蛋白酪氨酸激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3信號(hào)通路在局灶節(jié)段性腎小球硬化小鼠模型中的機(jī)制研究

顧鳳娟, 徐子斌, 許云鵬, 張燕子, 李麗香, 隋曉露,鄒杰鋒, 曾啟城, 謝婷妃, 陳繼紅

(1. 廣東省深圳市寶安區(qū)石巖人民醫(yī)院 腎內(nèi)科, 廣東 深圳, 518000;2. 南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳寶安醫(yī)院 腎內(nèi)科, 廣東 深圳, 518000)

局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)是導(dǎo)致終末期腎病(ESRD)的主要原因之一[1]。足細(xì)胞損傷是FSGS發(fā)生及發(fā)展的核心病理環(huán)節(jié)[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，采用傳統(tǒng)的5/6腎切除術(shù)模型建立FSGS模型的穩(wěn)定性較差，很難建立典型的FSGS病理類型。構(gòu)建成模率高且具備更典型FSGS病理改變的動(dòng)物模型將有利于探討足細(xì)胞損傷導(dǎo)致FSGS疾病進(jìn)展的致病機(jī)制。蛋白酪氨酸激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(JAK2/STAT3)信號(hào)通路介導(dǎo)多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞的共同途徑，活化相應(yīng)靶基因，參與機(jī)體免疫反應(yīng)、血管細(xì)胞遷移增殖和細(xì)胞凋亡等，并廣泛參與糖尿病腎病、狼瘡性腎炎等腎臟病的發(fā)生與發(fā)展，但在影響FSGS進(jìn)展的機(jī)制研究中仍有待深入探討。本研究針對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行精準(zhǔn)化的5/6腎切除術(shù)，建立典型FSGS病理改變小鼠模型，探討JAK2/STAT3信號(hào)通路影響FSGS進(jìn)展的可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料

選取6周齡雄性C57BL/6小鼠(購(gòu)自北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司)60只，基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為FSGS組(n=30)和對(duì)照組(n=30)。FSGS組小鼠在開腹后接受精準(zhǔn)化5/6腎切除術(shù)，建立FSGS小鼠模型; 對(duì)照組為假手術(shù)組，僅暴露雙側(cè)腎臟，剝離腎周脂肪組織，而后復(fù)位縫合。本研究通過醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(實(shí)驗(yàn)編號(hào): 2022-600)。

1.2 模型建立

1.2.1 FSGS組: 建立精準(zhǔn)化5/6腎切除模型。通過直接減少腎單位建立FSGS模型，需排除腎盂所占體積，小鼠腎盂體積約占腎臟總體積的15.75%[4]。假設(shè)切除體積為y, 列方程(1-y-15.75%)/(1-15.75%)=1/3, 解出y=56%, 即切除左腎腎盂外2/3的腎組織，需分別切除離左腎上極及下極28%的腎臟總體積。腎臟總體積計(jì)算采用橢球公式[5], 即V=A×B×C×4/3π; 結(jié)合橢球缺體積公式[6], 即V=[π×A×B×(d+C)2][3-(d+C)/C]/3C;A、B、C分別為1/2寬、1/2厚、1/2長(zhǎng),d為1/2長(zhǎng)減去單極切除的長(zhǎng)度。假設(shè)d=xC, 即(1-28%)A×B×C×4/3π=[π×A×B×(xC+C)2][3-(xC+C)/C]/3C, 最終解出x=35%, 即分別在離左腎上極和下極35%最大長(zhǎng)徑處進(jìn)行切除，可切除左腎各約1/3的體積。

1.2.2 對(duì)照組: 對(duì)照組為假手術(shù)組，僅暴露雙側(cè)腎臟，剝離腎周脂肪組織后復(fù)位縫合。

1.2.3 術(shù)后重癥加強(qiáng)護(hù)理病房護(hù)理: 室溫25 ℃, 濕度55%, 術(shù)后連續(xù)3 d注射青霉素以預(yù)防感染。

1.2.4 建模成功標(biāo)準(zhǔn): 小鼠24 h尿蛋白定量>100 mg, 蘇木精-伊紅(HE)染色顯示FSGS典型病理改變，判定造模成功。

1.3 觀察指標(biāo)

術(shù)前和處死前1 d, 代謝籠收集并記錄小鼠24 h尿量。頸靜脈采血1 mL備用。術(shù)后10周處死小鼠，留取腎組織備用。

1.3.1 生化指標(biāo): 應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)24 h尿蛋白、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)。

1.3.2 腎組織病理學(xué): 留取腎組織，采用10%福爾馬林固定，脫水、石蠟包埋、切片，HE染色觀察腎組織病理學(xué)改變情況。

1.3.3 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)腎組織JAK2mRNA、STAT3mRNA的表達(dá): 取約100 mg腎臟皮質(zhì)組織，充分研磨，使用Trizol提取總RNA, 使用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 引物設(shè)計(jì)見表1。采用RT-qPCR儀(美國(guó)ABI), 并按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng): 95 ℃預(yù)變性15 min, 95 ℃變性10 s, 60 ℃退火延伸30 s, 72 ℃延伸30 s, 共45個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT方法，以GAPDH作為內(nèi)參照，計(jì)算JAK2mRNA、STAT3mRNA的表達(dá)量。

表1 JAK2、STAT3的引物序列

1.3.4 采用Western Blot檢測(cè)腎組織磷酸化酪氨酸激酶2(p-JAK2)、JAK2、磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(p-STAT3)、STAT3的蛋白表達(dá): 取腎臟皮質(zhì)組織約100 mg, 加入蛋白質(zhì)裂解液提取組織蛋白, 100 ℃水浴變性5 min, 上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉2 h, 加入稀釋的一抗(p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、內(nèi)參抗體濃度為1∶1 000, 美國(guó)CST)4 ℃孵育過夜，二抗(濃度1∶10 000, 美國(guó)CST)室溫孵育2 h。采用電泳凝膠成像儀進(jìn)行顯色，采用Image J軟件，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參灰度值的比值計(jì)算p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)白細(xì)胞介素-6(IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)水平: 取約100 mg的新鮮腎臟樣本，置于勻漿器內(nèi)充分研磨, 4 ℃下以5 000轉(zhuǎn)/min離心5 min, 取上清，按ELISA試劑盒方法檢測(cè)各組IL-6、MCP-1、α-SMA、TGF-β1水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 2組小鼠生化指標(biāo)水平比較

與同組術(shù)前及對(duì)照組術(shù)后10周相比, FSGS組術(shù)后10周的24 h尿蛋白、Scr、BUN水平較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 FSGS組與對(duì)照組術(shù)前及術(shù)后10周的生化指標(biāo)水平比較

2.2 2組小鼠腎組織的病理學(xué)變化比較

HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰、完整，腎小管和腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，無(wú)明顯損傷。與對(duì)照組相比, FSGS組小鼠HE染色可見系膜區(qū)基質(zhì)增生，大量腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死、脫落或空泡樣變性，腎間質(zhì)可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小囊腔擴(kuò)張，腎小球代償性肥大及局灶性硬化，系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)增生，節(jié)段加重，毛細(xì)血管袢受壓狹窄，局部消失。見圖1。

2.3 2組小鼠造模結(jié)果

造模過程中, FSGS組有1只小鼠死于麻醉，予以排除。FSGS組其余29只小鼠在造模過程中死亡3只，死亡率為10.3%; 對(duì)照組小鼠在造模過程中死亡1只，死亡率為3.3%。

2.4 2組小鼠腎組織JAK2 mRNA、STAT3 mRNA的表達(dá)水平比較

術(shù)后10周, FSGS組小鼠腎組織JAK2mRNA、STAT3mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

2.5 2組小鼠腎組織p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達(dá)水平比較

術(shù)后10周, FSGS組小鼠腎組織p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖3、圖4。

2.6 2組小鼠腎組織IL-6、MCP-1、α-SMA、TGF-β1水平比較

術(shù)后10周, FSGS組小鼠腎組織IL-6、MCP-1、α-SMA、TGF-β1水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖5。

3 討 論

FSGS是常見的原發(fā)性腎小球疾病，病變呈進(jìn)行性進(jìn)展，最終可發(fā)展為ESRD。FSGS的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與遺傳因素、足細(xì)胞損傷、血流動(dòng)力學(xué)改變、循環(huán)因子、細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)[7]。足細(xì)胞損傷是FSGS發(fā)生及發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，當(dāng)各種因素導(dǎo)致的足細(xì)胞損傷比率超過殘存足細(xì)胞代償能力時(shí)，最終會(huì)出現(xiàn)腎小球硬化，導(dǎo)致FSGS的發(fā)生。FSGS腎病模型有傳統(tǒng)5/6腎切除模型、阿霉素模型[8]、白喉毒素模型等。傳統(tǒng)5/6腎切除術(shù)模型是較為常用的腎病模型，缺點(diǎn)是對(duì)手術(shù)操作要求較高，手術(shù)切除的體積差異對(duì)模型穩(wěn)定性影響較大[9]。本研究在傳統(tǒng)腎切除術(shù)基礎(chǔ)上，利用數(shù)學(xué)公式達(dá)成精準(zhǔn)化切除，成功建立5/6腎切除術(shù)模型。該模型可精準(zhǔn)測(cè)量腎臟長(zhǎng)度及確定切除的位置，偏差較小，模型穩(wěn)定性好，成功率高[10]。

JAK2/STAT3信號(hào)通路可被多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子如干擾素-γ(IFN-γ)、IL-6、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等激活，參與免疫、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖、分化和凋亡等[11]。白蛋白、糖基化終產(chǎn)物、高糖等可激活體外培養(yǎng)的近端腎小管上皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞JAK/STAT信號(hào)通路，引起腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化和纖維連接蛋白合成增加，參與FSGS的發(fā)生與發(fā)展[12]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比, FSGS組腎組織JAK2/STAT3信號(hào)通路中JAK2mRNA、STAT3mRNA和p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達(dá)水平均升高，提示JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活參與了FSGS的發(fā)生與發(fā)展。研究[13]顯示, JAK2抑制劑AG490可阻斷JAK/STAT信號(hào)通路，減輕小鼠阿霉素腎病蛋白尿、腎小球硬化、腎小管損傷、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)并抑制腎臟纖維化，延緩FSGS的發(fā)展。足細(xì)胞中STAT3的過度激活與腎小球疾病有關(guān)，其下調(diào)可抑制成纖維細(xì)胞活化，減輕由腎毒性血清、艾滋病相關(guān)性腎病和糖尿病腎病引起的腎小球疾病，通過抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路可延緩FSGS的發(fā)展[14]。

JAK2/STAT3信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)、纖維化反應(yīng)密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示, FSGS組小鼠腎組織JAK2/STAT3信號(hào)通路下游炎癥因子及纖維化因子IL-6、MCP-1、α-SMA、TGF-β1水平升高，提示JAK2/STAT3信號(hào)通路活化并通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)、腎組織纖維化參與了FSGS的發(fā)生及發(fā)展過程。分析其作用機(jī)制為: ① JAK2/STAT3信號(hào)通路激活, IL-6表達(dá)水平明顯升高, IL-6是JAK2/STAT3信號(hào)通路的誘導(dǎo)劑，與細(xì)胞膜IL-6受體結(jié)合能誘導(dǎo)JAK2/STAT3信號(hào)通路活化，以正反饋的形式促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞損傷，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化形成[15-16]。② JAK/STAT信號(hào)通路可將IL-6、腫瘤壞死因子等多種炎癥因子信號(hào)傳遞至巨噬細(xì)胞，刺激細(xì)胞表面受體發(fā)生免疫應(yīng)答，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。巨噬細(xì)胞活化后分泌多種炎癥因子，包括MCP-1等，誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化和凋亡[17], 加劇FSGS發(fā)展。③ STAT3抑制劑干預(yù)后可誘導(dǎo)α-SMA(+)的肌成纖維細(xì)胞凋亡，并抑制腎間質(zhì)中α-SMA、纖維連接蛋白及Ⅰ型膠原的表達(dá)，減輕細(xì)胞外基質(zhì)沉積[18]。TGF-β1可促使足細(xì)胞損傷、凋亡及腎小球硬化，導(dǎo)致腎臟纖維化。JAK2/STAT3信號(hào)通路活化可能通過增加α-SMA、TGF-β1的表達(dá)而導(dǎo)致腎小球細(xì)胞外基質(zhì)沉積、腎小球基底膜增厚以及足細(xì)胞數(shù)量減少[19], 引起腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，參與FSGS的發(fā)生及發(fā)展[20]。

綜上所述，本研究通過精準(zhǔn)化5/6腎切除術(shù)成功建立小鼠FSGS模型，而JAK2/STAT3信號(hào)通路活化可通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)、腎組織纖維化等多種途徑參與FSGS的發(fā)生及發(fā)展過程。