滇東南亞熱帶土壤細(xì)菌群落對植被垂直帶變化的響應(yīng)

李聰 ，呂晶花，陸梅*，楊志東，劉攀，任玉連，杜凡

1. 西南林業(yè)大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650224；2. 中國林業(yè)科學(xué)研究院高原林業(yè)研究所，云南 昆明 650233；3. 貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；4. 西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明 650224

土壤微生物作為森林生態(tài)系統(tǒng)中最活躍的生物組分，介導(dǎo)森林土壤碳氮養(yǎng)分的固定、礦化及周轉(zhuǎn)過程，是森林生態(tài)系統(tǒng)能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)的主要調(diào)節(jié)者（鄭勇等，2020）。在森林土壤的三大類微生物（細(xì)菌、放線菌、真菌）中，土壤細(xì)菌占其總量的90%以上，且多樣性十分豐富（Fierer et al.，2012），能夠快速高效地分解與轉(zhuǎn)化營養(yǎng)物質(zhì)（Bardgett et al.，2014），進(jìn)而調(diào)控土壤肥力和植物養(yǎng)分吸收，因此，闡明土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的時(shí)空演變規(guī)律及其形成機(jī)制，不僅是闡明土壤微生物演變和進(jìn)化的關(guān)鍵科學(xué)問題，也是預(yù)測微生物生態(tài)功能及其對環(huán)境變化適應(yīng)和反饋的理論依據(jù)。

研究表明，森林土壤細(xì)菌群落的分布格局易受氣候、植被和土壤等環(huán)境因子沿海拔變化的影響（趙茂強(qiáng)，2020）。海拔升高能夠通過水熱差異引起植被的垂直地帶分異，導(dǎo)致植被多樣性、地上與地下凋落物輸入的顯著改變，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)著土壤理化性質(zhì)的變化，最終影響土壤細(xì)菌群落的底物供應(yīng)情況，引起土壤細(xì)菌群落組成、結(jié)構(gòu)及多樣性的改變（梁艷等，2021）。前人對不同的森林垂直植被帶土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性開展了一定研究，但多集中于溫帶、寒帶的山地森林生態(tài)系統(tǒng)，且表現(xiàn)為無趨勢（Fierer et al.，2011；馮曉川等，2019）、下降（Li et al.，2016；沈開強(qiáng)等，2020）和增加（劉秉儒等，2013）等多種海拔分布格局（劉秉儒，2021）。一些學(xué)者還對土壤細(xì)菌群落的這種垂直變化及其驅(qū)動(dòng)因素開展了定性探討，如朱平等（2015）研究表明，pH通過調(diào)控土壤微生物利用碳源的方式驅(qū)動(dòng)其多樣性的變化；黃萍等（2020）研究發(fā)現(xiàn)土壤氮磷和含水量沿海拔變化對細(xì)菌群落分布的影響顯著。然而，不同氣候帶的海拔、植被、土壤理化變化對細(xì)菌群落影響的性質(zhì)、強(qiáng)度及過程等均存在一定的不確定性，人們對于土壤細(xì)菌群落富氮缺磷的南亞熱帶森林中受哪些因素調(diào)控知之甚少。因此，探明土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性沿海拔變化的梯度效應(yīng)及其調(diào)控機(jī)制，有助于理解“海拔—植被—土壤微生物”之間耦合特征及級聯(lián)效應(yīng)，能為理解南亞熱帶森林土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性、功能過程及調(diào)控機(jī)制提供數(shù)據(jù)支撐。

云南文山國家級自然保護(hù)區(qū)地處南亞熱帶典型季風(fēng)氣候區(qū)，氣候垂直差異顯著，植被類型沿海拔梯度呈現(xiàn)明顯的垂直地帶分異，形成亞熱帶季風(fēng)常綠闊葉林、半濕潤常綠闊葉林、中山濕性常綠闊葉林、苔蘚常綠闊葉林及山頂苔蘚矮林5種典型亞熱帶垂直植被帶景觀（楊宇明等，2008），是研究亞熱帶森林生態(tài)系統(tǒng)土壤細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的理想場地。近年來，該自然保護(hù)區(qū)的研究多集中于動(dòng)物（郭龍潔等，2017）、植物（Zhu et al.，2019；黃樂樂，2015）方面，而有關(guān)不同植被垂直帶土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的研究卻十分缺乏，關(guān)于土壤細(xì)菌多樣性沿不同海拔的分布特征是什么，環(huán)境因子沿植被垂直變化是否會對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性空間分布存在顯著影響，這些問題尚待進(jìn)一步研究。本研究采用Illumina高通量測序技術(shù)測定不同海拔垂直植被帶土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性變化特征，并分析其與環(huán)境因子的關(guān)系，旨在探明保護(hù)區(qū)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性沿植被垂直變化的響應(yīng)規(guī)律及其影響因子，為理解南亞熱帶森林微生物過程及其預(yù)測森林生態(tài)系統(tǒng)系統(tǒng)功能提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

文山國家級自然保護(hù)區(qū)位于北熱帶邊緣、中國南部喀斯特巖溶地區(qū)的西緣，并與橫斷山脈南延地段相毗鄰，鄰跨云南省東南部文山壯族苗族自治州的西疇縣（23°21′—23°24′N，104°41′—104°52′E），屬橫斷山脈的中山山地、溶蝕丘陵地貌，區(qū)內(nèi)最高海拔為1883 m，最低海拔為1200 m（楊宇明等，2008）。地勢北高南低，東南季風(fēng)向內(nèi)縱深時(shí)，水汽逐級攀升使保護(hù)區(qū)氣候垂直差異顯著，年均降水量可由低海拔的1000 mm增至高海拔1400 mm以上，而年均氣溫則與之相反，可由低海拔的 20 ℃以上跌至高海拔的 7—8 ℃，導(dǎo)致不同海拔上地帶性植被差異顯著，沿海拔由低至高形成了季風(fēng)常綠闊葉林、半濕潤常綠闊葉林、中山濕性常綠闊葉林的天然植被垂直分布景觀（楊宇明等，2008）。

1.2 樣地設(shè)置和樣品采集

樣方設(shè)置本研究參照章英才等（2007）《植物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法》，在保證樣地地形、植被及土壤等立地條件基本類似，沿海拔由低到高選取上述3種地帶性植被（亞熱帶季風(fēng)常綠闊葉林（E1）、半濕潤常綠闊葉林（E2）和中山濕性常綠闊葉林（E3））進(jìn)行樣方設(shè)置，在每種垂直植被帶內(nèi)分別隨機(jī)設(shè)置3塊重復(fù)樣地（30 m×30 m），樣地間距大于200 m，共9塊樣地，采用5 m×5 m小樣方對上述每個(gè)30 m×30 m樣地進(jìn)行分割，進(jìn)行植被群落多樣性的調(diào)查，詳細(xì)結(jié)果見表1。

表1 樣地概況Table 1 The basic situation of the sample sites

土樣采集和樣本量 參照國家林草局制定《森林土壤樣品的采集與制備》的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（國家林草局，2000），采用對角線法在上述每個(gè)樣地（30 m×30 m）內(nèi)設(shè)置3個(gè)取樣點(diǎn)，量取地表凋落物厚度后去除，挖掘?qū)?0 cm，深100 cm的土壤剖面。使用地溫計(jì)逐層測量土壤溫度，然后采逐層采集0—50 cm土樣，使用1 mm孔篩去除雜質(zhì)，并采用“四分法”將每塊樣地的 3個(gè)取樣點(diǎn)按土層混合成 5份，9塊樣地共采集混合土樣45份，將采集的每份樣品分成2份，先使用無菌土壤袋收集約20 g過的土壤微生物測序樣品，冷藏微生物箱，并在2天內(nèi)寄送上海凌恩生物科技有限公司檢測；另一份將過篩剩下的樣品約2000 g裝無菌袋，帶回實(shí)驗(yàn)室，用于土壤理化指標(biāo)和自然含水量，其中，約500 g鮮土用于測定土壤自然含水率，約1500 g于室內(nèi)自然風(fēng)干、磨細(xì)過篩，用于測定土壤理化指標(biāo)。特此說明，由于各樣地小地形均為坡地，50 cm以下為母質(zhì)層石礫含量達(dá)到或超過50%，故采集50 cm以上土層土樣。

1.3 土壤理化性質(zhì)測定

參照國家林草局《森林土壤分析方法》的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（國家林草局，2000），采用地溫計(jì)測定土溫、電位法測定pH、105 ℃烘干恒質(zhì)量法測定含水量、環(huán)刀淹水法測定密度、重鉻酸鉀外熱法測定有機(jī)質(zhì)、凱氏定氮法測定全氮、雙酸比色法測定全磷、堿融火焰法測定全鉀。每個(gè)土壤樣品測定3個(gè)重復(fù)，取平均值。

1.4 土壤微生物DNA提取和測序

稱取0.2 g新鮮土樣（采集后置于-4 ℃保存，一周內(nèi)用于DNA提取），裝于50 mL離心管中（每個(gè)土樣重復(fù)3次），參照彭淑嫻等（2017）方法完成細(xì)胞的裂解以及蛋白質(zhì)、脂類以及腐植酸等雜質(zhì)的去除。根據(jù) E.Z.N.A. soil試劑盒說明書進(jìn)行總DNA抽提，利用NanoDrop 2000儀器進(jìn)行DNA濃度和純度的檢測，然后使用體積分?jǐn)?shù)為 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量并進(jìn)行過濾，并用Trans Start Fastpfu DNA PolyE1raE2儀器（20 uL反應(yīng)體系）的 V3—V4區(qū)引物 338F（5’-ACTCCTA CGGGAGGCAGCAG-3’）和（806R-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（Wang et al.，2017），運(yùn)用16SrDNA進(jìn)行擴(kuò)增子進(jìn)行測序。

1.5 土壤細(xì)菌的高通量測序數(shù)據(jù)與統(tǒng)計(jì)分析

經(jīng)過濾處理后，45個(gè)土壤樣本共獲得2063445條優(yōu)質(zhì)序列，優(yōu)化序列的平均長度為412.83 bp，共檢測出91495個(gè)OTU，隨著檢測序列數(shù)目不斷增加，OTU數(shù)量自6000以后開始趨于平緩增長，說明該取樣結(jié)果能較好地滿足實(shí)驗(yàn)分析要求和證明測序的準(zhǔn)確性。利用Mothur軟件（Liu et al.，2012）對細(xì)菌的優(yōu)化序列進(jìn)行 OTU聚類、物種分類和分析細(xì)菌多樣性（Richness、Shannon、Chao、Simpson）。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2013進(jìn)行所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，使用RStudio（1.3.1093）進(jìn)行分析和作圖。采用R語言“l(fā)m”函數(shù)對土壤理化性質(zhì)、細(xì)菌群落組成和多樣性進(jìn)行擬合回歸，結(jié)合“agricolae”包中的“LSD.test”函數(shù)對上述指標(biāo)進(jìn)行多重差異比較，差異值設(shè)為P＜0.05；采用“tidyverse”包的“filter”函數(shù)過濾細(xì)菌平均豐度低于 1%的群落，然后用“vegan”包的“ANOSIM”相似性分析判斷優(yōu)勢細(xì)菌群落差異，并通過去趨勢對應(yīng)分析（DCA）判別環(huán)境因子與土壤細(xì)菌群落組成與多樣性的相關(guān)性分析模型，確定主要關(guān)聯(lián)因子，若排序軸長（Axis lengths）小于3.0即選冗余分析（RDA），若大于4.0選典范對應(yīng)分析（CCA），若在3.0—4.0之間，二者都可；最后結(jié)合“ggcor”包的“mantel”函數(shù)分析各垂直植被帶環(huán)境因子對“細(xì)菌群落和多樣性”總解釋率（r）的百分比，確定各植被帶的主要影響因子。結(jié)合上述結(jié)果，采用“ggplot2”包繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同垂直植被帶土壤理化性質(zhì)的變化特征

由圖1可知，土壤理化性質(zhì)對植被垂直變化呈現(xiàn)不同的響應(yīng)規(guī)律。LSD差異分析表明，土壤密度、溫度、pH在低海拔的亞熱帶季風(fēng)常綠闊葉林（E1）的值顯著高于中海拔半濕潤常綠闊葉林（E2）和高海拔中山濕性常綠闊葉林（E3）（P＜0.05），E1的值分別為E2的1.2、1.4、1.1倍及E3的1.5、2.5、1.2倍（圖 1a、b、d）；土壤含水量、有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀在 E3的含量顯著高于 E2和 E1（P＜0.05），E3的含量分別為E2的1.2、1.5、1.6、3.3、1.2倍及E1的1.5、2.6、2.7、1.7、2.3倍（圖1c、e—h）。各垂直植被帶土壤理化性質(zhì)沿土層深度呈現(xiàn)不同變化規(guī)律（圖1）。LSD差異分析表明，土壤含水量、有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀隨土層加深而顯著減?。≒＜0.05）（圖 1c、圖 1e—h），0—10 cm土層最大，分別是40—50 cm土層的2.1、3.9、3.3、2.7、1.5倍，平均減小2.7倍。土壤密度、溫度、pH值隨土層加深而顯著增加（P＜0.05）（圖1a、b、d），40—50 cm土層最大，分別是0—10 cm土層的1.4、1.1、1.3倍，平均增加1.3倍。

圖1 不同垂直植被帶土壤理化性質(zhì)特征Figure 1 The changes in soil physicochemical properties across different vertical vegetarian zones

2.2 不同垂直植被帶土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化特征

土壤細(xì)菌群落組成沿植被垂直變化呈現(xiàn)不同變化規(guī)律，共有7個(gè)豐度大于1%的優(yōu)勢菌門，分別為酸桿菌門（Acidobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、未分類細(xì)菌（Unclassified）、WPS2菌門和疣微菌門（Verrucomicrobia），采用Anosim對7個(gè)優(yōu)勢菌門進(jìn)行差異檢驗(yàn)分析可知，變形菌門、放線菌門、疣微菌門和WPS-2菌門在垂直植被帶間相對豐度差異顯著（P＜0.05）（圖2a—d）。

圖2 不同垂直植被帶土壤細(xì)菌優(yōu)勢群落Anosim分析Figure 2 The changes of bacterial community across different vertical vegetarian zones (Phylum)

由圖3線性擬合可得，酸桿菌門對植被沿海拔的垂直地帶分異響應(yīng)表現(xiàn)出微弱的減小變化趨勢（r2=0.112，P＞0.05），分別占細(xì)菌物種總數(shù)的42.57%；綠彎菌門（r2=0.155，P＞0.05）和 WPS-2門（r2=0.230，P＜0.05）呈先增后降的變化，分別占9.91%和2.50%；變形菌門（r2=0.557，P＜0.05）、放線菌門（r2=0.639，P＜0.05）呈單線遞增變化，分別占28.8%和4.44%；疣微菌門（r2=0.293，P＜0.05）呈先減后增的變化，其豐富度最少，占2.27%。未分類門水平細(xì)菌的相對豐度依次為 1.27%、3.57%和2.18%，土壤優(yōu)勢細(xì)菌的相對豐度呈先減后增的趨勢（P＜0.05）。

圖3 不同垂直植被帶土壤細(xì)菌群落特征（門水平）Figure 3 Analysis of similarities of soil bacterial dominant communities in different vertical vegetarian zones

各垂直植被帶土壤優(yōu)勢菌門相對豐度沿土層加深變化不同，采用Anosim對7個(gè)優(yōu)勢菌門組間差異檢驗(yàn)分析可得，4個(gè)優(yōu)勢菌門沿土層差異變化顯著（P＜0.05），分別為綠彎菌門（圖 4a）、變形菌門（圖4b）、放線菌門（圖4c）、疣微菌門（圖4d）。

圖4 不同垂直植被帶土壤細(xì)菌優(yōu)勢群落沿土層變化的Anosim分析Figure 4 Anosim analysis of soil bacterial dominant communities along soil layers in different vertical vegetarian zones

由圖5線性擬合可得，E1的酸桿菌門沿土層增加呈先增后減的趨勢（r2=0.461，P＜0.05）（圖5a），變形菌門（r2=0.572）（圖 5b）、疣微菌門（r2=0.309）（圖 5g）呈顯著減小趨勢（P＜0.05），而綠彎菌門（r2=0.425）（圖5c）呈顯著增加趨勢（P＜0.05）；E2的變形菌門（r2=0.679）（圖 5b）、放線菌門（r2=0.873）（圖5d）、WPS-2菌門（r2=0.194）（圖5e）、疣微菌門（r2=0.309）（圖 5g）呈顯著減小趨勢（P＜0.05），而綠彎菌門（r2=0.830）（5c）呈顯著增加趨勢（P＜0.05）（圖 5c）；E3的綠彎菌門（r2=0.925）（圖5c）呈顯著增加趨勢（P＜0.05），而放線菌門（r2=0.369）（圖 5d）、疣微菌門（r2=0.248）（圖 5g）呈顯著減小趨勢（P＜0.05）；整體上，未分類門水平細(xì)菌的相對豐度沿土層加深依次為2.34、1.91、1.95、2.26、3.23（圖 5f），優(yōu)勢細(xì)菌相對豐度沿土層加深呈先增后減的趨勢。

圖5 不同垂直植被帶土壤細(xì)菌群落的土層變化特征（門水平）Figure 5 The profile changes of bacterial community across different vertical vegetarian zones (Phylum)

2.3 不同垂直植被帶土壤細(xì)菌多樣性的變化特征

土壤細(xì)菌多樣性對植被沿海拔上升的垂直地帶分異呈現(xiàn)不同的響應(yīng)變化規(guī)律（圖 6），其中，Richness、Chao、Simpson指數(shù)沿植被垂直帶呈減小趨勢，表現(xiàn)為E1＞E2＞E3，而Shannon指數(shù)呈增加趨勢，表現(xiàn)為E1＜E2＜E3，且Simpson和Shannon指數(shù)在不同垂直植被帶間差異顯著（P＜0.05）。

圖6 不同垂直植被帶土壤細(xì)菌多樣性特征Figure 6 The changes of bacterial diversity across different vertical vegetarian zones

由表2可知，同一植被帶不同土層土壤細(xì)菌多樣性差異顯著。E1的Richness、Chao、Shannon指數(shù)均沿土層加深而減小，10 cm以下較表層降幅明顯（P＜0.05），分別下降 1.60、1.44、1.18倍，Simpson指數(shù)與之相反，增加2.89倍。E2的Richness、Chao指數(shù)沿土層增加先增后減，均在中層（30—40 cm）達(dá)到最大值，Shannon指數(shù)沿土層加深而顯著減?。≒＜0.05），其它層較0—10 cm平均減少1.06倍，Simpson指數(shù)與之相反（P＜0.05），其它層較0—10 cm平均增加2.59倍。E3的Richness、Chao、Shannon指數(shù)沿土層增加先增后減，均在 20—30 cm達(dá)到最大值，較0—10 cm平均增加1.26、1.34、1.02，隨后呈顯著減小趨勢（P＜0.05），較 30—50 cm分別減小1.12、1.11、1.03倍，Simpson指數(shù)沿土層深度增加呈波動(dòng)變化趨勢且差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同植被垂直帶土壤細(xì)菌多樣性的垂直分布特征Table 2 The vertical changes in soil physicochemical properties across different vertical vegetarian zones

2.4 不同垂直植被帶環(huán)境因子對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響

環(huán)境因子與土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性 DCA判別分析如表3所示，不同垂直植被帶土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性4個(gè)排序抽的長度均為第一軸最長且小于2，對細(xì)菌群落和多樣性解釋率分別為47.6%和8.10%，因此選擇單峰模型冗余分析（RDA）分析細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性與環(huán)境因子關(guān)系。

表3 土壤細(xì)菌群落組成-多樣性的DCA判別分析Table 3 Principal component dimension reduction analysis of environmental factors and soil bacterial community composition diversity

冗余分析表明（圖 7），前兩個(gè)坐標(biāo)軸分別解釋了75.86%土壤細(xì)菌群落組成和61.12%多樣性、的變化特征，其中，凋落物厚度、土壤有機(jī)質(zhì)和pH與原點(diǎn)連線較長，能較好地代表植被和土壤因子解釋土壤細(xì)菌群落和多樣性的變化。土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、凋落物厚度、植被Simpson指數(shù)與放線菌門（圖7a）、變形菌門（圖7a）、細(xì)菌Shannon指數(shù)（圖7b）夾角較小且方向一致，表明上述環(huán)境因子與上述菌門及多樣性指數(shù)呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），但與綠彎菌門（圖7a）方向相反且夾角較大，表明上述環(huán)境因子與該菌呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），其中，土壤的有機(jī)質(zhì)、全氮、植物的凋落物厚度與放線菌門、變形菌門、細(xì)菌Shannon指數(shù)夾角最小，呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；全磷與WPS-2菌門、疣微菌門（圖7a）夾角較小且方向一致（圖7a），表明全磷與 WPS-2菌門、疣微菌門呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；pH與綠彎菌門（圖7a）、細(xì)菌Simpson指數(shù)（圖7b）夾角最小且方向一致，密度與二者次之，表明pH與綠彎菌門、細(xì)菌Simpson變化呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），密度則與二者呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

圖7 不同垂直植被帶環(huán)境因子與土壤細(xì)菌群落組成及多樣性的冗余分析Figure 7 Redundancy analysis of environmental factors and bacterial community composition and diversity

為進(jìn)一步研究各垂直植被帶不同環(huán)境因子與土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的耦合關(guān)系，采用 Mantel分析對各垂直植被帶土壤細(xì)菌群落（Acidobacteria、Proteobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria、WPS-2、Unclassified、Verrucomicrobia、Others）、多樣性指數(shù)（Richness、Chao、Shannon、Simpson）和環(huán)境因子之間關(guān)系進(jìn)行1000次排列檢驗(yàn)，最后得出相關(guān)性和解釋值（圖8）。研究發(fā)現(xiàn)，E1土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性耦合因子為植被多樣性及和凋落物厚度（顯著性 Mantel’sP＜0.05，解釋率 Mantel’sr≥25%）（圖8a），其中，植物Shannon、Pielou、Margalef指數(shù)是細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因子（Mantel’sr≥50%），凋落物厚度、和植物Shannon指數(shù)是該海拔植被帶細(xì)菌多樣性的主導(dǎo)因子（Mantel’sr≥50%）；E2土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)耦合因子為除全磷外的其他理化因子（Mantel’sP＜0.05，Mantel’sr≥25%），多樣性的耦合因子為植物Shannon指數(shù)、凋落物厚度及部分理化因子（pH、有機(jī)質(zhì)、全氮）（Mantel’sP＜0.05，Mantel’sr≥25%）（圖 8b），其中，pH、有機(jī)質(zhì)、全氮、凋落物厚度是該植被帶調(diào)控細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的關(guān)鍵因子（Mantel’sr≥50%）；E3土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)耦合因子為凋落物厚度、土壤理化因子（Mantel’sP＜0.05，除全磷外Mantel’sr≥25%），多樣性耦合因子為凋落物厚度、植物 Shannon指數(shù)、除全磷外的其他理化因子（Mantel’sP＜0.05，Mantel’sr≥25%）（圖 8c），其中，土壤密度、pH、有機(jī)質(zhì)、全氮、含水量、凋落物厚度綜合調(diào)控該植被帶細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化（Mantel’sr≥50%），細(xì)菌多樣性主導(dǎo)因子為密度、pH、有機(jī)質(zhì)、全氮（Mantel’sr≥50%）。

圖8 不同垂直植被帶環(huán)境因子與土壤細(xì)菌群落和多樣性的mantel分析Figure 8 Mantel analysis of environmental factors and soil bacterial dominant communities-diversity across different vertical vegetarian zones

整體上，沿植被垂直帶變化，植被對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的解釋率呈減小趨勢（主導(dǎo)因子：從E1的3個(gè)減至1個(gè)），表現(xiàn)為凋落物的調(diào)控作用沿海拔上升越來越強(qiáng)，植被多樣性則越來越弱；土壤理化因子對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的解釋率呈增加趨勢（主導(dǎo)因子：從E1的0個(gè)增至5個(gè)），表現(xiàn)為除全磷外，pH、含水量、有機(jī)質(zhì)、氮、鉀元素沿海拔上升調(diào)控作用越來越強(qiáng)。

3 討論

3.1 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性分布特征對植被垂直變化的響應(yīng)

土壤細(xì)菌在微生物群落中具有個(gè)體微小、較高的豐富度和較強(qiáng)的擴(kuò)散能力（厲桂香等，2018），能敏感響應(yīng)海拔引起的森林植被垂直帶分異以及土壤環(huán)境的改變（李超男等，2017）。本研究發(fā)現(xiàn)，主要優(yōu)勢菌門（酸桿菌門）沿海拔上升呈微弱的減小趨勢（P＞0.05），4個(gè)次優(yōu)勢菌門（變形菌門、放線菌門、疣微菌門、WPS2菌門）的相對豐度在垂直植被帶間差異顯著（P＜0.05），前2個(gè)菌門沿海拔呈單一增加趨勢，后2個(gè)菌門分別呈先增后減和先減后增的趨勢。這與各垂直植被帶水熱條件和微生物營養(yǎng)競爭的差異性有關(guān)（賀婧等，2019；姚蘭等，2019）。酸桿菌為嗜酸、寡營養(yǎng)類群，隨海拔上升降雨對土壤的淋溶作用加強(qiáng)，且地下根系發(fā)達(dá)，所分泌的有機(jī)酸促進(jìn)了酸桿菌的繁殖（王光華等，2016），使得酸桿菌門成為各垂直植被帶的優(yōu)勢類群；但土壤酸桿菌的相對豐度并未隨中高海拔植被帶土壤 pH酸性增強(qiáng)而表現(xiàn)出顯著增加的趨勢，這與該海拔段土壤養(yǎng)分增加的環(huán)境不利于酸桿菌這類寡營養(yǎng)細(xì)菌的生長有關(guān)（王光華等，2016），這種“pH促養(yǎng)分抑”的影響，使得酸桿菌在不同植被垂直帶整體趨勢變化不明顯，形成較為穩(wěn)定的生態(tài)位（Navarrete et al.，2013），對環(huán)境的適應(yīng)性高于變形菌，成為該保護(hù)區(qū)最大的細(xì)菌類群。變形菌、放線菌為喜營養(yǎng)類型（Jiang et al.，2021），對養(yǎng)分依賴程度高，文山保護(hù)區(qū)地處南亞熱帶，豐富的水熱條件，為凋落物腐解創(chuàng)造了良好條件，豐富的土壤有機(jī)質(zhì)為變形菌等喜營養(yǎng)類群提供了大量底物，促進(jìn)其豐度沿海拔增加。疣微菌門、WPS-2菌門在土壤細(xì)菌群落組成中占據(jù)非常狹窄的環(huán)境生態(tài)位（群落占比4.77%），扮演稀少菌落的角色，相較于酸桿菌和變形菌（群落共占比＞65%），二者對碳氮主要養(yǎng)分的競爭能力非常有限且需求量少（Zhao et al.，2022），為維持自身群落機(jī)制和養(yǎng)分平衡，其營養(yǎng)關(guān)系更傾向于對微量元素（磷）獲取。

沿土壤剖面的垂直變化，細(xì)菌優(yōu)勢類群的豐度整體上呈隨土層加深而先增后減的趨勢，且各層分布差異顯著（P＜0.05）。變形菌門和放線菌門在表層（0—10 cm），、酸桿菌門在中層（10—30 cm）、綠彎菌門在底層（40—50 cm）均富集明顯的。3個(gè)植被帶相鄰?fù)翆娱g溫差相對較小，細(xì)菌活性和數(shù)量在垂直分布上受土溫的限制較弱，表層土壤的枯枝落葉分解較多，腐殖層厚，獲得養(yǎng)分含量較高（吳昊等，2019），適合對養(yǎng)分需求量大的富營養(yǎng)細(xì)菌群落（變形菌門、放線菌門）聚集和繁殖；中層土壤養(yǎng)分環(huán)境為寡營養(yǎng)酸桿菌提供了良好的生存環(huán)境，成為主要優(yōu)勢菌落的聚集區(qū)域；深層土壤的水、氣、熱較表層和中層的環(huán)境條件差，可與地面交換物質(zhì)能力對土壤密度的增加越來越弱，是厭氧、寡營養(yǎng)的綠彎菌門良好的聚集層。因此，土壤微生物特性會因土層的肥力和水熱條件差異產(chǎn)生不同的聚集和分布格局，寡營養(yǎng)細(xì)菌對土壤中下層適應(yīng)能力較強(qiáng)，而富營養(yǎng)細(xì)菌則多聚集在土壤表層（嚴(yán)令斌，2020）。

3.2 土壤細(xì)菌多樣性對植被垂直變化的響應(yīng)

森林植被沿海拔高度變化易引起凋落物和土壤理化特性的變化，進(jìn)而引起土壤細(xì)菌多樣性的梯度響應(yīng)（吳夢瑤等，2021）。本研究中，高海拔的中山濕性常綠闊葉林細(xì)菌Shannon多樣性高于其他2個(gè)植被帶，這與張丹丹等（2018）研究結(jié)果相似。但也一些研究表明，土壤微生物物種多樣性隨著海拔的升高而顯著降低（段益莉等，2019）或無變化（張地等，2012）。與其它地區(qū)植被垂直分異變化相比，文山自然保護(hù)區(qū)土壤碳氮養(yǎng)分沿海拔呈增加的趨勢，高海拔中山濕性常綠闊葉林豐富的凋落物及土壤養(yǎng)分為細(xì)菌群落發(fā)展提供了充足的底物，從而增加了細(xì)菌群落多樣性（侯萌等，2020）。

在森林生態(tài)系統(tǒng)中，由于水分、養(yǎng)分、通氣、溫度、pH值等因子在土壤剖面上存在差異，導(dǎo)致土壤細(xì)菌多樣性也存在不同程度的差別（Qin et al.，2021）。一般而言，表層土壤養(yǎng)分富集，與地上水熱交換頻繁，是微生物獲養(yǎng)和生存的理想地（任玉連等，2019）。文山保護(hù)區(qū)各海拔帶土壤養(yǎng)分均表現(xiàn)出明顯的表層富集性，即表層應(yīng)為多樣性的富集層，但有趣的是，除低海拔亞熱帶季風(fēng)常綠闊葉林土壤細(xì)菌多樣性對這一剖面變化規(guī)律響應(yīng)外，中高海拔半濕潤常綠闊葉林和中山濕性常綠闊葉林土壤細(xì)菌并沒有因養(yǎng)分逐層減小出現(xiàn)多樣性降低的同步趨勢，這與樣地的微氣候?qū)ν翆訙貪穸日{(diào)控有關(guān)。降雨量沿海拔增加使中高海拔植被帶形成“溫降水增”的土壤環(huán)境，導(dǎo)致微生物活性降低，為土壤凋落物蓄積、腐解及養(yǎng)分輸入的增加創(chuàng)造了良好條件（張騰升，2019），相較于表層“強(qiáng)淋溶、低溫”和底層“通氣差、養(yǎng)分低”的土壤環(huán)境相比，土壤中層保溫適肥的小環(huán)境更容易被細(xì)菌群落接受，進(jìn)而中高海拔垂直植被帶土壤細(xì)菌多樣性沿土層呈現(xiàn)“中間高-上下低”的分布格局。綜上，土壤養(yǎng)分的增加并不是微生物多樣性唯一的決定因子，適宜的水熱條件和養(yǎng)分的環(huán)境才能較好地維持微生物多樣性。

3.3 環(huán)境因子沿植被帶垂直變化對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響

海拔作為重要的山地因子，能夠引起森林群落垂直演替，改變地上植被多樣性及凋落物量，進(jìn)而調(diào)控土壤理化性質(zhì)變化，引起土壤細(xì)菌群落構(gòu)建和多樣性的梯度響應(yīng)（韓冬雪等，2015）。本研究發(fā)現(xiàn)，植被多樣性對優(yōu)勢細(xì)菌群落及多樣性的主控作用沿海拔上升逐漸被凋落物厚度所削弱。這與劉秉儒等（2013）研究相似，但與胡華英等（2021）發(fā)現(xiàn)的植被多樣性促進(jìn)土壤微生物多樣性的研究不同。這與研究地植被群落的垂直差異變化有關(guān)，與低海拔亞熱帶季風(fēng)常綠闊葉林的灌叢、小喬木群落相比，高海拔中山濕性常綠闊葉林的喬木群落根系發(fā)達(dá)、落葉量大、固肥能力強(qiáng)，為土壤細(xì)菌保證了充足的底物，削弱了植物多樣性減小對細(xì)菌群落的不利影響，促進(jìn)共營養(yǎng)類群變形菌門、放線菌門和多樣性的增加。

土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性對土壤理化環(huán)境具有明顯的選擇性，它們受土壤水熱條件、密度、pH和養(yǎng)分狀況等諸多因素的共同調(diào)控。土壤有機(jī)質(zhì)是土壤養(yǎng)分的主要來源，有機(jī)質(zhì)礦質(zhì)化過程中釋放的氮、磷、鉀等養(yǎng)分元素可供微生物吸收和利用（侯貽菊等，2019）。本研究中，土壤碳、氮等養(yǎng)分含量沿海拔上升對土壤優(yōu)勢群落豐度和多樣性的正效應(yīng)顯著，成為中高海拔植被帶土壤細(xì)菌群落和多樣性的主控因子，尤其對土壤放線菌門、變形菌門等共營養(yǎng)菌群產(chǎn)生了極顯著影響。土壤pH的高低決定了整個(gè)生態(tài)大環(huán)境中元素地質(zhì)小循環(huán)反應(yīng)體系的酸堿性，深刻影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性（陸梅，2018）。密度決定了土壤孔隙度和持水率，調(diào)控土壤細(xì)菌各類群數(shù)量增長及群落多樣性（孫佳等，2020）。本研究還發(fā)現(xiàn)，土壤 pH、密度、溫度沿海拔減小對土壤優(yōu)勢群落豐度和多樣性的負(fù)效應(yīng)顯著。文山保護(hù)區(qū)砂巖發(fā)育典型，降水豐富，淋溶作用強(qiáng)，土壤pH整體較低（楊宇明等，2008），適合嗜酸寡營養(yǎng)菌（酸桿菌）的生長（王光華等，2016），同時(shí)還受養(yǎng)分因子抑制調(diào)節(jié)，導(dǎo)致該菌門沿植被垂直變化不明顯，土壤密度沿海拔的減小變化增加土壤孔隙和外界交換面積，抑制了厭氣寡營養(yǎng)菌疣微菌的繁殖，而中高海拔垂直植被帶土壤結(jié)構(gòu)因密度減小得到改善，土壤儲養(yǎng)能力增強(qiáng)，削弱酸性的不利影響，促進(jìn)土壤細(xì)菌豐富度和共營養(yǎng)類群的相對豐度。

4 結(jié)論

文山國家級自然保護(hù)區(qū)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性對植被沿海拔的垂直變化產(chǎn)生不同程度的響應(yīng)。其中，土壤優(yōu)勢細(xì)菌的相對豐度呈先減后增的趨勢（P＜0.05）；不同優(yōu)勢細(xì)菌群落的相對豐度在土壤各層富集程度差異顯著（P＜0.05），變形菌和放線菌集中分布于表層（0—10 cm），酸桿菌主要于中層（10—30 cm）富集，綠彎菌在底層（40—50 cm）富集；土壤細(xì)菌多樣性沿植被垂直變化呈顯著的增加趨勢（P＜0.05），并在中山濕性常綠闊葉林達(dá)到最大值，沿土層變化表現(xiàn)為減小的趨勢。

在植被沿海拔的垂直變化過程中，保護(hù)區(qū)的植被多樣性、凋落物、土壤水熱條件、緊實(shí)度、酸堿度及養(yǎng)分狀況（有機(jī)質(zhì)、氮、磷、鉀）等性質(zhì)發(fā)生了顯著改變（P＜0.05），并對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的分布格局產(chǎn)生了顯著影響（P＜0.05），關(guān)鍵調(diào)控因子為土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、pH、植被的Shannon指數(shù)、凋落物厚度，調(diào)控關(guān)系沿海拔上升由植被多樣性（亞熱帶季風(fēng)常綠闊葉林）主導(dǎo)的負(fù)向影響轉(zhuǎn)變?yōu)楹俊⑻嫉瑞B(yǎng)分元素（中山濕性常綠闊葉林）主導(dǎo)的正向影響。