水貂犬瘟熱、細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)滅活疫苗制備及其質(zhì)量評價(jià)

羅國良，鐘偉，易立，王振軍，馮二凱，劉志杰，焉石，劉鈺倫，劉偉，姜秋杰，董清平，李斌茹，程悅寧※

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112；2.長春西諾生物科技有限公司，吉林 長春 130012；3.吉林省動物疫病預(yù)防控制中心，吉林 長春 130062；4.肈源縣畜牧水產(chǎn)技術(shù)服務(wù)中心，黑龍江 大慶 166500；5.劉臺莊畜牧獸醫(yī)中心站，河北 秦皇島 066600）

水貂犬瘟熱是引起水貂以雙相熱、白細(xì)胞減少、鼻炎和黏膜炎為特征的傳染病[1,2]。水貂病毒性腸炎是以出血和壞死、急劇下痢和白細(xì)胞高度減少為特征的急性病毒性傳染病[3,4]。水貂犬瘟熱和水貂細(xì)小病毒性腸炎是危害養(yǎng)貂業(yè)的兩大傳染病，兩種傳染病在養(yǎng)貂業(yè)中均有較高的發(fā)病率和死亡率。疫苗免疫接種是目前預(yù)防這兩種傳染病的最有效的方法。目前，預(yù)防兩種傳染病的疫苗有水貂犬瘟熱活疫苗、水貂細(xì)小病毒性腸炎滅活疫苗、水貂犬瘟熱、細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗以及水貂犬瘟熱活疫苗與水貂細(xì)小病毒性腸炎滅活疫苗聯(lián)用疫苗[5]。聯(lián)苗具有“一針多防”、減少免疫次數(shù)和提高接種效率等優(yōu)點(diǎn)?；钜呙缭趯?shí)際應(yīng)用中存在出現(xiàn)毒株變異和毒力返強(qiáng)等風(fēng)險(xiǎn)，不利于傳染病的清除與凈化[6]，因此，研制出一種水貂犬瘟熱和水貂細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)滅活疫苗對于該病的預(yù)防和凈化具有重要意義。

本研究采用免疫原性良好的犬瘟熱株CDV-LG株和水貂細(xì)小病毒MEVB 株，分別接種于Vero 細(xì)胞和貓腎傳代細(xì)胞（F81 株）培養(yǎng)，收獲細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)二乙烯亞胺（BEI）滅活后，加氫氧化鋁膠制成，經(jīng)性狀檢驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)和安全檢驗(yàn)，證明該二聯(lián)滅活疫苗對水貂具有良好的安全性；同時(shí)采用血清學(xué)方法和免疫攻毒方法進(jìn)行效力檢驗(yàn)，證明該產(chǎn)品具有良好的免疫效果，能抵抗犬瘟熱強(qiáng)毒和水貂細(xì)小病毒強(qiáng)毒的攻擊。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與細(xì)胞 犬瘟熱CDV-LG 株（保藏編號GCMCC NO.17989）、水貂細(xì)小病毒MEVB 株均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種動物病原與免疫團(tuán)隊(duì)保存鑒定；F81 細(xì)胞、Vero 細(xì)胞均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種動物病原與免疫團(tuán)隊(duì)保存鑒定。

1.1.2 主要試劑 MEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶-EDTA消化液（Corning公司）；2-溴乙胺氫溴酸鹽（BEA）（Sigmaaldrich 公司）；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物 水貂購自吉林市昌邑區(qū)景文毛皮動物養(yǎng)殖場。50日齡以上水貂，公母隨機(jī)，體況健康且未免疫水貂犬瘟熱疫苗和水貂細(xì)小病毒性腸炎疫苗，免疫前經(jīng)采血檢測，犬瘟熱病毒中和抗體和水貂細(xì)小病毒HI 抗體均為陰性（≤1:4）。

1.2 方法

1.2.1 犬瘟熱病毒液的制備與檢驗(yàn) 從生產(chǎn)細(xì)胞庫中取出凍存的138 代Vero 細(xì)胞，置于37 ℃水浴中融化，接入到含6%～8%新生牛血清的MEM 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 后換液培養(yǎng)2～3 d 至細(xì)胞長成致密單層，用含0.25%的胰酶消化，按1:3～1:5 傳代，擴(kuò)大培養(yǎng)。將擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)胞接種到轉(zhuǎn)瓶中，37 ℃培養(yǎng)48～72 h，控制轉(zhuǎn)速為8～12 r/h。將生產(chǎn)用毒種按MOI 為0.04～0.08 接種犬瘟熱病毒CDV-LG 株于制備好的Vero 細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)瓶中，將細(xì)胞懸液與毒種混合均勻后置于33～35 ℃、8～10 r/h 條件下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，連續(xù)觀察4d，廢棄污染或生長異常的細(xì)胞，當(dāng)病變達(dá)到80%以上時(shí)收獲，收獲的病毒液-18 ℃以下凍存?zhèn)溆谩０匆陨戏椒ㄖ苽? 批犬瘟熱病毒液，進(jìn)行無菌檢驗(yàn)和病毒含量測定。

1.2.2 水貂細(xì)小病毒液的制備與檢驗(yàn) 從生產(chǎn)細(xì)胞庫中取出凍存的57 代F81 細(xì)胞，置于37 ℃水浴中融化，接入到含8%～10%新生牛血清的MEM 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 后換液培養(yǎng)2～3 d 至細(xì)胞長成致密單層，用含0.25%的胰酶消化，按1:3～1:5 傳代，擴(kuò)大培養(yǎng)，將擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)胞接種到轉(zhuǎn)瓶中，37℃培養(yǎng)48～72h，控制轉(zhuǎn)速為8～10r/h。將F81 細(xì)胞消化后制備成細(xì)胞懸液，按1:3～1:5 分瓶，按MOI 為0.05～0.1 同步接種水貂細(xì)小病毒MEVB株生產(chǎn)毒種，33～35 ℃、8～10 r/h 轉(zhuǎn)動培養(yǎng)3～5 d，每日觀察病變情況，當(dāng)病變率達(dá)80% 以上時(shí)收獲，凍融后即為水貂細(xì)小病毒液，收獲的病毒液-18 ℃以下保存?zhèn)溆谩０匆陨戏椒ㄖ苽? 批水貂細(xì)小病毒液，進(jìn)行無菌檢驗(yàn)和病毒含量測定。

1.2.3 半成品的制備與檢驗(yàn) 將檢驗(yàn)合格的犬瘟熱病毒液、水貂細(xì)小病毒液分別融化后，分別加入終濃度為0.002 mol/L 的BEI，充分混勻，置于30 ℃下滅活24 h，滅活期間應(yīng)不斷攪拌。滅活后分別加入終濃度為0.002 mol/L 的硫代硫酸鈉中和BEI，即得兩種病毒液的半成品。

分別取滅活的犬瘟熱病毒液和水貂細(xì)小病毒液，用細(xì)胞培養(yǎng)基1:5 稀釋后分別吸附接種Vero細(xì)胞、同步接種F81 細(xì)胞各2 瓶，每瓶0.5 mL，培養(yǎng)4 d 后分別再傳1代，觀察細(xì)胞有無病變，收獲傳代后的水貂細(xì)小病毒的培養(yǎng)液，進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)，檢測其血凝活性。

1.2.4 成品制備 將滅活的犬瘟熱病毒液和水貂細(xì)小病毒液按1:1 的比例混合均勻，將混合病毒液與50%氫氧化鋁佐劑按9:1 比例混合均勻，無菌定量分裝，加蓋密封，即得成品。按以上方法用3批半成品制備3批成品。

1.2.5 成品質(zhì)量評價(jià)

1.2.5.1 性狀 靜置后，上層應(yīng)為粉紅色澄清液體，下層有少量乳白色沉淀，搖勻后應(yīng)呈均勻混懸液。

1.2.5.2 無菌檢驗(yàn) 按2020 版《中國獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)無菌生長。

1.2.5.3 安全檢驗(yàn) 選擇50日齡以上健康易感水貂5 只，各肌肉注射疫苗5 頭份（5 mL），分2～3 點(diǎn)注射，觀察10 d，觀察精神、食欲、體溫、糞便與全身應(yīng)無異常。

1.2.5.4 效力檢驗(yàn) 血清學(xué)方法：選擇50日齡以上健康易感水貂5 只，每只肌肉注射疫苗1 頭份（1 mL），21 d 后采血，分離血清，按下列方法測定血清中犬瘟熱病毒中和抗體和水貂細(xì)小病毒HI 抗體效價(jià)。

犬瘟熱病毒中和抗體測定分別用100 TCID50 的犬瘟熱病毒CDV-LG 株培養(yǎng)物與各試驗(yàn)水貂血清于37 ℃作用1 h，按2020 版《中國獸藥典》附錄測定血清中犬瘟熱病毒中和抗體。

水貂細(xì)小病毒HI 抗體測定 分別用4 單位血凝素的水貂細(xì)小病毒MEVB 株培養(yǎng)物與各試驗(yàn)水貂血清于37℃作用1 h，按2020 版《中國獸藥典》附錄，測定各免疫水貂血清的HI 效價(jià)（1%豬紅細(xì)胞）。

免疫攻毒法：犬瘟熱免疫攻毒 選擇50日齡以上健康易感水貂10 只（CDV中和抗體效價(jià)不高于1:4），分為疫苗組和對照組兩組，疫苗組各皮下注射疫苗1頭份（1 mL），對照組各皮下注射MEM 培養(yǎng)液1mL，接種21d后，每只水貂攻毒犬瘟熱強(qiáng)毒CDV-HLJ17 株100 ID50（5mL），其中皮下注射犬瘟熱強(qiáng)毒CDV-HLJ17 株病毒液4.5mL，滴鼻和點(diǎn)眼0.5 mL，觀察14 d，觀察是否有犬瘟熱的典型癥狀及排毒；其中出現(xiàn)以下1 項(xiàng)及1項(xiàng)以上即判為出現(xiàn)典型癥狀：（1）體溫升高達(dá)40 ℃以上；（2）出現(xiàn)結(jié)膜炎、干性或黏性眼眵；流清涕、黏性或膿性鼻涕；（3）精神沉郁、食欲減退或廢絕。排毒檢測應(yīng)用犬瘟熱抗原檢測試紙檢測發(fā)病動物血液、眼鼻分泌物，或死亡動物肺臟，呈現(xiàn)陽性即示為排毒；同時(shí)出現(xiàn)典型癥狀及排毒即判為發(fā)病，免疫組不出現(xiàn)典型癥狀和排毒中的任1 項(xiàng)，即判為保護(hù)。

犬細(xì)小免疫攻毒 選擇50日齡以上健康易感水貂10 只（MEV HI 抗體效價(jià)不高于1:4），分為疫苗組和對照組兩組，疫苗組各皮下注射疫苗1 頭份（1 mL），對照組各皮下注射MEM 培養(yǎng)液1 mL，接種21 d 后，每只水貂攻毒（灌服）水貂細(xì)小病毒強(qiáng)毒MEV-SD16株100 ID50（10 mL），觀察10 d，觀察是否有水貂細(xì)小病毒典型癥狀及排毒；其中出現(xiàn)以下1 項(xiàng)及1 項(xiàng)以上即判為出現(xiàn)典型癥狀：精神沉郁、萎靡；食欲減退或廢絕；軟便、稀便、水樣便或血便。排毒檢測應(yīng)用豬紅細(xì)胞血凝試驗(yàn)檢測攻毒水貂肛拭子，肛拭子對豬紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)血凝價(jià)不低于1:256，判定為排毒；同時(shí)出現(xiàn)典型癥狀及排毒即判為發(fā)病，免疫組不出現(xiàn)典型癥狀和排毒中的任1 項(xiàng)，即判為保護(hù)。

2 結(jié)果

2.1 犬瘟熱病毒液制備與檢驗(yàn)結(jié)果

制備了3 批水貂犬瘟熱病毒液，經(jīng)檢驗(yàn)，3 批水貂犬瘟熱病毒液無菌檢驗(yàn)合格，病毒含量均在106.50～106.80TCID50/mL，符合制定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（≥106.50/mL），且無明顯的批間差異，見表1。

表1 水貂犬瘟熱病毒液制備與檢驗(yàn)結(jié)果Table 1 Preparation and testing results of the mink canine distemper virus

2.2 水貂細(xì)小病毒液制備與檢驗(yàn)結(jié)果

制備了3 批水貂細(xì)小病毒液，經(jīng)檢驗(yàn)，3 批水貂細(xì)小病毒液無菌檢驗(yàn)合格，病毒含量均在106.80～107.20TCID50/mL，均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（≥106.50TCID50/mL）。且批間無明顯差異，見表2。

表2 水貂細(xì)小病毒液制備與檢驗(yàn)結(jié)果Table 2 Preparation and testing results of the mink enteritis virus

2.3 半成品制備與檢驗(yàn)結(jié)果

滅活了3 批犬瘟熱病毒液和3 批水貂細(xì)小病毒液，經(jīng)滅活檢驗(yàn)，兩種6 批病毒液均滅活完全。具體結(jié)果見表3。

表3 水貂犬瘟熱、細(xì)小病毒腸炎二聯(lián)滅活疫苗半成品制備與檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Preparation and testing results of the semi-finished product test of mink canine distemper and parvovirus enteritis inactivated vaccine

2.4 水貂犬瘟熱、細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)滅活疫苗成品制備與檢驗(yàn)

采用檢驗(yàn)合格的半成品，配制了3 批水貂犬瘟熱、細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)滅活疫苗，經(jīng)性狀、無菌和安全檢驗(yàn)均符合要求，結(jié)果見表4。

表4 水貂犬瘟熱活疫苗、細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)滅活疫苗制備與檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 Preparation and testing results of the mink canine distemper and parvovirus enteritis inactivated vaccine

2.5 水貂犬瘟熱、細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)滅活疫苗效檢結(jié)果

3 批疫苗經(jīng)免疫水貂21 d 后，采血檢測犬瘟熱病毒中和抗體及水貂細(xì)小病毒HI 抗體，結(jié)果見表5。

表5 水貂犬瘟熱、細(xì)小病毒腸炎二聯(lián)滅活疫苗免疫抗體檢測結(jié)果Table 5 Immune antibody results of mink canine distemper and parvovirus enteritis inactivated vaccine

3 批疫苗經(jīng)免疫水貂21 d后，與對照組同時(shí)進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，攻毒后觀察各試驗(yàn)水貂發(fā)病情況，具體結(jié)果見表6。

表6 水貂犬瘟熱、細(xì)小病毒腸炎二聯(lián)滅活疫苗免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of challenged with virulent CDV & MEV strain after immuning by the mink canine distemper and parvovirus enteritis inactivated vaccine

3 結(jié)論與分析

細(xì)小病毒具有進(jìn)化變異迅速、感染譜廣等特點(diǎn)[7]，細(xì)小病毒活疫苗存在變異和跨宿主感染的風(fēng)險(xiǎn)。大量的研究及臨床使用已證明，水貂細(xì)小病毒采用滅活疫苗進(jìn)行免疫具有優(yōu)良的安全性和良好的免疫效果[8]，在我國的養(yǎng)貂業(yè)中水貂細(xì)小病毒滅活疫苗的使用對于防制水貂細(xì)小病毒的暴發(fā)和流行起到重要的作用。為預(yù)防犬瘟熱，最先使用的是滅活疫苗，但在當(dāng)時(shí)傳統(tǒng)的工藝水平條件下，犬瘟熱滅活疫苗的免疫效果不理想，從而逐漸被弱毒疫苗所代替，然而弱毒疫苗不僅對某些動物安全性差，而且毒力不穩(wěn)定，存在變異返祖風(fēng)險(xiǎn)[9,10]。同時(shí)，聯(lián)苗具有使用便捷、“一針多防”等優(yōu)點(diǎn)，因此，本研究采用滅活聯(lián)苗方案，在充分保證安全性的前提下，兼具使用便捷性，為了提高其免疫效果，在保證足量抗原的同時(shí)，采用BEI 進(jìn)行滅活，最大限度保證抗原蛋白的空間構(gòu)象和抗原決定部位可接近性[11,12]，確保了抗原蛋白的免疫原性，在此基礎(chǔ)上，加入經(jīng)長期實(shí)踐證明對水貂具有良好安全性并具備較好免疫增強(qiáng)效果的氫氧化鋁佐劑[13]，來提升該二聯(lián)滅活疫苗的免疫效果。

本研究進(jìn)行了3 批水貂犬瘟熱、細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)滅活疫苗的實(shí)驗(yàn)室試制，對3 批產(chǎn)品生產(chǎn)中的病毒液、半成品及成品進(jìn)行了檢驗(yàn)，結(jié)果表明，3 批產(chǎn)品的各項(xiàng)檢驗(yàn)指標(biāo)符合制訂的標(biāo)準(zhǔn)且工藝穩(wěn)定，可進(jìn)一步放大進(jìn)行中試生產(chǎn)；采用血清抗體測定和免疫攻毒方法對其進(jìn)行效力評價(jià)，結(jié)果顯示，免疫接種21 d，水貂犬瘟熱中和抗體可達(dá)1:51～1:91，水貂細(xì)小病毒HI抗體可達(dá)1:64～1:256，經(jīng)免疫攻毒，可抵抗100 ID50 的犬瘟熱強(qiáng)毒和水貂細(xì)小病毒強(qiáng)毒的攻擊，具有較好的免疫效果，可進(jìn)一步開展臨床試驗(yàn)。