基于生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討蘆丁抗新冠肺炎和乳腺癌的分子機(jī)制

葉寶倩，魯可，羅慧燕，嚴(yán)倩，王雄文

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東 廣州 510405）

新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019,COVID-19）是一種致命的流行病，從2019年開(kāi)始在世界范圍內(nèi)大流行，截至2021年12月26日，全球報(bào)告的病例已經(jīng)超過(guò)2.78 億，死亡人數(shù)將近540 萬(wàn)[1]。目前，全球COVID-19 病例仍在激增，盡管迫切需要更有效的治療策略，但仍然沒(méi)有針對(duì)COVID-19 的特定抗病毒治療方法，且COVID-19 的治療指南因國(guó)家而異[2]。我們?nèi)匀患毙韬Y選和驗(yàn)證針對(duì)COVID-19 的潛在抑制劑，以應(yīng)對(duì)COVID-19 全球疫情的挑戰(zhàn)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌（breast cancer,BC）、肺癌和結(jié)直腸癌等癌癥患者感染COVID-19 的風(fēng)險(xiǎn)可能高于非癌癥患者，且預(yù)后較差[3,4]。癌癥已被證明是COVID-19相關(guān)死亡率的獨(dú)立不良預(yù)后因素。值得關(guān)注的是，根據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer,IARC）發(fā)布的2020年最新數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌新增人數(shù)達(dá)226 萬(wàn)，肺癌為220 萬(wàn)。這意味著乳腺癌正式取代肺癌，成為全球最常見(jiàn)癌癥[5]。雖然到目前為止，可用數(shù)據(jù)無(wú)法讓我們確定是否存在更容易感染COVID-19 的癌癥類(lèi)型，因?yàn)椴±盗芯哂袕V泛的異質(zhì)性[6]。但一份來(lái)自COVID-19 和癌癥聯(lián)盟注冊(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)的隊(duì)列研究報(bào)告數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌（21%）是2020年3月至2020年4月累積的1018 例COVID-19 病例中最常見(jiàn)的癌癥類(lèi)型[7]。巴黎的一項(xiàng)研究表明，乳腺癌合并COVID-19 患者的死亡率更多地取決于非癌癥合并癥，而不是先前的放射治療或當(dāng)前的抗癌治療[8]。乳腺癌的治療包括化療、放療、靶向治療和免疫治療等，會(huì)削弱免疫系統(tǒng)，并可能導(dǎo)致肺部問(wèn)題。如果在此基礎(chǔ)上感染病毒，發(fā)生并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)將會(huì)更高[9]。中國(guó)湖北的一項(xiàng)多中心回顧性研究表明，在7 d內(nèi)接受化療的乳腺癌合并COVID-19 患者發(fā)生重癥的風(fēng)險(xiǎn)更高，推測(cè)原因是化療可能會(huì)引起骨髓抑制和繼發(fā)感染，從而導(dǎo)致病情加重和COVID-19預(yù)后不良[10]。因此，有必要重視癌癥特別是乳腺癌患者潛在的COVID-19 暴露風(fēng)險(xiǎn)可能，及早探討可能的干預(yù)治療措施，避免疾病向危重癥發(fā)展。

蘆丁（rutin）也稱(chēng)為蕓香苷、維生素P，是一種植物來(lái)源的天然強(qiáng)抗氧化劑，廣泛存在于自然界，幾乎所有的蕓香科和石楠科植物中均有之，也是毛冬青、連翹和槐角等常用中藥材的有效成分之一，具有多種生物活性，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒和抗癌等作用[11,12]。黃曦文等[13]總結(jié)發(fā)現(xiàn)，蘆丁在誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞周期阻滯、調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)水平以抑制乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移、提高乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性等方面具有重要作用。Elsayed Heba E 等[14]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，蘆丁可以作為抗三陰性乳腺癌的新型c-Met 受體抑制先導(dǎo)物。此外，多項(xiàng)研究已經(jīng)證明，蘆丁可以穩(wěn)定且有效地抑制COVID-19 的主要蛋白酶，是對(duì)COVID-19 有治療潛力的候選藥物[15-17]。本研究基于生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接，對(duì)蘆丁進(jìn)行深入的研究和預(yù)測(cè)，為進(jìn)一步研究中藥對(duì)抗COVID-19 和乳腺癌的作用機(jī)制提供有意義和有用的信息。

1 材料與方法

1.1 資料庫(kù)及研究流程

具體研究流程見(jiàn)圖1。

圖1 蘆丁抗新冠肺炎和乳腺癌的關(guān)鍵分子機(jī)制研究流程Fig.1 Flow chart of key molecular mechanisms of rutin in the treatment of COVID-19 and breast cancer

1.2 BC/COVID-19相關(guān)疾病靶點(diǎn)獲取與差異基因篩選

于2021年12月4日從癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas,TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載BC 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。另外，以“COVID-19”為關(guān)鍵詞，從Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.omim.org/）、KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genome.jp/kegg/）和NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)基因組模塊(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)下載與COVID-19 相關(guān)疾病靶點(diǎn)，將從上述4 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的基因靶點(diǎn)合并后去重。使用R 語(yǔ)言對(duì)BC 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，以基因表達(dá)數(shù)據(jù)大于0 作為過(guò)濾條件，然后與COVID-19 的潛在靶點(diǎn)取交集，提取COVID-19相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)。再使用R語(yǔ)言Bioconductor的“l(fā)imma”包篩選差異基因，將顯著差異基因的篩選條件設(shè)定為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate,FDR）＜0.05和|log FC|＞1[18,19]，最終獲得表達(dá)有顯著性差異的BC/COVID-19 相關(guān)疾病靶點(diǎn)，并將結(jié)果以火山圖形式輸出。

1.3 臨床相關(guān)性分析

通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載BC 的臨床數(shù)據(jù)，共獲取1 097 條包括性別、年齡、生存時(shí)間、生存狀態(tài)、病理分期等與之對(duì)應(yīng)的臨床信息用于后續(xù)分析。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，刪除生存時(shí)間≤30 d 的數(shù)據(jù)。將生存時(shí)間與R 語(yǔ)言的“l(fā)imma”包篩選得到的差異基因的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行合并。使用R 語(yǔ)言的“survival”包進(jìn)行生存分析和建模。對(duì)篩選得到的差異基因進(jìn)行單因素Cox 回歸生存分析（P＜0.05），并繪制森林圖。對(duì)單因素Cox回歸分析得到的相關(guān)基因進(jìn)行多因素逐步回歸分析，構(gòu)建預(yù)測(cè)BC/COVID-19 患者預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)的多因素Cox模型。將風(fēng)險(xiǎn)值的中位數(shù)作為閾值，將患者分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組，使用R 語(yǔ)言的“survival”“survminer”包進(jìn)行生存分析，比較高低風(fēng)險(xiǎn)組生存是否具有差異，并繪制生存曲線[20]。進(jìn)一步分析每個(gè)BC 患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（risk score）、生存狀態(tài)和預(yù)后基因的表達(dá)分布，并使用R 語(yǔ)言繪制出風(fēng)險(xiǎn)曲線、生存狀態(tài)圖和風(fēng)險(xiǎn)熱圖。對(duì)模型進(jìn)行單因素與多因素獨(dú)立預(yù)后分析，繪制臨床相關(guān)性森林圖。使用R 語(yǔ)言的“survivalROC”包繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve,ROC）曲線，利用ROC 曲線評(píng)價(jià)模型性能。

1.4 蘆丁相關(guān)藥物靶點(diǎn)搜集與篩選

以“Rutin”為關(guān)鍵詞，通過(guò)可訪問(wèn)的在線平臺(tái)與軟件工具，包括中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database andAnalysisPlatform,TCMSP）（https://www.tcmsp-e.com/）、Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisstargetprediction.ch/）、TargetNet 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://targetnet.scbdd.com/）、Batman 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）和Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.drugbank.com/）[21,22]，搜集和篩選蘆丁相關(guān)藥物靶點(diǎn)。將搜集到的靶點(diǎn)合并后去重。

1.5 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析

將R語(yǔ)言篩選后得到的表達(dá)有顯著性差異的BC/COVID-19 相關(guān)疾病靶點(diǎn)與合并后去重得到的蘆丁相關(guān)藥物靶點(diǎn)取交集，獲得藥物 疾病共同靶點(diǎn)。使用R語(yǔ)言包，包括“clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”“enrichplot”“ ggplot2”和“pathview”，對(duì)藥物 疾病共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 富集分析[23-25]。首先安裝R 語(yǔ)言Bioconductor 的“org.Hs.eg.db”包，將藥物 疾病共同靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換成entrezID。安裝“clusterProfiler”包[26]和“pathview”包[27]，將已轉(zhuǎn)換的entrezID，以P＜0.05，Q＜0.05 為過(guò)濾條件，對(duì)藥物-疾病共同靶基因進(jìn)行GO 與KEGG 富集分析，最后用“enrichplot”“ggplot2”和“pathview”包，將結(jié)果以氣泡圖形式輸出。

1.6 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析與核心靶點(diǎn)篩選

將上述藥物 疾病共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cn.string-db.org/）進(jìn)行分析，將物種限定為“Homo sapiens”，根據(jù)所需設(shè)置靶點(diǎn)間的要求和得分（置信度設(shè)為0.9），隨后導(dǎo)出蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network,PPI）圖及其對(duì)應(yīng)的相互作用表格（TSV 格式）。將TSV 表格導(dǎo)入Cytoscape軟件，使用Cytoscape 軟件的Network-Analyzer 工具計(jì)算網(wǎng)絡(luò)相關(guān)屬性，結(jié)合R 語(yǔ)言，進(jìn)一步篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)[22]。

1.7 分子對(duì)接

分子對(duì)接能有效確定與靶受體部位空間、作用力和電性特征匹配的小分子化合物，預(yù)測(cè)與靶點(diǎn)結(jié)合的可能性[28]。為觀察蘆丁進(jìn)入機(jī)體后，能否和機(jī)體的靶蛋白結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮藥效，將上述獲得的核心靶點(diǎn)及COVID-19 與蘆丁進(jìn)行分子對(duì)接。通過(guò)PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）[29]獲得蘆丁的分子結(jié)構(gòu)。通過(guò)PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）[30]檢索核心靶點(diǎn)及COVID-19 的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，根據(jù)配體結(jié)構(gòu)下載pdb 文件。使用Discovery Studio（DS）軟件處理蛋白質(zhì)pdb 文件，用AutoDock Tools 1.5.6進(jìn)行分子對(duì)接，PyMOL 處理分子對(duì)接結(jié)果[31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 BC/COVID-19相關(guān)疾病靶點(diǎn)獲取與差異基因篩選結(jié)果

首先，使用TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載了BC 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，其中正?；虬┡越M有113 例樣本，腫瘤組有1 109例樣本。其次，從Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)、KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)基因組模塊，共收集了2 612 個(gè)與COVID-19 相關(guān)的基因。對(duì)BC 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理后，將這兩個(gè)基因簇取交集，提取了2 539 個(gè)COVID-19 相關(guān)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)。使用R 語(yǔ)言的“l(fā)imma”包篩選差異基因，最終獲得394 個(gè)表達(dá)有顯著性差異的BC/COVID-19 相關(guān)疾病靶點(diǎn)，其中223 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，171 個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（圖2）。

圖2 BC/COVID-19 相關(guān)差異基因表達(dá)火山圖Fig.2 Volcano map of BC/COVID-19 related differential genes

2.2 BC/COVID 19 相關(guān)基因的臨床相關(guān)性分析結(jié)果

為了解BC/COVID-19 相關(guān)基因與BC/COVID-19臨床因素的相關(guān)性，我們對(duì)394 個(gè)差異基因進(jìn)行了單因素和多因素Cox 回歸分析。首先，單因素回歸Cox分析確定了42 個(gè)基因與BC/COVID-19 顯著相關(guān)（P＜0.05）（圖3，表1）。而多因素回歸Cox 分析確定了42 個(gè)基因中的20 個(gè)靶基因，包括DPP4、IL18、PDCD1、IDO1、ANO6、SDC1、PF4、ATP7B、CXCL9、NT5E、GSN、WLS、LIMCH1、EEF1A2、EZR、BAMBI、SLC35A2、KIAA0319、SLC16A6 和HBA1（表2）。進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型的構(gòu)建，即risk score=（0.040 775 916 DPP4）-（0.039 682 033 IL18）+（0.167 157 414 PDCD1）-（0.027 784 36 IDO1）+（0.046 577 695 ANO6）+（0.001 965 139 SDC1）+（1.420 090 905 PF4）-（0.047 268 456 ATP7B）-（0.006 119 714 CXCL9）+（0.075 132 227 NT5E）-（0.009 871 433 GSN）-（0.039 016 82 WLS）+（0.033 558 393 LIMCH1）+（0.001 216 977 EEF1A2）+（0.002 765 01 EZR）+（0.004 978 992 BAMBI）+（0.021 846 763 SLC35A2）+（0.290 057 506 KIAA0319）-（0.014 289 454 SLC16A6）-（0.544 899 518 HBA1）。

表1 單因素Cox 回歸分析結(jié)果Table 1 Results of the univariate Cox regression analysis

表2 多因素Cox 回歸分析結(jié)果Table 2 Results of the multivariate Cox regression analysis

圖3 單因素Cox 回歸分析森林圖Fig.3 Forest plot of univariate Cox regression analysis results

基于代表患者風(fēng)險(xiǎn)的多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析的Coef 值（表2），我們將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。在總體生存分析中，高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間觀察到顯著差異（圖4A）。我們進(jìn)一步分析了每個(gè)BC患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、生存狀態(tài)和上述20 個(gè)基因的表達(dá)分布，并繪制出風(fēng)險(xiǎn)曲線（圖4B）、生存狀態(tài)圖（圖4C）和風(fēng)險(xiǎn)熱圖（圖4D）。結(jié)果表明，患者的風(fēng)險(xiǎn)值越大，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分越高（圖4B)。

圖4 多因素Cox 回歸分析探討B(tài)C/COVID-19 相關(guān)基因的預(yù)后價(jià)值Fig.4 Multivariate Cox regression analysis to explore the prognostic value of BC/COVID-19 related genes

此外，我們對(duì)這20 個(gè)基因進(jìn)行了單因素與多因素獨(dú)立預(yù)后分析（圖5）。結(jié)果表明，年齡、分期和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分在單因素與多因素獨(dú)立預(yù)后分析中都具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），均可作為獨(dú)立預(yù)后因子。三者的風(fēng)險(xiǎn)比率（hazard ratio,HR）均大于1，提示均為高風(fēng)險(xiǎn)因素。用ROC 曲線解析預(yù)測(cè)模型（圖6），結(jié)果顯示，多因素Cox 模型構(gòu)建的疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分得到的曲線下面積（area under the curve,AUC）值為0.811，提示該模型具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值?；贏UC 值，與其他臨床性狀構(gòu)建的模型進(jìn)行比較，可以得出本研究構(gòu)建的預(yù)后模型為最優(yōu)模型。

圖5 獨(dú)立預(yù)后分析森林圖Fig.5 Forest plot of the results of the independent prognostic analysis

圖6 基于多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型的ROC 曲線Fig.6 ROC curve based on the multivariate Cox proportional hazard regression model

臨床相關(guān)性分析表明（表3），IL18 的表達(dá)與原發(fā)腫瘤的范圍相關(guān)，在T1-T2中的表達(dá)高于T3-T4。DPP4、IDO1、SDC1、EZR、SLC35A2、SLC16A6的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)區(qū)擴(kuò)散的數(shù)量和范圍有關(guān)。IDO1 的表達(dá)水平與BC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈明顯的負(fù)相關(guān)。同時(shí)，IDO1、IL18 的表達(dá)還與分期相關(guān)，在I 和II 期中的表達(dá)高于III和IV期（圖7）。此外，CXCL9、DPP4、EZR、GSN、LIMCH1、PDCD1、PF4、SDC1、SLC35A2 和WLS 的表達(dá)與年齡相關(guān)（圖8）。

圖7 20 個(gè)基因的臨床預(yù)后分析（1）Fig.7 Results of clinical prognostic analysis of 20 genes(1)

圖8 20 個(gè)基因的臨床預(yù)后分析（2）Fig.8 Results of clinical prognostic analysis of 20 genes (2)

表3 臨床相關(guān)性分析Table 3 Clinical correlation analysis

2.3 蘆丁相關(guān)藥物靶點(diǎn)搜集與篩選結(jié)果

使用TCMSP、Swiss Target Prediction、TargetNet、Batman 和Drugbank 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取蘆丁相關(guān)作用靶點(diǎn)。去掉重復(fù)基因后，共獲得16 392 個(gè)蘆丁相關(guān)靶標(biāo)。將394 個(gè)表達(dá)有顯著性差異的BC/COVID-19 相關(guān)疾病靶點(diǎn)與蘆丁相關(guān)作用靶點(diǎn)取交集，獲得332 個(gè)藥物 疾病共同靶點(diǎn)（圖9）。

圖9 藥物 疾病共同靶點(diǎn)韋恩圖Fig.9 Venn diagram of drug disease common targets

2.4 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析結(jié)果

對(duì)藥物-疾病共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析。GO功能富集分析包括3 個(gè)部分：細(xì)胞組分（cellular component,CC）、分子功能（molecular function,MF）和生物過(guò)程（biological process,BP）。GO 功能富集分析結(jié)果表明，藥物 疾病共同靶點(diǎn)在生物過(guò)程中，主要參與白細(xì)胞遷移、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)白細(xì)胞活化等。在細(xì)胞組分層面上，主要富集在細(xì)胞質(zhì)囊泡腔、囊泡腔、細(xì)胞外基質(zhì)等上。在分子功能層面上，主要與受體調(diào)節(jié)活性、受體配體活性、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合等有關(guān)。按照Q 值大?。≦＜0.05），將排名前10 位的條目以氣泡圖形式輸出（圖10A）。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，共同靶點(diǎn)主要富集于2019 新型冠狀病毒、細(xì)胞因子 細(xì)胞因子受體相互作用和補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)途徑等相關(guān)通路上。按照Q 值大?。≦＜0.05），繪制前30 條信號(hào)通路氣泡圖（圖10B）。氣泡的大小表示該條目下差異基因的個(gè)數(shù)，點(diǎn)越大表示基因數(shù)越多。顏色表示Q 值，越紅表示Q 值越小，富集越明顯。

圖10 藥物 疾病共同靶點(diǎn)的富集分析Fig.10 Gene ontology analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway of drug-disease common targets

2.5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析與核心靶點(diǎn)篩選結(jié)果

將上述藥物 疾病共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，并構(gòu)建PPI 圖（圖11）。使用Cytoscape 軟件的Network-Analyzer 工具計(jì)算網(wǎng)絡(luò)相關(guān)屬性。因介度中心性（betweenness centrality,BC）、接近中心性（closeness centrality,CC）、度中心性（degree centrality,DC）、特征向量中心性（eigenvector centrality,EC）、局部邊連通性（local average connectivity,LAC）和網(wǎng)絡(luò)中心性（network centrality,NC）等6 個(gè)參數(shù)代表整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)單獨(dú)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)渲匾?，其量化值越大，說(shuō)明節(jié)點(diǎn)在該網(wǎng)絡(luò)中越重要。因此以這6 個(gè)參數(shù)的中位值作為篩選條件，使用R 語(yǔ)言將數(shù)據(jù)過(guò)濾2次，每次僅選取所有參數(shù)均大于中位值的靶點(diǎn)進(jìn)行下一次篩選，末次篩選所剩的靶點(diǎn)則為核心靶點(diǎn)[32-34]。第1 次篩選，以BC≥0、CC≥0.020 080 321、DC≥2、EC≥0.001 318 530 5、LAC≥0、NC≥0 為篩選條件，篩選后得到靶點(diǎn)39 個(gè)（圖12A）。第2 次篩選，以BC≥17.033 333 33、CC≥0.408 602 151、DC≥4、EC≥0.080 259 524、LAC≥1.714 285 714、NC≥3 為篩選條件，最終確定了12 個(gè)核心基因靶點(diǎn)（圖12B）。核心基因靶點(diǎn)包括AGT、CCL2、IL6、CSF3、STAT1、CXCL10、PIK3R1、SOCS3、CXCL2、IL12B、CCL11 和CXCR4。

圖11 藥物 疾病共同靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.11 PPI network diagram of drug disease common targets

圖12 核心基因靶點(diǎn)篩選Fig.12 Screening of the core target genes

2.6 分子對(duì)接結(jié)果

COVID-19 主蛋白酶在COVID-19 病毒復(fù)制過(guò)程中起關(guān)鍵作用，且具有不同于人體蛋白酶的特異切割位點(diǎn)，被認(rèn)為是開(kāi)發(fā)抗COVID-19 藥物的理想靶標(biāo)[35,36]。為了確定蘆丁與12 個(gè)核心基因靶點(diǎn)及COVID-19 的可能結(jié)合以及確定的核心靶點(diǎn)，進(jìn)行了分子對(duì)接分析。核心基因靶點(diǎn)及COVID-19 主蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)是從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中收集的，PDB ID 為見(jiàn)表4，用于與蘆丁的對(duì)接分析。對(duì)接的結(jié)果見(jiàn)圖13，表4。分子對(duì)接得分代表分子對(duì)接吻合度，分?jǐn)?shù)越小代表配體與受體蛋白結(jié)合性越好，發(fā)生作用的可能性越大。一般認(rèn)為，結(jié)合能低于 20.92 kJ/mol表示對(duì)接結(jié)果比較穩(wěn)定[37]。我們的結(jié)果顯示，蘆丁與13 個(gè)靶點(diǎn)的最低結(jié)合均能小于或者等于 20.92 kJ/mol，說(shuō)明蘆丁與以上核心基因靶點(diǎn)結(jié)合活性較好。其中，蘆丁與CXCR4 和SOCS3的對(duì)接效果最好。

圖13 蘆丁與12 個(gè)核心基因靶點(diǎn)及COVID-19 的分子對(duì)接結(jié)果Fig.13 Results of molecular docking of rutin with 12 core gene targets and COVID-19

表4 蘆丁與12 個(gè)核心基因靶點(diǎn)及COVID-19 的分子對(duì)接信息Table 4 Information on the molecular docking of rutin with 12 core gene targets and COVID-19

3 討論

COVID-19 目前仍在全球范圍內(nèi)大流行，感染率和死亡率不斷上升，病毒變異毒株的出現(xiàn)使其傳播力更為顯著，許多國(guó)家因此而經(jīng)歷了COVID-19 的第二次或第三次爆發(fā)[38]。疫苗接種是一項(xiàng)重要的預(yù)防性健康措施，可預(yù)防有癥狀和嚴(yán)重的COVID-19，但僅靠疫苗無(wú)法擺脫這場(chǎng)危機(jī)[39,40]。我們需要探索和開(kāi)發(fā)出更安全、更特異的針對(duì)COVID-19 的療法。此外，癌癥患者被認(rèn)為是COVID-19 的高度易感人群，且多項(xiàng)臨床研究結(jié)果表明，由于腫瘤生長(zhǎng)直接引起和抗癌治療間接引起的免疫功能低下，患有COVID-19 的惡性腫瘤患者更易發(fā)展為重癥且預(yù)后較差[7,41-43]。乳腺癌已上升為全球第一大癌，其防控形勢(shì)仍然嚴(yán)峻。加之在COVID-19 流行期間，乳腺癌患者面臨著更多的風(fēng)險(xiǎn)因素。Perrine Vuagnat[8]等人的一項(xiàng)臨床研究顯示，乳腺癌合并COVID-19 感染的患者，死亡率更多地取決于COVID-19 合并癥。我們以乳腺癌患者作為切入點(diǎn)，研究合并COVID-19 感染的預(yù)防性干預(yù)措施，有助于防治腫瘤合并COVID-19 患者重癥化，對(duì)抗擊疫情有積極的意義。

中醫(yī)藥在抗擊COVID-19 疫情中發(fā)揮了重要的作用。從有效中成藥和方劑中尋找活性成分并進(jìn)一步揭示其作用機(jī)制，具有重要的科學(xué)和應(yīng)用價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，中藥可以通過(guò)多種成分作用于多種途徑的多個(gè)靶點(diǎn)，在COVID-19 的治療中發(fā)揮抗病毒、抗炎和免疫調(diào)節(jié)和靶器官保護(hù)的作用。其中，蘆丁在多項(xiàng)研究中均被提及可以作為治療COVID-19的有力候選先導(dǎo)物[44-49]。且研究證實(shí)，蘆丁在抗乳腺癌中也同樣發(fā)揮著重要的作用[14,50,51]。因此，我們假設(shè)蘆丁可能對(duì)合并COVID-19 感染的乳腺癌患者發(fā)揮有效的藥理活性。

在本研究中，我們首先篩選并確定了394 個(gè)BC/COVID-19 相關(guān)疾病靶點(diǎn)。差異表達(dá)基因分析顯示，有223 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，171 個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。對(duì)疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行了臨床相關(guān)性分析。根據(jù)獨(dú)立的預(yù)后和生存分析，最終確定了20 個(gè)重要的差異基因，包括DPP4、IL18、PDCD1、IDO1、ANO6、SDC1、PF4、ATP7B、CXCL9、NT5E、GSN、WLS、LIMCH1、EEF1A2、EZR、BAMBI、SLC35A2、KIAA0319、SLC16A6 和HBA1，可作為預(yù)測(cè)乳腺癌合并COVID-19 感染患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。綜上所述，這394 個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)可能為潛在的治療靶標(biāo)。此外，我們搜集和篩選蘆丁相關(guān)藥物靶點(diǎn)，并與上述疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集，獲得332 個(gè)藥物 疾病共同靶點(diǎn)。將332 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，得出核心基因靶點(diǎn)CXCR4、SOCS3 和PIK3R1 等共12 個(gè)。CXCR4 又稱(chēng)趨化性細(xì)胞受體因子4，其在超過(guò)40% 的乳腺癌組織中高表達(dá)[52]，與乳腺癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有研究證明，CXCR4 的過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致LL-37 在乳腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)的促遷移信號(hào)傳導(dǎo)和遷移率的增強(qiáng)[53]。SOCS3 即為細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子3，在涉及多種病毒的病毒免疫逃逸中發(fā)揮重要作用，SOCS1/3 拮抗劑有作為COVID-19 治療劑的可能[54]。PIK3R1 是炎癥基因，Shun Li 等人利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)揭示，無(wú)論是COVID-19 重度或危重患者還是有中度癥狀患者，PIK3R1 在總T 細(xì)胞、亞群CD4+T 細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞中均為高表達(dá)[55]。由此可見(jiàn)，這12 個(gè)核心基因靶點(diǎn)可能是蘆丁治療乳腺癌和COVID-19 的有效藥理學(xué)靶點(diǎn)。結(jié)合分子對(duì)接的結(jié)果，也進(jìn)一步說(shuō)明蘆丁在乳腺癌和COVID-19 的治療中主要是通過(guò)CXCR4、SOCS3 和PIK3R1 等靶點(diǎn)發(fā)揮作用，且可以有效地與COVID-19 中的特定蛋白質(zhì)結(jié)合。藥物-疾病共同靶點(diǎn)的GO 和KEGG 富集分析結(jié)果表明，蘆丁發(fā)揮的抗乳腺癌和抗COVID-19 作用主要與白細(xì)胞遷移與活化的調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等相關(guān)，且相關(guān)靶點(diǎn)在COVID-19、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)途徑等相關(guān)通路顯著富集。

4 結(jié)論

本研究采以蘆丁的靶蛋白、信號(hào)通路以及生物學(xué)功能的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)，通過(guò)生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接分析，揭示蘆丁多靶點(diǎn)、多通路抗乳腺癌和COVID-19 的分子機(jī)制，為COVID-19 疫情下乳腺癌患者的預(yù)防性治療提供更廣泛、更深入的研究。結(jié)合上述研究結(jié)果可知，輔助補(bǔ)充蘆丁可能會(huì)提高合并COVID-19 感染的乳腺癌患者的臨床療效。