基于網(wǎng)絡藥理學探究溫陽通淋湯對于腎盂腎炎的炎癥抵抗機制

王碧巖，步洪石，劉戰(zhàn)，姜祥雨，周凱旋，童延清

（1.長春中醫(yī)藥大學，吉林 長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，吉林 長春 130021）

腎盂腎炎（pyelonephritis）是最常見的腎臟病之一，常由細菌感染所引起，根據(jù)病程可分為急性腎盂腎炎和慢性腎盂腎炎。其主要表現(xiàn)為腎盂和腎盞存在慢性炎癥，腎盂擴大并畸形，且腎皮質及乳頭部有瘢痕形成，腎髓質變形，腎盂、腎盞黏膜及輸尿管管壁增厚，嚴重者腎實質廣泛萎縮，且腎盂腎炎慢性期患者容易出現(xiàn)腎功能不全[1]。腎盂腎炎是尿路感染常見的一種臨床類型。目前，經(jīng)研究表明女性發(fā)生尿路感染的機率大于男性，比例為8:1[2]，此外，已婚女性發(fā)病率高于未婚，與性生活、月經(jīng)和妊娠等有關[3]。中醫(yī)認為，腎盂腎炎屬于“淋證”、“水腫”、“腰痛”、“虛勞”和“尿血”等范疇，主要因肺、脾、腎三臟虛損所引起，以風、寒、濕熱、瘡毒和瘀血等為標實，是造成患者癥狀加重和惡化的主要因素[4,5]。大量的臨床研究證實，中醫(yī)中藥抵抗腎盂腎炎的炎癥反應具有一定優(yōu)勢，既能改善癥狀體征、提高臨床治愈率，又能在提升患者的抵抗力、降低疾病的發(fā)生率方面發(fā)揮關鍵作用。溫陽通淋湯是童延清教授治療尿路感染的經(jīng)驗方，由通草、滑石、赤芍、茴香、官桂、荔枝核、天葵子、瞿麥和馬齒莧組成，經(jīng)臨床應用以及動物實驗研究表明，溫陽通淋湯對于上行性尿路感染可以起到預防作用，對于相關炎癥因子的控制具有良好效果[6,7]。

目前，中藥網(wǎng)絡藥理學通過對中藥成分、疾病和藥物多成分協(xié)同作用的大規(guī)模篩選，廣泛應用于中藥多成分協(xié)作、中藥方劑的配伍規(guī)律和網(wǎng)絡調節(jié)機理分析等[8,9]。研究基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術，構建溫陽通淋湯抵抗腎盂腎炎炎癥反應的作用機制網(wǎng)絡，研究其化學成分、可能的作用靶點以及相關信號通路，為其臨床應用和實驗研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件

中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺TCMSP（http://tcmspw.com/）；PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）；GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）；OMIM 數(shù)據(jù)庫：（https://omim.org/）；DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/）；STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）；DAVID數(shù)據(jù)庫：（https://david.ncifcrf.gov/）；微生信在線繪圖云平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/）；Cytoscape 3.5.0軟件；Uniprot數(shù)據(jù)庫：（https://www.uniprot.org/）；SYBYL-X 2.0軟件，以上數(shù)據(jù)庫使用時間截止至2021年12月。

1.2 藥物化學成分及潛在靶點搜集

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中分別以滑石、赤芍、茴香、官桂、荔枝核、天葵子、瞿麥和馬齒莧為關鍵詞進行檢索，口服生物利用度（Oral Bioavailability,OB）和類藥性（DrugLikeness,DL）是評價一個化合物是否可以發(fā)展成為一個藥物的重要指標[10,11]，依照OB%≥30，DL≥0.18的條件，檢索篩選溫陽通淋湯中符合上述的化學成分。Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫可基于已知配體2D 和3D結構準確預測活性分子的靶點[12]。本研究通過Pub-Chem 數(shù)據(jù)庫下載化學成分結構的SDF 格式文件，然后結合Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫檢索化學成分所對應的相關靶點。

1.3 腎盂腎炎潛在靶點搜集

通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫、OMIM 數(shù)據(jù)庫以及DisGeNET數(shù)據(jù)庫，以“pyelonephritis”為關鍵詞檢索收集腎盂腎炎相關靶點。

1.4 “中藥-化學成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡構建

分別錄入溫陽通淋湯與腎盂腎炎的靶點到Venny 2.1 在線軟件作圖工具平臺，將二者比較后取交集，并繪制韋恩圖，得到藥物與疾病的共有靶點。將中藥，成分，共有靶點，疾病的相關數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.5.0 軟件，構建中藥 化學成分 靶點 疾病網(wǎng)絡。

1.5 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡構建及核心靶點篩選

將“1.4”項中篩選得到的溫陽通淋湯抵抗腎盂腎炎炎癥反應交集靶點信息導入STRING 數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo sapiens”，以最小置信度（minimum required interaction score）＞0.4 為篩選條件，下載交集靶點的PPI 網(wǎng)絡的TSV 文件。將下載文件導入Cytoscape3.5.0 軟件構建PPI 網(wǎng)絡，進而篩選核心靶點。

1.6 GO和KEGG通路富集分析

為深入了解上述篩選出的溫陽通淋湯抵抗腎盂腎炎炎癥反應的潛在作用靶點基因的功能以及在信號通路中的作用，運用DAVID 數(shù)據(jù)庫進行GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析，以P＜0.04 為篩選條件，限定物種為“Homo sapiens”。按照其富集的靶點數(shù)目進行排序，選取KEGG 通路前20 個條目進行可視化。并使用微生信在線繪圖云平臺繪制高級氣泡圖，將結果可視化。

1.7 溫陽通淋湯的“中藥-靶點-通路”網(wǎng)絡構建

通過結合文獻分析KEGG 通路富集數(shù)據(jù)，選取通過調控炎癥因子表達或炎癥反應可能治療腎盂腎炎的相關通路。將相關數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.5.0 軟件構建中藥-靶點-通路網(wǎng)絡。通過分析中藥-靶點-通路網(wǎng)絡，進一步闡述溫陽通淋湯抵抗腎盂腎炎炎癥反應的潛在作用機制。

1.8 核心化合物-核心靶點分子對接

從Uniprot數(shù)據(jù)庫下載“1.5”項中篩選得到的核心靶點的3D 晶體結構，并從TCMSP 數(shù)據(jù)庫下載“1.7”項中得出的degree 值排名前10 的核心化合物的3D晶體結構，首先使用SYBYL-X 2.0 軟件進行“去水”預處理，然后將核心化合物與核心靶點進行分子對接，以Total Score大小作為化合物與靶點結合能力強弱的判別依據(jù)，最后對分子對接結果進行繪圖。

2 結果

2.1 溫陽通淋湯藥物化學成分及潛在靶點信息

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫得到溫陽通淋湯中化合物共58 個，其中25 個來自赤芍、1個來自茴香、3 個來自荔枝核、8 個來自馬齒莧、2 個來自瞿麥、4 個來自肉桂、7 個來自天葵子、3 個來自通草，且MOL000449 來自于赤芍、茴香和荔枝核，MOL000358 來自于赤芍、茴香、荔枝核和馬齒莧，MOL002883來自于赤芍和荔枝核，MOL000359 來自于赤芍、通草、荔枝核，MOL000098來自于荔枝核、馬齒莧。根據(jù)OB≥30%同時DL≥0.18的標準進行篩選，其中肉桂不滿足相關篩選條件，所以以OB≥30%、DL≥0.12 的標準進行篩選。

2.2 疾病潛在靶點

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫、OMIM 數(shù)據(jù)庫以及DisGe-NET數(shù)據(jù)庫分別獲取到疾病相關靶點544 個、112 個、71 個，去重篩選后最終獲得了669 個腎盂腎炎疾病相關靶點。

2.3 “藥物-化合物-疾病-靶點”網(wǎng)絡分析

利用微生信在線作圖云平臺，將“2.1”項中篩選得到的溫陽通淋湯組方中所有潛在靶點與“2.2”項中有關的疾病669 個靶點輸入，制作Venn 圖，如圖1所示，最終得到92 個交集靶點，表明溫陽通淋湯可能通過該92 個潛在靶點對腎盂腎炎發(fā)揮炎癥抵抗作用。92 個交集靶點相關的化學成分中，赤芍（Red peony）包含29 個、茴香（Anise）3 個、荔枝核（Litchi Semen）8個、馬齒莧（MA-CHMINACA）10 個、瞿麥（Dianthi Herba）2 個、肉桂（Cinnanmomi Cortex）4 個、天葵子（Semiaquilegiae Radix）7 個、通草（Tetrapanax papyriferus）4個?；瘜W成分信息見表1。采用Cytoscape 3.5.0 軟件構建溫陽通淋湯組方的“中藥 化學成分 靶點 疾病”網(wǎng)絡圖見圖2。該網(wǎng)絡圖共有160 個節(jié)點和728 條邊，160 個節(jié)點中包含8 個中藥名稱，58 個化學成分，92個交集靶點，以疾病名稱為中心，第1 圈層為中藥名稱，第2、3 圈層為藥物成分，第4、5 圈層為疾病靶點。該網(wǎng)絡圖體現(xiàn)了中藥多成分多靶點的特點，從化合物角度分析，按照度值（Degree）對網(wǎng)絡進行拓撲學分析，其中有9 個化學成分擁有超過15 個作用靶點，包括MOL001918、MOL011356、MOL007016、MOL007005、MOL011363、MOL007004、MOL001921、MOL008006和MOL000057，分別能與18、18、18、18、18、15、15、15和15 個活性化合物相互作用。

圖1 疾病腎盂腎炎 復方溫陽通淋湯的Venn 圖Fig.1 Venn diagram of disease pyelonephritis compound Wenyang Tonglin Decoction

圖2 “中藥 化學成分 靶點 疾病”網(wǎng)絡圖Fig.2 Network diagram of“Traditional Chinese Medicine chemical composition target disease“

表1 復方溫陽通淋湯活性成分Table 1 Active ingredients of compound Wenyang Tonglin Decoction

續(xù)表

2.4 PPI網(wǎng)絡分析及核心靶點篩選

通過Cytoscape3.5.0 軟件構建PPI 網(wǎng)絡，見圖3。該網(wǎng)絡包含90 個節(jié)點和784 條邊。靶點蛋白的平均節(jié)點度值（degree值）為29，其中大于平均度值靶點共有16 個，此16 個靶點可能是溫陽通淋湯抵抗腎盂腎炎炎癥反應的關鍵靶點。根據(jù)度值降序排序，并按照degree 值的中位數(shù)的2 倍值進行篩選，然后分別按照CLOSENESS、BETWENESS值降序排序，并按照中位數(shù)值分別進行篩選，獲得6 個核心靶點基因主要包括TNF（degree值為57）、ALB（degree值為56）、GAPDH（degree 值為54）、IL6（degree 值為52）、表皮生長因子（EGFR,Epidermal growth factor receptor，degree 值為49）和VEGFA（degree 值為49）。分別能與5、9、2、3、17、13 個活性化合物相互作用。

圖3 疾病腎盂腎炎 復方溫陽通淋湯的PPI 網(wǎng)絡圖Fig.3 PPI network diagram of disease pyelonephritis compound Wenyang Tonglin Decoction

2.5 GO和KEGG通路富集分析及“中藥-靶點-通路”網(wǎng)絡的構建

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫對交集靶點進行GO 生物過程（GO biological processes,GO-BP）、GO 細胞組成（GO Cellular Components,GO-CC）和GO 分子功能（GO Molecular Functions,GO-MF）富集分析，以P＜0.04 篩選標準，GO-BP 條目243 條，主要涉及調控細胞增殖、炎癥反應以及免疫應答等；GO-CC 條目38條，主要涉及質膜，質膜外側和受體復合物等；GO-MF條目58 條，主要涉及細胞因子活性、蛋白酶活性和蛋白質結合等。以上數(shù)據(jù)按-lg P 值轉換的P-value 值排序，分別選取富集程度前10 條，繪制高級氣泡圖（圖4）。另外，KEGG 富集分析得到94 條（P＜0.04）信號通路，選取其富集程度前20 條繪制柱狀圖（圖5）。KEGG前20 條通路主要涉及糖尿病并發(fā)癥中的TNF信號（hsa04668:TNF signaling pathway）、PI3K-AKT 信號（hsa04151：PI3K-Akt signaling pathway）、HIF-1 信號（hsa04066：HIF-1 signaling pathway）等。中藥-靶點-通路網(wǎng)絡如圖6所示。通過對溫陽通淋湯配伍的“中藥-靶點-通路”進行網(wǎng)絡分析，篩選degree 值排名前10 的為核心化合物，其中8 個來自于赤芍，分別是MOL007018（9-ethyl-neo-paeoniaflorin A）、MOL002714（黃芩素，baicalein）、MOL001921（芍藥新苷，Lactiflorin）、MOL001002（鞣花酸，ellagic acid）、MOL007014（8-debenzoylpaeonidanin）、MOL007005（芍藥內酯苷，Albiflorin）、MOL007003（benzoyl paeoniflorin）、MOL001925（芍藥苷，paeoniflorin）；2 個來自于天葵子分別是：MOL011363[4-（beta-D-glucosyloxy）benzoic acid]、MOL002894（小檗紅堿，berberrubine）。以此可以預測溫陽通淋湯在抵抗腎盂腎炎炎癥反應的機制中，赤芍、天葵子可能起到主要的治療作用。

圖4 GO 功能富集分析分析柱狀圖Fig.4 Histogram of GO function enrichment analysis

圖5 KEGG 信號通路分析氣泡圖Fig.5 Bubble diagram of KEGG signal path analysis

圖6 中藥-靶點-通路網(wǎng)絡Fig.6 Traditional Chinese medicine target pathway network

2.6 核心化合物-核心靶點分子對接結果

分子對接親和力結果如表2所示。采用SYBYLX 2.0 軟件對6 個關鍵靶點與10 個活性成分進行分子對接驗證。靶點-化合物結合得分（Total Score）從大到小排列為：EGFR 與MOL007003（8.088 2）、ALB 與MOL007003（7.396 7）、ALB與MOL001921（7.257 3）、GAPDH與MOL001925（6.2276）、GAPDH與MOL007014（6.209 8）、GAPDH 與MOL007003（6.116 4）、ALB 與MOL007018（6.036 7）、ALB與MOL001925（5.997 2）、EGFR 與MOL001921（5.997 2）、ALB 與MOL002894（5.824 1），一般認為，配體與受體Total Score 越高，結合的構象越穩(wěn)定，因此認為核心化合物與核心靶點具有較強的結合力，利用SYBYL 軟件對上述靶點與化合物對接進行可視化處理，見圖7。

圖7 核心化合物-核心靶點分子對接圖Fig.7 Core compounds core targets molecular docking diagram

表2 分子對接結果Table 2 Molecular docking results

續(xù)表

3 討論

腎盂腎炎是菌尿由膀胱起始，從輸尿管上升到腎臟引起的腎實質炎癥，炎性細胞因子等在感染過程中發(fā)揮著關鍵的警示與促進疾病發(fā)展的作用，因此在針對腎盂腎炎進行治療時，除考慮必要的抗菌效果外，緩解炎癥損傷同樣是值得注意的關鍵節(jié)點。研究通過網(wǎng)絡藥理學與分子對接的方法，針對腎盂腎炎經(jīng)典診療方劑的抗炎效果進行機制分析，對于完善腎盂腎炎的診療方案與病理機制的研究具有明確的參考價值。

研究表明，腎盂腎炎等腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展涉及復雜的機制，其中炎癥和氧化應激被認為是兩個主要因素。人們普遍認為，在某些腎臟疾病的初始階段存在與腎功能不全相關的輕度炎癥[13,14]。隨著腎炎的進展，炎癥的擴大和持續(xù)，腫瘤壞死因子-（TNF- ）和白細胞介素-6（IL-6）將持續(xù)升高[15]。IL-6 持續(xù)合成異常與慢性炎癥的發(fā)生有著密切聯(lián)系，IL-6 是多效性炎性細胞因子，由單核細胞以及巨噬細胞產(chǎn)生，是炎性介質網(wǎng)絡的關鍵成分，參與炎癥反應過程，它不僅對血管內皮細胞及炎癥細胞具有直接的激活和毒性作用，還會誘導急性期蛋白的合成、催化和放大炎癥反應及毒性作用，造成組織細胞損害。有研究表明[16]，收集患有急性腎盂腎炎或無癥狀菌尿的女性患者在治療前后采集的尿液和血清樣本時發(fā)現(xiàn)，無論感染的嚴重程度如何，大多數(shù)細菌感染的尿液樣本中IL-6 活性均升高。研究表明，在由LPS 和TNF 激活的多種信號傳遞機制中，多種NF- B激活通路在引發(fā)炎癥過程的基因誘導（催生變異）中起到了尤為重要的作用，而NF- B（炎癥反應中重要的轉錄因子）的不正確調節(jié)與癌癥、炎癥等有關。血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor,VEGFA）在血管生成和內皮細胞生長中具有活性，誘導內皮細胞增殖，促進細胞遷移，抑制細胞凋亡并誘導增加血管通透性。研究表明血管內皮生長因子可以通過自身的磷酸化激活，而IL-6 可以誘導VEGF的過度生成導致血管生成增強和血管通透性增加，這是炎癥病變的病理特征[17]。ALB又名陰性急性反應蛋白，與炎癥反應的程度成反比。

通過對核心化學成分的分析中發(fā)現(xiàn)，芍藥苷（Pae）是芍藥的主要活性成分，其具有廣泛的抗炎和免疫調節(jié)作用[18]。Pae在實驗性關節(jié)炎、銀屑病和自身免疫性腦脊髓炎等自身免疫性疾病動物模型的體內發(fā)揮著抑制炎癥的作用，具體的機制可能是Pae 可以調節(jié)免疫細胞的功能、激活相關免疫細胞和減少炎癥介質的產(chǎn)生。Pae 通過抑制異?；罨募毎麃喨簛砥胶饷庖呒毎麃喨?。Pae 可通過調控多種信號通路（GPCR 通路、MAPKs/NF- B 通路、PI3K/Akt/mTOR 通路、JAK2/STAT3 通路和TGF /Smads等）發(fā)揮抗炎作用。LPS誘導RAW264.7 巨噬細胞產(chǎn)生TNF- 和IL-6 等細胞因子，芍藥內酯苷和Pae 有阻礙TNF- 和IL-6 基因表達的藥理作用，二者可能抑制LPS 誘導的iNOS 和COX-2 基因表達以及隨后NO 和PGE2 的產(chǎn)生和COX-2 蛋白的表達[19]。鞣花酸[20]是存在于各種水果和蔬菜中的一種天然的抗酚類抗氧化劑，可以通過抑制PI3K/Akt 的激活，減少炎癥介質包括TNF-、IL-6和干擾素- ，從而實現(xiàn)炎癥抵抗，改善疾病的嚴重程度。黃芩素[21]是一種具有生物活性的黃酮類化合物，被廣泛用于抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化和抗腫瘤等治療方向[22,23]，具有顯著的臨床效果。

信號轉導和轉錄激活因子（STAT）被janus 激酶（JAK）磷酸化、二聚化，然后通過核膜轉運到細胞核中，調節(jié)相關基因的表達，這種途徑被稱為janus激酶信號轉導和轉錄激活（JAK/STAT）信號途徑，也稱為IL-6 信號轉導通路，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種細胞因子刺激的信號轉導通路。該信號通路可調節(jié)多種生物過程，包括細胞存活、細胞增殖和細胞周期等。此外，它在細胞凋亡和炎癥中起著關鍵作用[24]，各種細胞因子和生長因子通過JAK/STAT 信號通路傳遞信號，包括白細胞介素2～7（IL-2～7）、表皮生長因子（EGF）等[25]。JAK2/STAT3 信號通路已被證明在LPS 刺激的RAW264.7細胞中開啟并釋放炎癥細胞因子，如IL-1、TNF- 和IL-6 等[26]。有學者運用脂聯(lián)素滅活JAK2/STAT3 信號通路可以緩解腎盂腎炎模型小鼠的腎細胞凋亡情況以及炎癥反應[27]。

此外，炎癥和氧化應激是相互誘導、相互促進的，一般會逐漸形成炎性反應與氧化應激反應的惡性循環(huán)[28]。例如，NF- B 的活性直接被活性氧（ROS）增強[29,30]。反之，NF- B 通過調控gp91phox12 誘導ROS 的產(chǎn)生。一些證據(jù)表明，在腎盂腎炎的早期階段，甚至在炎癥開始之前，ROS 水平上調，抗氧化系統(tǒng)的能力被嚴重破壞[31,32]。PI3K 和下游效應因子Akt 屬于一個保守的信號轉導酶家族，參與調節(jié)細胞活化、炎癥反應和凋亡。而PI3K/Akt 信號通路參與了促炎基因刺激NF- B活性的調控[33]。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡藥理學對溫陽通淋湯配伍的多成分、多靶點、多通路與腎盂腎炎的復雜網(wǎng)絡關系進行研究，初步闡述了溫陽通淋湯配伍抵抗腎盂腎炎炎癥反應的主要潛在藥效成分、作用靶點以及相關通路，可通過PI3K/Akt 等信號通路，調控炎癥反應和炎癥因子等發(fā)揮抵抗腎盂腎炎炎癥反應的作用。本研究可為溫陽通淋湯臨床應用和實驗研究提供理論依據(jù)，也為后續(xù)研究中藥復方對于腎盂腎炎的療效提供思路和參考。