豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗的研制及其ELISA抗體評價

王琳琳，方向紅，夏坤，卞立平

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇 泰州 225300；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院，江蘇 南京 210014）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus,PCV）屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬其中一員，是單股環(huán)狀DNA 病毒，病毒無囊膜，被認為是最小的動物病毒之一，該病毒的基因組大小有1 767 bp 或1 768 bp[1]。PCV 病毒存在3 種類型，其中PCV-1 對動物沒有致病性，只有PCV-2 對動物具有致病性，感染PCV-2 病毒可以導致斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎腎病綜合征及其他豬圓環(huán)病毒相關疾病[2]。近年來PCV-3被相繼報道，是一種新發(fā)現(xiàn)的病毒，感染PCV-3 的動物臨床表現(xiàn)為多器官炎癥，包括皮炎和腎病綜合癥等[3]，已在美國、意大利、中國和波蘭[4]相繼報道。目前在我國廣泛流行的PCV-2 病毒，對養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。研究表明PCV-2 含有11 個ORF，其中唯一編碼的結構蛋白為ORF2 編碼的核衣殼蛋白（Cap），該蛋白免疫原性較高，能誘導機體產(chǎn)生中和抗體，是重組疫苗研制的重要基因[5]。本試驗選用PCV2 地方流行株進行了病原分離、鑒定，構建表達Cap 蛋白的重組桿狀病毒，將滅活的重組桿狀病毒作為抗原，采用新型水佐劑制備成滅活疫苗，開展疫苗的安全和血清ELISA效力評價，目的在于研制出對動物更安全、更有效的PCV-2 新型重組疫苗。

1 材料與方法

1.1 毒株和細胞

豬圓環(huán)病毒2 型重組桿狀病毒TX01 株第5 代（F5），Sf9 昆蟲細胞，由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院保存。

1.2 主要試劑

乙醇、異丙醇、苯酚/氯仿/異丙醇（25:24:1）等均為分析純，購自北京化學試劑公司；PCR 擴增酶、dNTP等均購自大連寶生物工程有限公司；豬圓環(huán)病毒2 型抗體檢測試劑盒，購自韓國金諾（MEDIAN）診斷試劑株式會社；細胞培養(yǎng)基Sf900-II培養(yǎng)基，購自Invitrogen生命技術公司；PCV2 熒光抗體，購自VMRD 公司；BCA 蛋白含量測定試劑盒購自Thermo Fisher 公司；Hyclone 胎牛血清購自Thermo；水性佐劑，購自法國SEPPIC 公司。

1.3 試驗動物

PCV2 抗原、抗體均為陰性的2～4 周齡健康仔豬，購自泰州某養(yǎng)殖場，專人管理、定時飼喂。

1.4 抗原液制備

1.4.1 制備抗原液 取長成良好的單層Sf9 細胞，按照MOI 為0.3 接種豬圓環(huán)病毒2 型重組桿狀病毒（TX01 株），27 ℃培養(yǎng)5～7 d 后，至細胞病變達80%以上時，15 ℃凍融1～2 次后，收獲病毒液，置于15 ℃條件下保存?zhèn)溆?。采用此方法連續(xù)制備3 批抗原液，同時抽樣進行無菌檢驗。

1.5 PCV2滅活疫苗制備

PCV2 抗原除雜后用Tris-NaCl 緩沖液稀釋至40g/mL，用于疫苗配制。疫苗配比為PCV2 抗原與佐劑比例為4:1（v/v），將佐劑加入水相中，轉(zhuǎn)速250～550 r/min，均勻攪拌45 min，充分混勻。無菌定量分裝，加蓋密封，于2～8 ℃條件下保存。

1.6 PCV2滅活疫苗安全性評價

試驗篩選3 周齡健康易感仔豬5 頭，接種實驗室制備的PCV2 滅活疫苗，頸部肌肉注射4.0 mL/頭（2倍劑量），設立陰性對照組，不接種疫苗，疫苗接種后連續(xù)觀察21 d，試驗結束后稱重，對比免疫組和對照組的日增重，觀察免疫后仔豬精神、食欲和行為活動，檢查注射部位疫苗吸收情況是否良好，觀察全身及局部是否有不良反應。

1.7 PCV2滅活疫苗免疫仔豬后ELISA抗體檢測

選擇健康易感仔豬10 頭（21日齡）作為試驗動物，隨機分為2 組。每組5 頭豬。第1 組，接種PCV2滅活疫苗，頸部肌肉注射2.0 mL/頭。第2 組為空白對照組，不做任何處理。疫苗免疫后每隔7 d 采血，至免疫后21 d，分離血清，用ELISA 抗體試劑盒檢測血清中PCV2 抗體效價。

2 結果與分析

2.1 免疫后臨床觀察

疫苗免疫后，仔豬精神、食欲和行為活動均正常，用手觸摸注射部位，未見紅腫、化膿等不良癥狀出現(xiàn)，與對照組仔豬無差別。

表1 PCV2 疫苗免疫接種后臨床觀察結果Table 1 Clinical observation of piglets after immunization with PCV2 vaccine

2.2 免疫后體溫變化

疫苗免疫后，免疫組仔豬體溫正常，與對照組仔豬相比無顯著差異（P＞0.05），均無臨床發(fā)熱的情況。

2.3 免疫后日增重

表2 PCV2 疫苗免疫后仔豬體溫測定結果Table 2 Temperature measurement results of piglets after immunization with PCV2 vaccine（℃）

疫苗免疫組仔豬的日增重平均值為0.282 kg，與對照組無顯著差異（P＞0.05），見表3。

表3 PCV2 疫苗免疫后仔豬體重變化Table 3 Daily weight gain of piglets after immunization with PCV2 vaccine

2.4 PCV2 ELISA抗體水平

疫苗免疫后，免疫組仔豬21日ELISA抗體效價在1:400～1:800 之間。對照組仔豬抗體水平均低于1:50，結果見表4。

表4 疫苗免疫后仔豬PCV2 ELISA 抗體檢測結果Table 4 ELISA antibody detection results of piglets after immunization with PCV2 vaccine

3 討論

近年來在我國廣泛存在豬圓環(huán)病毒2 型感染的相關疾病，為養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。PCV2 除了導致斷奶仔豬引發(fā)PMWS 外，還會導致淋巴系統(tǒng)免疫抑制，使其他病毒或細菌繼發(fā)感染[6]，但現(xiàn)在還沒有特效藥治療該病，疫苗免疫接種是當前最重要的防控手段。目前，在我國應用的商品化疫苗主要以滅活疫苗為主，但是傳統(tǒng)的PCV2 滅活疫苗仍存在一定的缺陷，如抗原制備、抗體滴度和免疫效果等方面尚有待提高，而Cap 蛋白作為唯一的結構蛋白，可以誘導PCV2 中和抗體，產(chǎn)生良好的免疫原性，PCV2 亞單位疫苗因其具有較好的安全性、良好的免疫效果和經(jīng)濟性等優(yōu)勢而成為近年來研制該疫苗的熱點[7]。國內(nèi)外利用Cap重組蛋白免疫實驗動物開展的免疫原性實驗證實，Cap重組蛋白具有一定的免疫原性。金寧一等[8]用pVAX I真核表達系統(tǒng)表達Cap 蛋白，用構建的PCV2 Cap 基因重組質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)開始體內(nèi)免疫試驗，結果表明，該質(zhì)粒能在免疫后50 d時產(chǎn)生較高的抗體效價，說明Cap 蛋白能夠激發(fā)小鼠機體產(chǎn)生一定體液免疫應答。李天增等[9]利用桿狀病毒表達體系進行豬圓環(huán)病毒2型重組Cap 蛋白的高效表達，然后對表達的重組蛋白進行純化，將純化后的重組蛋白免疫豚鼠后誘導機體產(chǎn)生一定的PCV2 抗體，表明純化的PCV2-rCap 蛋白可作為標準蛋白用于后續(xù)表達蛋白的定量分析和PCV2 亞單位疫苗研發(fā)候選抗原。張艷艷等[10]利用桿狀病毒表達系統(tǒng)高效表達豬圓環(huán)病毒2 型Cap 蛋白，該重組蛋白免疫小鼠后可激發(fā)小鼠較高的體液免疫應答，為PCV2 疫苗的研制提供了理論依據(jù)。

本研究選取本地流行毒株PCV2 TX01 株，通過桿狀病毒表達載體表達Cap 蛋白，直接反復凍融感染嵌合Cap 的桿狀病毒的細胞，Cap 蛋白的表達濃度可達200g/mL。本研究僅通過簡單過濾細胞裂解液并滅活桿狀病毒后，與進口水性佐劑混合，制備成滅活疫苗，省去了純化繁瑣的步驟，將Cap 蛋白免疫仔豬后，觀測仔豬臨床癥狀，仔豬精神、食欲和行為活動均正常，接種部位未見紅腫、化膿等不良癥狀，證實疫苗對仔豬安全，無不良反應。免疫后仔豬日增重與對照組無顯著差異。免疫組仔豬ELISA 抗體效價在1:400～1:800 之間，說明疫苗免疫后可以有效的刺激仔豬產(chǎn)生體液免疫，下一步對免疫攻毒保護進行研究，對疫苗免疫的效力做進一步的驗證。

綜上所述，本研究采用重組桿狀病毒表達PCV2Cap蛋白，利用新型佐劑制備的新型PCV2 基因工程亞單位疫苗，免疫仔豬后可誘導產(chǎn)生較高水平的體液免疫應答，可作為防控豬圓環(huán)病毒病的候選疫苗，對實際生產(chǎn)具有廣泛的應用價值。