供能量。在本實驗中含水量3.27%和5.43%的西洋參種子可溶性糖含量呈下降趨勢，與菠菜、毛竹及芥藍等種子人工老化后可溶性糖含量變化趨勢一致，這是種子在高溫條件下呼吸作用增強、糖消耗加快導致[13-15]。含水量8.44%的種子可溶性糖含量呈先下降后上升的趨勢，與小麥、大豆等種子人工老化后可溶性糖含量變化相似，這是高溫下種子細胞膜遭到破壞，導致可溶性糖滲出[16-18]。

膜脂過氧化是種子老化的主要變化之一，種子在氧化酶或自身氧化下產(chǎn)生的自由基會攻擊細胞內(nèi)的脂類物質(zhì)，破壞細胞膜的完整性，促使種子老化加劇[19]。MDA 是膜脂過氧化反應的產(chǎn)物之一，具有很強的毒性，會破壞細胞膜結(jié)構(gòu)。膜脂過氧化的程度與MDA含量呈正相關。不同含水量的西洋參種子在老化后MDA含量均呈上升趨勢，且含水量低的種子上升幅度較小，說明低含水量的種子在老化后膜脂過氧化程度低于高含水量種子，其中含水量3.27%的種子MDA 含量累積最少，所受毒害最輕。在膜脂過氧化后，細胞膜結(jié)構(gòu)破壞，細胞膜通透性逐漸增大，細胞內(nèi)物質(zhì)逐漸滲出，相對電導率也隨之增大。西洋參種子在老化后相對電導率均呈上升趨勢，其中含水量3.27%的種子上升幅度最小，含水量8.44%的種子上升幅度最大，說明細胞膜損傷程度隨著種子含水量的增加而逐漸嚴重，這與吳聚蘭等[20]對大豆種子老化的研究結(jié)果相似。

活性氧（ROS）是氧的代謝產(chǎn)物，具有很高的化學反應活性，會誘導脂膜發(fā)生過氧化反應，是破壞膜完整性的主要因素之一[21]。O2-是種子內(nèi)主要的ROS 之一，由氧原子攜帶2 個電子形成，具有很強的還原性和氧化性，性質(zhì)活潑，其累積過多會對種子造成不可逆的損傷。唐嘉等[22]在老芒麥種子老化的研究中發(fā)現(xiàn)種胚中O2-產(chǎn)生速率逐漸提高，O2-的積累是種子氧化損傷的主要原因之一。在本研究中西洋參種子O2-產(chǎn)生速率隨著老化時間的延長而逐漸提高，其中含水量高的種子O2-產(chǎn)生速率上升幅度更大，因含水量高的種子積累較多的O2-，導致膜結(jié)構(gòu)損傷更嚴重，這也是其相對電導率較高的原因之一。

正常的生理狀態(tài)下，種子通過抗氧化劑和抗氧化酶系統(tǒng)兩種方式清除ROS，防止其破壞種子結(jié)構(gòu)，ROS的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡的狀態(tài)。O2-在SOD 的作用下發(fā)生歧化反應產(chǎn)生H2O2和O2，這是種子清除ROS 的第一道防線。CAT 可專一清除H2O2，是種子保持抗氧化和氧化平衡的關鍵酶，具有加強的催化能力。有研究表明O2-和H2O2會與CAT 反應生成復合物，降低CAT 的氧化能力[23]。孫春青等在研究結(jié)球甘藍種子的老化過程中SOD 和CAT 等抗氧化酶活性下降，糯玉米、煙草等植物的種子在老化后SOD、CAT等抗氧化酶的變化也呈相同趨勢[24-26]。在西洋參種子的老化過程中，SOD 和CAT 活力下降，且含水量越高的種子SOD 和CAT 活性下降越快。種子SOD 活性下降，無法及時清除O2-，O2-產(chǎn)生速率加快，積累量逐漸增多。而O2-的積累會進一步降低CAT 的氧化能力，最終導致種子的結(jié)構(gòu)因氧化而遭到嚴重破壞。

隨著老化時間的延長，與高含水量的西洋參種子相比，低含水量的種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢下降幅度小，SOD、CAT 等抗氧化酶活性下降少，MDA 和O2-等有毒物質(zhì)積累較少，細胞膜受損程度較輕。含水量低的西洋參種子抗氧化能力相對較強，更能抵御不良環(huán)境的刺激，更適宜貯藏，即含水量3.27%的西洋參種子更適宜貯藏。