原發(fā)性干燥綜合征患者唇腺組織中BTB/POZ結(jié)構(gòu)域蛋白7及基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)與自身抗體的關(guān)系

王 菲, 時美紅

(揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科, 江蘇 揚(yáng)州, 225100)

原發(fā)性干燥綜合征(pSS)是慢性炎癥性自身免疫性疾病干燥綜合征(SS)的一種類型，不合并其他自身免疫性疾病，在結(jié)締組織疾病中占比較高，并由淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，會導(dǎo)致患者唾液腺、淚腺等外分泌腺體功能減退或喪失，表現(xiàn)出口干、眼干等干燥癥狀，但其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，可能與遺傳、感染、內(nèi)分泌等因素有關(guān)[1-3]。研究[4]報道，抗干燥綜合征抗原A(SSA)抗體、抗干燥綜合征抗原B(SSB)抗體、抗核抗體(ANA)是pSS最常見的自身抗體，其存在是診斷pSS的主要依據(jù)之一，與pSS病情顯著相關(guān)。

BTB/POZ結(jié)構(gòu)域蛋白7(BTBD7)是近年來新發(fā)現(xiàn)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)控的關(guān)鍵因子，能夠降低上皮鈣黏素(E-cadherin)表達(dá)，進(jìn)而破壞細(xì)胞間的黏附關(guān)系，促進(jìn)惡性腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移[5-6]。有研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用，其異常升高會造成細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜組織損傷，破壞細(xì)胞間的黏附關(guān)系，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞浸潤侵襲性增強(qiáng)。目前研究[9]發(fā)現(xiàn)MMP-9在pSS中存在異常表達(dá)，但BTBD7在pSS中的表達(dá)情況尚缺乏研究。本研究檢測pSS患者唇腺組織中BTBD7、MMP-9表達(dá)水平，并分析二者與pSS患者自身抗體ANA、抗SSA抗體、抗SSB抗體的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年9月—2020年10月在本院首次診斷為pSS的46例患者唇腺組織為pSS組，其中女44例，男2例，年齡27～76歲，平均(51.36±8.74)歲，均已發(fā)生唇腺淋巴細(xì)胞浸潤，尚未接受治療。另選取同期懷疑為pSS但最后排除診斷的46例口干燥癥患者的唇腺組織為對照組，其中女45例，男1例，年齡31～80歲，平均(52.44±9.35)歲。2組患者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 具有可比性。所有組織樣本離體后立刻用生理鹽水清洗、液氮速凍，然后置于-70 ℃低溫冰箱中長期保存。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 符合2016年美國風(fēng)濕病學(xué)會/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟制定的pSS分類標(biāo)準(zhǔn)者[10]; ② 本研究方案經(jīng)本院倫理委員會審核通過后實(shí)施; ③ 所有受試者均知曉此次診治方案，并自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 合并高血壓、糖尿病、丙型肝炎、結(jié)節(jié)病、器官功能異常及其他自身免疫性疾病者; ② 有頭頸部放療史者; ③ 處于妊娠期、哺乳期者; ④ 中途退出研究者。

1.2 主要試劑與儀器

TRIzol試劑、SYBR Green PCR master mix(貨號: 15596026、4312704)購自美國Invitrogen; 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號: 205111)購自德國QIAGEN; RIPA裂解液(貨號: 28192)購自加拿大Norgen Biotek; BCA試劑盒(貨號: 701780-480)購自美國Cayman; 兔抗人一抗BTBD7抗體、MMP-9抗體、GAPDH抗體，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(貨號: ab154685、ab38898、ab245355、ab6271)購自abcam公司; ANA檢測試劑盒(貨號: H300L)購自美國SCIMEDX; 抗核抗體譜(IgG)檢測試劑盒(貨號: DL 1590-1601-1 G)購自歐蒙醫(yī)學(xué)診斷(中國)有限公司; ECL試劑盒(貨號: AS16-ECL-SN)購自瑞典Agrisera。熒光定量PCR儀(型號: ABI 7500)購自美國Applied Biosystems; 凝膠成像系統(tǒng)(型號: MG8000)購自美國Thmorgan; 熒光顯微鏡(型號: 80i)購自尼康公司; 免疫印跡儀(型號: EURO Blot MasterⅡ)購自歐蒙公司。

1.3 唇腺組織中BTBD7、MMP-9的mRNA及蛋白表達(dá)水平檢測

將2組的唇腺組織從冰箱中取出，在冰上解凍，分為2份。先取1份樣本，加Trizol勻漿，提取總RNA, 測定RNA純度、濃度合格后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒在PCR儀上合成cDNA，參照SYBR Green PCR master mix配制反應(yīng)體系后，在熒光定量PCR儀上擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法表示BTBD7mRNA、MMP-9mRNA水平，其中Ct值為擴(kuò)增產(chǎn)物熒光信號達(dá)臨界閾值時的循環(huán)數(shù), △Ct=Ct待測基因-Ct內(nèi)參基因, △△Ct=△Ct測試組織中待測基因-△Ct對照組織中待測基因。引物序列: ①BTBD7上游為5′-CTGAGCCACTGACAGGAGAGG-3′, 下游為5′-GATCCAGCAGCCTCTTTTCATCC-3′; ②MMP-9上游為5′-ATCCAAGGCCAATCCTACT-3′, 下游為5′-CGTCGAGTCAGCTCGGGT-3′;③GAPDH上游為5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′, 下游為5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

再另取1份樣本，加入含1 mmol/L蛋白酶抑制劑PMSF的預(yù)冷RIPA裂解液，將組織研磨勻漿、充分裂解, 12 000×g離心5 min, 分離上清液(即總蛋白)，用BCA試劑盒對總蛋白進(jìn)行定量。各樣本取總蛋白40 μg, 加入上樣緩沖液，用沸水煮沸5 min, 將總蛋白充分變性，進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳將目的蛋白分離，然后將目的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上; 在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h, 按比例加入一抗稀釋液(BTBD7抗體、MMP-9抗體、GAPDH抗體，均為1∶1 000稀釋)在4 ℃下孵育過夜，PBS洗滌3次，加入二抗稀釋液(HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體, 1∶1 500稀釋)室溫下孵育1 h, PBS洗滌3次，加入ECL顯色液顯色，凝膠成像儀下觀察、掃描圖像。采用Image J軟件測定各條帶的灰度值，將目的蛋白與GAPDH灰度值的比值作為目的蛋白表達(dá)量。

1.4 自身抗體指標(biāo)

收集所有pSS患者的檢驗(yàn)科原始數(shù)據(jù)，記錄并整理血清自身抗體ANA、抗SSA抗體、抗SSB抗體的數(shù)據(jù)，其中ANA檢測采用間接免疫熒光法，具體操作嚴(yán)格按照ANA檢測試劑盒、熒光顯微鏡操作步驟執(zhí)行，抗SSA抗體、抗SSB抗體檢測采用線性免疫印跡法，具體操作嚴(yán)格按照IgG檢測試劑盒、免疫印跡儀操作步驟執(zhí)行。根據(jù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果將46例pSS患者分為抗SSA抗體陰性22例與抗SSA抗體陽性24例，抗SSB抗體陰性34例與抗SSB抗體陽性12例，以及ANA陰性4例與ANA陽性42例。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料均呈正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，組間比較行t檢驗(yàn); 采用Pearson相關(guān)分析法分析pSS患者唇腺組織中BTBD7蛋白表達(dá)水平與MMP-9 蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組患者唇腺組織中BTBD7、MMP-9的mRNA及蛋白表達(dá)水平比較

與對照組相比, pSS組患者唇腺組織中BTBD7、MMP-9的mRNA及蛋白表達(dá)水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見表1。

表1 2組患者唇腺組織中BTBD7、MMP-9的mRNA及蛋白表達(dá)水平比較

2.2 pSS患者唇腺組織中BTBD7、MMP-9的mRNA及蛋白表達(dá)水平與血清自身抗體的關(guān)系

在pSS患者的抗SSA抗體、抗SSB抗體以及ANA的檢測結(jié)果中，各抗體陽性者唇腺組織中BTBD7、MMP-9的mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于陰性者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見表2。

表2 不同血清自身抗體結(jié)果的pSS患者唇腺組織中BTBD7、MMP-9的mRNA及蛋白表達(dá)水平比較

2.3 pSS患者唇腺組織中BTBD7蛋白表達(dá)水平與MMP-9 蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示, pSS患者唇腺組織中BTBD7蛋白表達(dá)水平與MMP-9蛋白表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(r=0.493,P<0.05)。見圖1。

3 討 論

研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，SS發(fā)病是因機(jī)體自身免疫過度應(yīng)答而引起外分泌腺存在大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤，致使腺體細(xì)胞被大量破壞，表現(xiàn)出口干、眼干、發(fā)熱、乏力等一系列臨床癥狀[13]。SS可分為pSS和繼發(fā)性SS, 其中pSS不合并其他自身免疫性疾病，而繼發(fā)性SS則會同時表現(xiàn)出SS及其他疾病的癥狀[14]。pSS主要侵犯唇腺和淚腺，病理性變化為大量淋巴細(xì)胞浸潤、組織間質(zhì)纖維化及腺體組織萎縮等，臨床表現(xiàn)為口唇干燥、口渴、難以進(jìn)食干硬食物、舌體干裂等，嚴(yán)重影響患者的身體健康[15-17]。

BTBD7基因定位于染色體14q32.12區(qū)域，約有1 233 bp, 能引導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生“分支形態(tài)”改變過程，是近年來新發(fā)現(xiàn)的癌基因，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化方面具有重要功能[18]。CHEN B等[5]研究顯示，BTBD7可促進(jìn)前列腺癌的增殖、侵襲及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，加速腫瘤進(jìn)展。杜望磊等[19]研究表明, E-cadherin在pSS患者唇腺組織中呈異常低表達(dá)，其表達(dá)情況與病理等級相關(guān)，參與pSS發(fā)病機(jī)制，推測BTBD7可能通過影響E-cadherin表達(dá)在pSS發(fā)病中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示, pSS患者唇腺組織中BTBD7mRNA及BTBD7蛋白表達(dá)水平較口干燥癥患者顯著升高，提示BTBD7參與pSS發(fā)生過程。由于E-cadherin能夠阻止淋巴細(xì)胞的侵襲，推測BTBD7可能在pSS發(fā)病過程中發(fā)揮調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的作用，能增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的侵襲性，促進(jìn)淋巴細(xì)胞浸潤發(fā)生。pSS自身抗體ANA、抗SSA抗體、抗SSB抗體可反映pSS病情，其陽性結(jié)果對pSS具有較高的診斷價值。本研究結(jié)果顯示，抗SSA抗體陽性、抗SSB抗體陽性以及ANA陽性的pSS患者唇腺組織中BTBD7蛋白表達(dá)水平較上述抗體陰性者顯著升高，提示BTBD7表達(dá)與pSS患者血清ANA、抗SSA抗體、抗SSB抗體水平關(guān)系密切，可反映pSS病情。

pSS發(fā)病伴隨大量淋巴細(xì)胞浸潤，而細(xì)胞的浸潤過程與細(xì)胞間的黏附關(guān)系有密切聯(lián)系。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，其主要作用是降解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜，打破細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移、浸潤的天然組織屏障，促進(jìn)細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、浸潤過程[20]。杜望磊等[19]研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9在pSS患者唇腺組織中高表達(dá)，與病理等級相關(guān)，可能參與pSS的致病過程。AOTA K等[21]研究發(fā)現(xiàn), MMP-9在pSS患者唇唾液腺中表達(dá)上調(diào)，可調(diào)節(jié)CXC基序趨化因子10表達(dá)及活性，有望成為pSS的新型療法。SHAH N R等[22]研究也表明, MMP-9在pSS患者唇唾液腺中的mRNA及蛋白水平均顯著上調(diào)。本研究結(jié)果顯示, pSS患者唇腺組織中MMP-9mRNA及MMP-9蛋白表達(dá)水平較口干燥癥患者顯著升高，提示MMP-9參與pSS的發(fā)生過程; 進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn), ANA陽性、抗SSA抗體陽性以及抗SSB抗體陽性的pSS患者唇腺組織中MMP-9蛋白表達(dá)水平均顯著高于對應(yīng)抗體陰性患者，提示MMP-9可影響pSS患者自身免疫狀況。本研究相關(guān)性分析結(jié)果表明, pSS患者唇腺組織中BTBD7蛋白水平與MMP-9蛋白水平呈正相關(guān)，表明二者可能共同影響pSS患者的自身免疫狀況。

綜上所述, pSS患者唇腺組織中BTBD7、MMP-9均呈高表達(dá)，且與自身抗體的抗SSA抗體、抗SSB抗體、ANA表達(dá)密切相關(guān)，可能共同影響患者自身免疫狀況。