小麥BNS雄性不育基因連鎖群分析和主效QTLs初步定位

楊 靖，衛(wèi) 笑，付慶云，曹銀萍，茹振鋼，李友勇

(河南科技學(xué)院/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南新鄉(xiāng) 453003)

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與播種

BNS不育系由茹振鋼教授提供[1,9]；鄭麥366是河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育的一個(gè)優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋小麥品種，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院矮敗小麥研究中心新鄉(xiāng)基地惠贈(zèng)。自2008年以來(lái)，BNS不育系一直在河南科技學(xué)院輝縣小麥育種基地種植，歷年從10月1日到11月18日分期播種，每8 d 1個(gè)播期，共設(shè)7個(gè)播期，用來(lái)觀察BNS的育性等。作圖群體構(gòu)建的材料，包括父本鄭麥366和母本BNS及其F1和F2，均在同年10月9日播種，此期是BNS的不育播種期[1-5]，也是當(dāng)?shù)匦←湹倪m播期。F1自交產(chǎn)生F2群體種子時(shí)，為了保證不育基因的有效傳遞，人工雜交的F1在當(dāng)年11月18日可育播期播種，植株抽穗后套袋，成熟后收獲套袋穗，選擇典型株穗混合脫粒，即F2種子，F(xiàn)2種子在不育播期播種，產(chǎn)生F2群體。材料田間種植方式：行長(zhǎng)3.5 m，行寬0.3 m，BNS、鄭麥366、F1種植株距12 cm，F(xiàn)2株距15 cm。

1.2 材料取樣和表型調(diào)查

播種出苗后各世代單株依次標(biāo)記，待生長(zhǎng)至4個(gè)以上分蘗時(shí)，取親本和F1各10個(gè)單株的第3、4分蘗葉片，剪1 cm段，混合后取樣2 g；F2全部單株分別取樣，剪1 cm段，混合后取樣2 g。所有樣品液氮冷凍1 min，之后置于-72 ℃保存，備用。

取20株親本和F1標(biāo)記株，F(xiàn)2取所有標(biāo)記單株，主莖和第1、2分蘗抽穗后全部套袋，第1分蘗套袋穗用于調(diào)查花粉可育率，成熟后收取主莖和第2分蘗套袋穗，計(jì)數(shù)小穗數(shù)和結(jié)實(shí)粒數(shù)；自交結(jié)實(shí)率計(jì)算采用國(guó)內(nèi)法，即自交結(jié)實(shí)率=第1、2小花結(jié)實(shí)粒數(shù)/(2×總小穗數(shù))×100%。調(diào)查的麥穗首用主莖穗，備用第2分蘗穗。在標(biāo)記植株第1分蘗始花當(dāng)天，取主莖穗上、中、下3個(gè)部位的小穗各1個(gè)，用卡諾液固定，然后取固定的每個(gè)小穗第1小花的3枚花藥，擠出花粉粒，用I2-KI染色，參照水稻和小麥的計(jì)數(shù)方法[1,3,10]對(duì)完全染為黑色且圓形的可育花粉粒數(shù)和花粉?？倲?shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，每個(gè)片子取3個(gè)視野，共9個(gè)觀察值，計(jì)算平均數(shù)，花粉可育率=可育花粉粒數(shù)/花粉?？倲?shù)×100%。

1.3 DNA的提取及不育、可育池的建立

參考Xing等[7]和孫慧慧等[8]的CTAB法提取幼葉基因組總DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的純度和濃度。

按照BSA建立方法[11]，根據(jù)自交結(jié)實(shí)率和花粉可育率2個(gè)表型調(diào)查結(jié)果，取F2群體中表型值最低單株和最高單株各10株，各自的DNA等量混合，形成自交結(jié)實(shí)率可育池(A1)和不育池(B1)、花粉可育率可育池(A2)和不育池(B2)。

1.4 SSR引物的選擇及檢測(cè)

在R?der等[12]和Somers等[13]構(gòu)建的SSR圖譜上，從染色體的短臂端開始，每1～3 cM 選一個(gè)分子標(biāo)記，首先選擇單擴(kuò)增產(chǎn)物位點(diǎn)標(biāo)記，沒有單擴(kuò)增產(chǎn)物位點(diǎn)標(biāo)記時(shí)選擇二產(chǎn)物位點(diǎn)標(biāo)記。從小麥GrainGenes網(wǎng)站(http://wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/graingenes/browse.cgi?class =marker/)上獲得引物序列，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

參考Xing等[7]和孫慧慧等[8]的方法，使用Biometra Standard Gradient梯度PCR儀進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括超純水18.2 μL，10×Buffer(Mg2+)2.5 μL，dNTP Mix(2.5 mmol·L-1each)2 μL，Taq DNA Polymerase(5 U·μL-1)0.3 μL，模板DNA(50 ng· μL-1)1 μL，上下游引物(10 μmoL·L-1)各0.5 μL。引物Xgwm、Xwmc、Xbarc的反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，45個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；12 ℃保存。引物Xcfd的反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s； 72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min， 12 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，恒壓100 V，電泳50 min。電泳結(jié)束后，用UVItec-FireReader凝膠成像分析儀觀察并 保存。

1.5 遺傳圖譜的構(gòu)建及QTL的定位

用BSA池篩選得到的多態(tài)性標(biāo)記引物對(duì)F2群體各單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR方法同1.4。用Mapmaker/Exp 3.0b[14]軟件計(jì)算連鎖標(biāo)記的遺傳距離，用WinQTLCart 2.5軟件[15]處理各植株的連鎖標(biāo)記基因型和表型數(shù)據(jù)，檢測(cè)QTL位點(diǎn)。

由于SSR標(biāo)記在所屬連鎖群常有多位點(diǎn)和易位現(xiàn)象，為了準(zhǔn)確定位SSR標(biāo)記在BNS的連鎖群，將連鎖標(biāo)記在BNS中重?cái)U(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物由北京優(yōu)博蘭基因技術(shù)有限公司完成測(cè)序，將測(cè)序序列在小麥中國(guó)春參考基因組Chinese Spring RefSeq V2.1[16]中進(jìn)行比對(duì)，定位連鎖標(biāo)記的物理位置，并定位QTLs的相對(duì)位置。用Mapdraw軟件[17]繪制連鎖標(biāo)記和QTL的連鎖圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 F2群體結(jié)實(shí)率調(diào)查結(jié)果

從表1可以看出，不育播期(10-09)播種的BNS和F1的自交結(jié)實(shí)率分別為0.95%和0，均表現(xiàn)為高不育，在可育播期(11-18)播種的BNS和F1的自交結(jié)實(shí)率分別為49.49%和41.23%；而在不育播期和可育播期播種的鄭麥366均可育，11月份播種的結(jié)實(shí)率有所下降，原因可能是后期發(fā)育快，不育小花較多。F2作圖群體共143株，從表2可以看出，F(xiàn)2套袋自交結(jié)實(shí)率和花粉可育率平均值分別為16.33%和23.58%，偏態(tài)分布，均偏向不育性，說(shuō)明該現(xiàn)象是不育顯性所致，但BSA池極端表型與親本一致，結(jié)實(shí)率最低為0，最高同可育親本鄭麥366。

表1 親本及F1在不育和可育播期播種的自交結(jié)實(shí)率Table 1 Self-seed setting rate of parents and F1 generation plotted in sterile and fertile sowing date %

2.2 不育基因連鎖SSR標(biāo)記篩選結(jié)果

在小麥分子標(biāo)記圖譜上選用710對(duì)SSR標(biāo)記引物，分別對(duì)BNS、鄭麥366、F1、A1池、B1池、A2池和B2池進(jìn)行DNA擴(kuò)增，挑選出在親本間和兩對(duì)BSA池間均存在差異且差異表現(xiàn)一致的標(biāo)記(不育基因的連鎖標(biāo)記)，最終篩選出530對(duì)有效擴(kuò)增標(biāo)記引物，其中在BNS和鄭麥366親本間存在110對(duì)多態(tài)性引物，與BNS不育基因連鎖的標(biāo)記引物有12對(duì)，分布在8條染色體上(表3)。部分標(biāo)記的擴(kuò)增電泳圖見圖1，可以看出，這些標(biāo)記對(duì)鄭麥366、BNS和F1的擴(kuò)增圖譜帶型清晰，但個(gè)別標(biāo)記(如Xgwm124和Xwmc795的A池)對(duì)兩個(gè)不育池和可育池的擴(kuò)增圖譜帶型與F1一致，主要原因是主效不育基因有2對(duì)，且具有顯性特征，不育池中可能存在個(gè)別植株其中一個(gè)不育基因位點(diǎn)為純合隱性可育，部分標(biāo)記檢測(cè)顯示的父本帶可能是這些位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物，但不影響母本位點(diǎn)的引物篩選。

表2 F2群體2個(gè)表型BSA池的自交結(jié)實(shí)率和花粉可育率Table 2 Self-seed setting rate and fertile pollen rate in the two phenotypic BSA pools %

表3 親本和BSA池篩選的共分離連鎖SSR分子標(biāo)記Table 3 Co-segregating SSR linkage markers screened from the DNA of parents and BSA pools

2.3 QTL定位分析結(jié)果

用12個(gè)多態(tài)SSR標(biāo)記對(duì)F2群體143個(gè)單株進(jìn)行DNA擴(kuò)增，部分標(biāo)記的擴(kuò)增圖譜見圖2。讀取各連鎖標(biāo)記擴(kuò)增多態(tài)性，在Mapmaker/Exp 3.0b軟件中計(jì)算連鎖標(biāo)記圖距，發(fā)現(xiàn)共有3個(gè)多標(biāo)記群和4個(gè)單標(biāo)記群，第1個(gè)多標(biāo)記群有4個(gè)標(biāo)記，分別為Xbarc267(7B)、Xwmc517(7B)、Xwmc658(2A)和Xwmc617(4A/4B)；第2個(gè)多標(biāo)記群有2個(gè)標(biāo)記，分別為Xwmc795(5A)和Xwmc752(5A)；第3個(gè)多標(biāo)記群有2個(gè)標(biāo)記，分別為Xwmc396(7B)和Xbarc55(1B/2B)。其余4個(gè)標(biāo)記Xcfd5(5B)、Xgwm124(1B)、Xwmc506(7D)和Xwmc332(2B)為單標(biāo)記。從連鎖標(biāo)記 所屬染色體看，2B、5A和7B染色體上的標(biāo)記 較多。

M：DNA Marker；P1：鄭麥366；P2：BNS；F1：BNS×鄭麥366雜交F1；A1：自交結(jié)實(shí)率可育池；B1：自交結(jié)實(shí)率不育池；A2：花粉可育率可育池；B2：花粉可育率不育池。圖2同。

用WinQTLCart 2.5軟件處理連鎖標(biāo)記圖距數(shù)據(jù)，首先，用單標(biāo)記分析法檢測(cè)與不育QTL顯著連鎖的標(biāo)記，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)5個(gè)標(biāo)記與不育QTL顯著連鎖，分別為Xbarc55(1B/2B)、Xwmc332(2B)、Xwmc517(7B)、Xwmc396(7B)和Xwmc752(5A)。然后采用區(qū)間分析法檢測(cè)QTL位點(diǎn)，結(jié)果檢測(cè)到2個(gè)主效不育QTL，分別與單標(biāo)記Xwmc332和第3個(gè)多標(biāo)記群連鎖。

由于連鎖標(biāo)記Xbarc55中有二產(chǎn)物位點(diǎn)標(biāo)記，因此連鎖標(biāo)記的所屬染色體尚不能確定，為了準(zhǔn)確定位連鎖標(biāo)記的連鎖群，將各標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物序列在中國(guó)春基因組中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，Xbarc55位于2B染色體上，其他標(biāo)記的所屬染色體與標(biāo)記來(lái)源圖譜一致。Xbarc55和Xwmc396在Mapmaker/Exp 3.0b檢測(cè)中是連鎖的，可能是二者均連鎖不育QTL所致。將Xbarc55(2B)與單標(biāo)記Xwmc332(2B)連鎖，按SSR圖譜距離進(jìn)行QTL檢測(cè)，結(jié)果檢測(cè)到1個(gè)QTL，與自交結(jié)實(shí)率和花粉可育率均相關(guān)，位置靠近標(biāo)記Xwmc332，且貢獻(xiàn)率較高，達(dá)13.20%，因此是一個(gè)主效不育QTL，命名為qBS1；同樣方法，將Xwmc396(7B)與Xwmc517(7B)連鎖，重新進(jìn)行QTL檢測(cè)，結(jié)果也檢測(cè)到1個(gè)QTL，位于兩個(gè)標(biāo)記之間，距Xwmc396較近，與自交結(jié)實(shí)率和花粉可育率也均相關(guān)，貢獻(xiàn)率高達(dá)19.66%，表明也是主效不育QTL，命名為qBS2。

A～D分別為標(biāo)記Xcfd5、Xwmc506、Xgwm124、Xwmc617的PCR結(jié)果。1～18：F2單株。

2.4 2個(gè)主效QTL的遺傳參數(shù)

從表4可看出，qBS1和qBS2的表型變異解釋率分別為13.20%和19.66%，表明qBS2的遺傳效應(yīng)大于qBS1。2個(gè)主效QTL的顯性效應(yīng)與加性效應(yīng)的絕對(duì)值比值均大于1，表明這2個(gè)QTL的顯性效應(yīng)大于加性效應(yīng)，且均具有顯性效應(yīng)。2個(gè)主效QTL的加性效應(yīng)均為正值，說(shuō)明其加性效應(yīng)來(lái)源于母本BNS。2個(gè)主效QTL及其連鎖標(biāo)記的連鎖圖見圖3。

表4 檢測(cè)到與BNS不育相關(guān)的主效QTLTable 4 Major QTLs detected for BNS sterility

圖3 BNS兩個(gè)主效不育QTL及其SSR連鎖標(biāo)記的連鎖圖

3 討 論

BNS是一個(gè)新型小麥溫敏雄性不育系，低溫不育高溫可育。前期研究初步發(fā)現(xiàn)，該不育系的不育性和育性恢復(fù)是非等位基因遺傳方式，分別含有兩對(duì)主效基因[4]，兩個(gè)育性恢復(fù)基因已初步定位在1B和2B染色體上[7]，而本研究的目的是檢測(cè)不育基因的QTL并初步定位其所在的染色體。利用BNS和它的完全保持系鄭麥366的F2為作圖群體，建立自交結(jié)實(shí)率和花粉可育率2對(duì)BSA表型池，用SSR分子標(biāo)記篩選連鎖標(biāo)記并檢測(cè)QTL，結(jié)果檢測(cè)到2個(gè)主效QTL(qBS1和qBS2)，分別定位在2B和7B染色體上。

3.1 作圖群體

對(duì)雄性不育與非雄性不育性狀QTL定位群體的建立有很大區(qū)別。在雄性不育后代的分離群體中，由于不育個(gè)體不能傳遞后代，因此構(gòu)建重組自交系和近等基因系異常困難，在這種背景下，F(xiàn)2是最佳作圖群體。又由于不育系不結(jié)實(shí)，因此，產(chǎn)生F2群體的F1需在可育播期內(nèi)播種，保證不育等位基因以同等概率傳遞，這是建立平衡基因頻率F2群體的重要保證。本研究中F1是在11月18日播種的，是育性最高恢復(fù)播種期，建立的F2群體國(guó)內(nèi)法平均結(jié)實(shí)率為16.33%，最高結(jié)實(shí)率為 69.68%，說(shuō)明F2育性呈偏態(tài)分布，偏不育性，這種偏態(tài)是不育顯性的結(jié)果，但它不影響連鎖標(biāo)記的篩選，因?yàn)楦呓Y(jié)實(shí)率的單株可以滿足BSA池的建立。F2作圖群體中最高結(jié)實(shí)率為69.68%，屬高結(jié)實(shí)率水平，普通可育小麥品種的國(guó)內(nèi)法自交結(jié)實(shí)率最高也在90%左右。

3.2 2B、5A和7B染色體與不育QTL連鎖群

本研究連鎖標(biāo)記篩選結(jié)果顯示，2B、5A和7B染色體上的連鎖標(biāo)記較多，占總連鎖標(biāo)記數(shù)的70%。在5A染色體上檢測(cè)到1個(gè)QTL，但貢獻(xiàn)率較小，且僅與自交結(jié)實(shí)率相關(guān)，因此認(rèn)為是微效QTL。影響自交結(jié)實(shí)率的因素很多，除花粉育性外，穎殼張開特性、自交親和性等均影響結(jié)實(shí)率，BNS的不育性是由于花粉敗育，因此主效不育QTL必須與花粉育性相關(guān)。本研究在5A染色體上檢測(cè)到2個(gè)連鎖標(biāo)記，其連鎖的QTL雖不是主效的，但遺傳性穩(wěn)定，對(duì)不育性有較大影響，該不育位點(diǎn)及作用尚需繼續(xù)觀察；2B染色體是小麥光溫敏雄性不育基因和恢復(fù)基因的集中載體，如小麥光溫敏雄性不育系BS20[18]、兩極型光溫敏不育系337S[19]的一個(gè)不育基因均定位在2B染色體上，光溫敏D2型小麥雄性不育的質(zhì)核互作型不育基因也與2B染色體相關(guān)[20]。本研究篩選到的連鎖標(biāo)記Xwmc332也位于2B染色體上，擴(kuò)增產(chǎn)物比對(duì)發(fā)現(xiàn)，引物序列高度保守，因此認(rèn)為是一個(gè)緊密連鎖的分子標(biāo)記，其連鎖的QTL為主效QTL；7B染色體是主效不育基因連鎖群，本研究中有2個(gè)連鎖標(biāo)記位于該染色體上，而且前期恢復(fù)基因定位結(jié)果也表明該染色體上含有不育基因[7]。

3.3 QTL與連鎖標(biāo)記的距離

從連鎖標(biāo)記以及QTL初步定位的結(jié)果來(lái)看，標(biāo)記與標(biāo)記之間、標(biāo)記與QTL之間的距離均比較大，但用單標(biāo)記來(lái)檢測(cè)QTL，標(biāo)記與QTL是緊密連鎖的，相關(guān)性達(dá)顯著或極顯著水平。測(cè)定距離較大的原因，主要來(lái)自三個(gè)方面，一是不同時(shí)期、不同遺傳背景下測(cè)定的連鎖圖距可能不同，如Xbarc55和Xwmc332在Somers等[13]的SSR圖譜位置和小麥GrainGenes網(wǎng)站的圖譜位置也不完全相同；二是交換熱點(diǎn)的存在，品種間染色體結(jié)構(gòu)具有多態(tài)性，連鎖圖譜和參考基因組分子圖譜常常存在差異，甚至也有交錯(cuò)差異[21]，如中國(guó)春和BNS雖然都是普通小麥，但在品種演化上兩個(gè)材料經(jīng)歷不同；三是試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算的交換值偏高，高交換值來(lái)自高重組個(gè)體數(shù)，如F2作圖群體中標(biāo)記的分離是一對(duì)位點(diǎn)，但表型的分離則是2對(duì)主基因及微效基因共同作用的結(jié)果，此外雄性不育的發(fā)生過程中，主效基因起決定作用，下游相關(guān)基因級(jí)聯(lián)放大，任一因子異常，均可導(dǎo)致花粉敗育[22]。研究發(fā)現(xiàn)，在BNS中有多個(gè)不育相關(guān)基因(如wtms1[8]、TaAPT2[23]、ATP1[9,24-25]、TA1和TA2[26]、IAA代謝途徑相關(guān)基因[27]、小熱激蛋白基因hsp23.5[28]等)，這些多基因重疊，也可使重組型個(gè)體數(shù)量增加，導(dǎo)致計(jì)算的交換值偏大，然而從BSA池篩選到的QTL單標(biāo)記分析結(jié)果，可以看出標(biāo)記與QTL之間的實(shí)際距離要小得多。

3.4 2個(gè)QTL的遺傳效應(yīng)

前期BNS不育性遺傳學(xué)檢測(cè)顯示，2個(gè)不育基因的作用不等效，但作用累加[4]，本研究定位到的2個(gè)QTL的遺傳效應(yīng)也是不等效的，7B染色體上的qBS2比2B染色體上的qBS1遺傳效應(yīng)高。2個(gè)不育基因的非等效性，在BNS早期系BNY-S中也有反映，其不育率約為80%[8,23]，這可能是高效應(yīng)位點(diǎn)的作用結(jié)果，BNS的完全不育性重組了新的不育基因[8]，推測(cè)新引入的不育基因?yàn)閝BS2。本課題組前期在BNS與典型保持系、典型恢復(fù)系雜交組合中的測(cè)定結(jié)果顯示，高效應(yīng)位點(diǎn)的效應(yīng)量是低效應(yīng)位點(diǎn)的2～3倍[4,7]。BNS與其他小麥品種雜交，F(xiàn)1組合有完全不育、高不育、低不育和完全可育4種類型，這分別對(duì)應(yīng)2對(duì)不育基因、高效應(yīng)不育基因、低效應(yīng)不育基因和不含不育基因的基因型。

4 結(jié) 論

用BNS和鄭麥366的F2為作圖群體，建立自交結(jié)實(shí)率和花粉可育率兩個(gè)表型BSA池，選用分布在小麥21條染色體上的710個(gè)SSR分子標(biāo)記，在BSA池中篩選出12個(gè)連鎖標(biāo)記，共檢測(cè)到2個(gè)主效不育QTL，分別為qBS1和qBS2，其中qBS1位于2B染色體上，緊密連鎖Xwmc332和Xbarc55 分子標(biāo)記；qBS2位于7B染色體上，緊密連鎖Xwmc396和Xwmc517 分子標(biāo)記，qBS2的遺傳效應(yīng)大于qBS1。這些結(jié)果為進(jìn)一步精細(xì)定位不育基因提供連鎖標(biāo)記線索。