基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析苦豆子生物堿抗肺癌的作用機(jī)制

李靜靜，王福玲，李嘉欣，吳思雨，王群，賈紹華

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)英才學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076）

肺癌指發(fā)生于肺部的惡性腫瘤，常發(fā)生于支氣管表皮的上皮細(xì)胞，是全世界高死亡率的癌癥之一。盡管順鉑介導(dǎo)的化療依然是治療肺癌的必要手段，但目前由于其在臨床上經(jīng)常出現(xiàn)耐藥性和不良反應(yīng)強(qiáng)烈等問題，急需一種可以減緩或克服上述不良反應(yīng)的方法[1]。中藥苦豆子（Sophora alopecuroides L.）為豆科槐屬多年生草本植物的干燥全草及種子，性寒，味苦，具有清熱解毒、抗菌消炎及止痛鎮(zhèn)靜等功效?，F(xiàn)代研究表明，苦豆子具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、抗炎、抑菌和保護(hù)心血管系統(tǒng)等藥理作用，其中，苦豆子中的生物堿成分是其發(fā)揮抗腫瘤作用的主要有效成分[2]。本文從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度初步預(yù)測(cè)苦豆子生物堿抗肺癌的可能機(jī)制，為苦豆子的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 化學(xué)成分篩選

對(duì)苦豆子生物堿成分進(jìn)行檢索搜集，得到21 種有效生物堿成分[3,4]，運(yùn)用ChemDraw18.0 對(duì)這21 種生物堿成分進(jìn)行繪制并保存為MDL SDfile（*.Sdf）格式備用。

1.2 苦豆子生物堿成分潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)與篩選

將繪制好的21 種苦豆子生物堿成分分別上傳到SwissADME對(duì)其類藥性和藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，均符合標(biāo)準(zhǔn)。在SwissTarget Prediction 數(shù)據(jù)庫中，分別對(duì)這21 種成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，并以Probability*值進(jìn)行篩選（取0.3＜Probability＜1）。

1.3 肺癌基因靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

在GeneCards 和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫中設(shè)定物種為‘Homo sapiens’，進(jìn)行肺癌疾病靶點(diǎn)的搜集，并將所得到的靶點(diǎn)合并、去重，將苦豆子生物堿的基因靶點(diǎn)和肺癌基因靶點(diǎn)導(dǎo)入韋恩圖中取交集，得到共同基因，即為苦豆堿潛在的抗肺癌的核心靶點(diǎn)。

1.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和通路富集分析

將1.3 中獲得的交集基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，并在Metascape 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行KEGG 和GO 分析。

1.5 構(gòu)建苦豆子生物堿 靶點(diǎn) 通路網(wǎng)絡(luò)

將搜集到的21 種苦豆子中主要生物堿成分及其靶點(diǎn)信息和通路導(dǎo)入Cytoscape 中，構(gòu)建苦豆子生物堿 靶點(diǎn) 通路網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 潛在靶點(diǎn)與成分分析

21 種苦豆子生物堿成分，見表1，共170 個(gè)靶點(diǎn)基因，取度值（Degree值）大于10 的基因進(jìn)行分析，共得到靶點(diǎn)蛋白22 個(gè)。

表1 苦豆子中有效生物堿成分的化學(xué)式Table 1 Information on the chemical components of active alkaloids inalopecuroides

續(xù)表

2.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)篩選

檢索GeneCards 和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫中的肺癌基因并去重，共得到肺癌相關(guān)基因靶點(diǎn)453 個(gè)。將上述得到的170 個(gè)苦豆堿的基因靶點(diǎn)和453 個(gè)肺癌基因靶點(diǎn)導(dǎo)入韋恩圖中取交集，最后得到核心靶點(diǎn)18個(gè)，見圖1。

圖1 苦豆子生物堿成分靶點(diǎn)與肺癌相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖Fig.1 Venn plot of alkaloids inalopecuroides targets and lung cancer-related targets in seeds

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

在苦豆子生物堿抗肺癌蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）中選取置信度大于0.4 部分，結(jié)果見圖2。由圖2可知，在苦豆子靶蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)中CYP（細(xì)胞色素P450）家族所占比例最大，其次是CHRNA（神經(jīng)酰胺受體）家族與表皮生長因子家族（EGFR和雄性激素受體AR），提示有關(guān)這幾種家族的靶點(diǎn)在治療肺癌的過程中發(fā)揮的藥理作用明顯。

圖2 苦豆子靶蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network of the alkaloids inalopecuroides.

2.4 代謝通路分析

用Metascape數(shù)據(jù)庫對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行通路代謝分析，取lgP＞-0.8 的15條通路進(jìn)行分析，并繪制氣泡圖（見圖3）。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析表明癌癥通路、藥物代謝和細(xì)胞色素P450 對(duì)異源物的代謝及膽堿能突觸等代謝通路與苦豆子對(duì)肺癌的治療作用有關(guān)，參與癌癥信號(hào)通路的關(guān)鍵靶點(diǎn)有6 個(gè)，分別是AR、EGFR、ESR2、IGF1R、JAK2和ROCK1，提示這幾種靶點(diǎn)在治療肺癌的過程中發(fā)揮的藥理作用明顯。

圖3 活性靶點(diǎn)KEGG 代謝通路氣泡圖Fig.3 Bubbles of active target KEGG metabolic pathway

2.5 GO富集分析

基因本體（Gene Ontology,GO）由分子功能、生物過程和細(xì)胞組分3 個(gè)部分組成[5]。選取部分苦豆子生物堿活性靶蛋白的富集結(jié)果（均選取P＜0.01、基因數(shù)量＞3 和富集因子百分比＞1.5）進(jìn)行GO 富集分析并繪制條形圖（見圖4）。結(jié)果表明，苦豆子生物堿抗肺癌主要與細(xì)胞對(duì)激素刺激的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及花生四烯酸代謝等生物過程有關(guān)。

圖4 苦豆子生物堿治療肺癌活性靶點(diǎn)GO 富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of active targets ofalopecuroides in the treatment of lung cancer

2.6 構(gòu)建苦豆子生物堿 靶點(diǎn) 通路網(wǎng)絡(luò)

將搜集到的21 種苦豆子生物堿成分所對(duì)應(yīng)的170個(gè)核心靶點(diǎn)和15 條通路導(dǎo)入Cytoscape 中，構(gòu)建苦豆子生物堿 靶點(diǎn) 通路網(wǎng)絡(luò)，見圖5。該網(wǎng)絡(luò)共有節(jié)點(diǎn)206 個(gè)，邊873 條，其中，槐定堿（sophoridine）及其衍生物（KD01、KD02）、槐胺堿（sophoramine）及其衍生物（KD07）以及金雀花堿（cytisine）等可作用于CHRNA（神經(jīng)元乙酰膽堿受體亞基）、HTR3A（5-HT3a受體）、HDAC（組蛋白脫乙酰酶）和CYP（細(xì)胞色素P450）等22 個(gè)苦豆子抗肺癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)，提示這些化學(xué)成分可能通過作用于這些靶點(diǎn)參與苦豆子治療肺癌的過程。

圖5 苦豆子生物堿 靶點(diǎn)基因 代謝通路網(wǎng)絡(luò)Fig.5 The alkaloids inalopecuroides-target-metabolic pathways network

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探索了苦豆子生物堿抗肺癌中多成分、多靶點(diǎn)及多渠道的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。從苦豆子中篩選出21 種生物堿成分，在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的基礎(chǔ)上推測(cè)槐定堿、金雀花堿、苦參堿和苦豆堿等生物堿是苦豆子抗肺癌的主要活性成分，確定CHRNA、HTR3A、HDAC 和CYP 等22 個(gè)苦豆子抗肺癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)；結(jié)合苦豆子靶蛋白PPI、KEGG 和GO 分析，確認(rèn)CYP、EGFR 等相關(guān)蛋白靶點(diǎn)在肺癌的治療過程中發(fā)揮主要作用。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)槐定堿能夠以濃度依賴的方式減少M(fèi)DM2 介導(dǎo)的P53 蛋白泛素化以及穩(wěn)定P53 蛋白，從而激活P53 信號(hào)通路；也可激活肺癌細(xì)胞中的Hippo途徑從而產(chǎn)生抗腫瘤作用；當(dāng)槐定堿與順鉑合用時(shí)，槐定堿可以增加肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，減少肺癌病人在治療過程中耐藥性的產(chǎn)生改善順鉑在體內(nèi)的抗腫瘤功效[1]。金雀花堿是四環(huán)喹諾里西啶結(jié)構(gòu)，具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，較低濃度時(shí)即可對(duì)肺癌細(xì)胞產(chǎn)生較大的殺傷作用，且對(duì)正常的肺部細(xì)胞的影響作用很小。有文獻(xiàn)證實(shí)，槐定堿、金雀花堿均可通過上調(diào)肺癌細(xì)胞中ROS（活性氧）水平，調(diào)控AKT/NF- B 信號(hào)通路，使AKT 磷酸化水平下調(diào)，誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體依賴性凋亡，從而使細(xì)胞產(chǎn)生G2/M 周期阻滯，抑制肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[6,7]。

苦參堿可以抑制PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路的活性，從而抑制肺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡?？鄥A對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用主要是由于細(xì)胞周期阻滯引起的，包括細(xì)胞生長周期延長和增殖減速，同時(shí)，也可增加肺癌細(xì)胞中miR-126 含量[8]。CYP通常參與抗癌藥物的激活和失活，有時(shí)也僅參與抗癌藥物的失活，表明肺癌及其周圍組織中局部CYP 的表達(dá)可能是抗癌藥物療效的重要決定因素[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苦參堿和氧化苦參堿可以劑量依賴性調(diào)控CYP2B1 的活性和基因表達(dá)，且可以激活CAR（人的組成型雄甾烷受體），誘導(dǎo)CYP2B 報(bào)告基因構(gòu)建，CYP2D6 與CYP2B 同屬參與治療藥物代謝酶CYP450 超家族成員，是某些環(huán)境因子誘發(fā)疾病的潛在易感因子，研究表明，CYP2D6 的遺傳多態(tài)性增加其對(duì)多種癌癥的易感性[10,11]。簡而言之，苦參堿和氧化苦參堿可以通過某種機(jī)制調(diào)節(jié)CYP 的表達(dá)而調(diào)控人體對(duì)肺癌的易感性及抗癌藥物的藥效。

苦豆堿可與表達(dá)p14ARF/p53 的腺病毒載體聯(lián)合治療，產(chǎn)生協(xié)同作用，使非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞產(chǎn)生G1 周期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制肺癌細(xì)胞增殖[12]。

尼古丁可以通過激活7-煙堿型乙酰膽堿受體（ 7-nAChR），促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞釋放EGF，其與EGFR 結(jié)合后可以激活A(yù)KT 和MEK-ERK 信號(hào)通路，從而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，表明靶向7-nAChR 的藥物及其受體拮抗劑可以抑制肺癌細(xì)胞的生長[13]。HTR3A是5-HT3 受體的主要亞基，細(xì)胞表面的5-HT 受體可以激活大腦中的ERK 信號(hào)級(jí)聯(lián)，進(jìn)一步促進(jìn)ERK1/2磷酸化，促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖[14]，說明抑制HTR3A的表達(dá)在某種程度上也可抑制肺癌細(xì)胞的增值。CREBBP 是編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因，是小細(xì)胞肺癌中最常見的突變基因之一，小細(xì)胞肺癌中CREBBP的缺失可降低其組蛋白乙酰化和細(xì)胞黏附基因的轉(zhuǎn)錄，驅(qū)動(dòng)腫瘤發(fā)生。而這些作用可以通過抑制HDAC基因而部分恢復(fù)，表明HDAC抑制劑可以選擇性治療由CREBBP突變引起的小細(xì)胞肺癌[15]。

綜上所述，苦豆子中含有的生物堿成分——槐定堿、金雀花堿、苦參堿、氧化苦參堿和苦豆堿等是苦豆子治療肺癌的主要有效成分，分別通過調(diào)節(jié)細(xì)胞中ROS含量、調(diào)控miRNA編碼以及調(diào)節(jié)CYP、CHRNA、HTR3A 和HDAC 等核心靶點(diǎn)，引起P53、Hippo 和PI3K/AKT/mTOR 等信號(hào)通路的激活或抑制，達(dá)到治療肺癌的目的。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，初步探究了苦豆子抗肺癌的活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為苦豆子生物堿抗肺癌機(jī)制研究提供了理論依據(jù)和線索，其預(yù)測(cè)結(jié)果有待進(jìn)一步驗(yàn)證。