EZH2基因敲除對(duì)局灶節(jié)段性腎小球硬化小鼠足細(xì)胞損傷和JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響

劉衛(wèi)英, 隋曉露, 張燕子, 陳繼紅

(廣東省深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院 腎內(nèi)科, 廣東 深圳, 518000)

局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)是原發(fā)性腎小球腎炎的常見(jiàn)類型，最終可進(jìn)展為終末期腎病[1]。FSGS病因復(fù)雜，足細(xì)胞損傷是其發(fā)病的核心病理環(huán)節(jié)[2]。研究[3]證實(shí)，表觀遺傳修飾參與足細(xì)胞損傷的過(guò)程。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2可催化組蛋白H3K27發(fā)生三甲基化，使組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化(H3K27me3)水平上調(diào)，抑制炎性基因表達(dá)，減輕組織炎性反應(yīng)，延緩腎小球疾病的進(jìn)展[4]。研究[5-6]發(fā)現(xiàn), JAK2/STAT3信號(hào)通路可促進(jìn)炎癥因子表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)足細(xì)胞凋亡，加重腎臟疾病進(jìn)展。本研究建立EZH2基因敲除FSGS小鼠模型并觀察其腎臟足細(xì)胞病理改變和JAK2、STAT3蛋白表達(dá)水平變化，探討EZH2基因敲除對(duì)FSGS小鼠腎臟足細(xì)胞損傷和JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Cas9小鼠60只, 6周齡，雌雄各半，體質(zhì)量20～25 g, 購(gòu)自南京模式公司。將小鼠于恒溫環(huán)境下標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為EZH2敲除組和EZH2未敲除組，每組30只。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

重組腺病毒(AAV9-sgRNA-EZH2), 購(gòu)自上海和元公司; nephrin抗體、podocin抗體，購(gòu)自Proteintech公司; TUNEL試劑盒，購(gòu)自Roche公司。

1.3 小鼠模型構(gòu)建

① 小鼠腎臟EZH2基因敲除及未敲除對(duì)照: 使小鼠仰臥于操作臺(tái)，麻醉小鼠。左腹部剃毛，于小鼠左腹部消毒后做縱切口，暴露左腎及左腎蒂，游離腎靜脈。將注射針刺入左腎靜脈近端,EZH2敲除組小鼠注入AAV9-sgRNA-EZH2, 病毒載量2×1011/mL,EZH2未敲除組小鼠注入磷酸鹽緩沖液(PBS)。拔針后移去顯微止血夾，壓迫止血，逐層縫合，培養(yǎng)30 d。② FSGS小鼠模型構(gòu)建: 消毒小鼠尾靜脈后給予阿霉素(25 mg/kg)尾靜脈注射。7 d后留取尿樣，監(jiān)測(cè)24 h尿蛋白定量，若24 h尿蛋白定量>100 mg, 提示EZH2敲除FSGS模型或EZH2未敲除FSGS模型構(gòu)建成功。收集24 h尿液、血漿后處死小鼠，摘取雙側(cè)腎臟，取適量腎臟組織觀察其病理學(xué)改變，將剩余腎臟組織于-80 ℃凍存。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 生化指標(biāo): 收集小鼠24 h尿液、血漿，檢測(cè)2組小鼠24 h尿蛋白定量和血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平。

1.4.2 腎臟組織形態(tài)學(xué): ① 用10%甲醛固定腎組織后脫水、包埋、切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，于光鏡下觀察腎組織。② 去掉腎皮質(zhì)，將腎組織剪成1 mm3大小組織塊，用固定液快速固定，脫水、滲透、包埋、切片后鈾鉛雙染色，于透射電鏡下觀察腎小球基底膜、足細(xì)胞。

1.4.3 足細(xì)胞nephrin和podocin表達(dá)情況: 將腎組織切片、烤片、脫蠟、熱修復(fù)后用山羊血清封閉，滴入nephrin抗體和podocin抗體，適溫孵育過(guò)夜, PBS洗滌后滴加二抗，避光適溫孵育，洗滌后4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復(fù)染細(xì)胞核，加入自發(fā)熒光淬滅劑，封片，采用激光共聚焦技術(shù)觀察。

1.4.4 TUNEL法檢測(cè)足細(xì)胞凋亡情況: 將腎組織石蠟包埋、切片、脫蠟、水洗，先后滴加蛋白酶K及破膜工作液，取TUNEL試劑覆蓋組織，血清孵育，切片置入雙氧水溶液，避光孵育15 min, 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，脫水封片，光鏡下觀察。

1.4.5 免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)腎臟JAK2、STAT3蛋白表達(dá)水平: 取適量腎組織，加入蛋白質(zhì)裂解液裂解 30 min后，提取組織蛋白，采用Western Blot法檢測(cè)2組小鼠腎臟JAK2、STAT3蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 生化指標(biāo)水平

與EZH2未敲除組FSGS小鼠比較，EZH2敲除組FSGS小鼠24 h尿蛋白定量、BUN、Cr水平更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01); 2組ALT、AST水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組FSGS小鼠生化指標(biāo)水平比較

2.2 腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

2.2.1 光鏡: HE染色結(jié)果顯示,EZH2未敲除組病變呈局灶、分段分布，腎小球足細(xì)胞肥大，胞漿空泡樣變性，無(wú)腎小管結(jié)構(gòu)病理改變;EZH2敲除組可見(jiàn)腎小球病變加重，節(jié)段性系膜基質(zhì)明顯增多，且伴團(tuán)塊狀物質(zhì)沉積，毛細(xì)血管部分閉塞，可見(jiàn)球囊粘連，小管萎縮。見(jiàn)圖1。

2.2.2 電鏡:EZH2未敲除組腎小球基底膜增厚，足突排列相對(duì)整齊，足突增寬、偶有融合;EZH2敲除組腎小球足突排列紊亂，足突明顯增寬、廣泛融合甚至消失，基底膜塌陷。見(jiàn)圖2。

2.3 足細(xì)胞nephrin和podocin表達(dá)

nephrin和podocin陽(yáng)性表達(dá)分別顯示為綠光和紅光，與EZH2未敲除組相比,EZH2敲除組nephrin、podocin表達(dá)減少，見(jiàn)圖3。

2.4 足細(xì)胞凋亡情況

EZH2敲除組足細(xì)胞凋亡指數(shù)為(40.94±2.13)%, 高于EZH2未敲除組的(21.23±3.30)%, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 見(jiàn)圖4。

2.5 足細(xì)胞JAK2蛋白、STAT3蛋白表達(dá)

與EZH2未敲除組相比,EZH2敲除組JAK2、STAT3蛋白表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖5、表2。

表2 2組FSGS小鼠足細(xì)胞JAK2、STAT3蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

阿霉素腎病小鼠模型的病理改變與人類FSGS病變最接近，目前己成為經(jīng)典的FSGS動(dòng)物模型[7]。足細(xì)胞損傷是導(dǎo)致蛋白尿和腎功能惡化的病理生理基礎(chǔ)[8]。足細(xì)胞基底膜脫落不僅能引起蛋白尿，也是發(fā)生FSGS的啟動(dòng)因素[2]。nephrin是足細(xì)胞裂孔膜上重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，起著調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架及足細(xì)胞凋亡等作用。podocin是足細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)必需蛋白，可促進(jìn)nephrin的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。nephrin和podocin在維持足細(xì)胞裂孔膜的正常功能及足突的完整性方面起著關(guān)鍵性作用。

表觀遺傳學(xué)是指非基因序列改變所致基因表達(dá)水平的變化，主要包括DNA甲基化、組蛋白甲基化、組蛋白乙酰化等多種調(diào)控方式[9]。EZH2最早在腫瘤細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，是多梳抑制復(fù)合體2中的催化亞基，在基因沉默和轉(zhuǎn)錄抑制中起重要作用[10]。EZH2主要通過(guò)羧基末端SET結(jié)構(gòu)域催化H3K27me3, 調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄水平、下游炎癥因子表達(dá)水平并激活相關(guān)信號(hào)通路[11]。研究[12]發(fā)現(xiàn),EZH2低表達(dá)可引起H3K27me3水平下調(diào)，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子配對(duì)核基因6和硫氧還蛋白互作蛋白的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷和增高氧化應(yīng)激水平，提示組蛋白 H3K27me3表達(dá)水平參與足細(xì)胞損傷過(guò)程。

JAK2/STAT3信號(hào)通路主要參與機(jī)體炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞凋亡，代謝產(chǎn)物激活信號(hào)通路后，引起炎癥因子高表達(dá)，促進(jìn)足細(xì)胞凋亡，在慢性腎臟病病程進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[5]。JAK2是酪氨酸蛋白激酶，通過(guò)結(jié)合受體介導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞信號(hào)傳遞。STAT3是DNA結(jié)合蛋白，與酪氨酸肽段結(jié)合后形成二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核與靶基因特定位點(diǎn)結(jié)合，激活基因轉(zhuǎn)錄[13]。體內(nèi)磷酸化STAT3表達(dá)水平上調(diào)使得EZH2活性增強(qiáng)、組蛋白H3K27me3表達(dá)水平上升，抑制抑癌基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，提示EZH2可能參與JAK2/STAT3信號(hào)通路的調(diào)控，影響細(xì)胞分化、凋亡過(guò)程。

本研究結(jié)果顯示，與EZH2未敲除組FSGS小鼠相比,EZH2敲除組FSGS小鼠的腎小球、足細(xì)胞病理改變更明顯，且尿蛋白定量、BUN、Cr水平升高，足細(xì)胞nephrin、podocin表達(dá)水平下降，腎臟JAK2、STAT3蛋白表達(dá)水平增高，足細(xì)胞凋亡指數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。由此提示,EZH2敲除后JAK2/STAT3信號(hào)通路蛋白表達(dá)上調(diào)，加重足細(xì)胞損傷,EZH2可能參與JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活過(guò)程。這可能是因?yàn)镋ZH2敲除減弱了對(duì)靶基因的抑制作用，促進(jìn)JAK2酪氨酸磷酸化，同時(shí)磷酸化JAK2催化受體酪氨酸發(fā)生磷酸化修飾形成停泊位點(diǎn)，促進(jìn)STAT3蛋白募集。磷酸化修飾后的STAT3蛋白進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與促纖維化蛋白基因結(jié)合，造成細(xì)胞外基質(zhì)增多，促進(jìn)足細(xì)胞損傷[14]。研究[12]報(bào)道，抑制糖尿病腎病模型大鼠體內(nèi)EZH2水平，可加重蛋白尿和足細(xì)胞病變，與本研究結(jié)果相似。體外研究[15]證實(shí)，給予足細(xì)胞EZH2抑制劑，可通過(guò)組蛋白甲基化增強(qiáng)JAK2/STAT3信號(hào)通路，加重足細(xì)胞損傷。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建EZH2敲除FSGS模型后發(fā)現(xiàn),EZH2敲除后JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白JAK2、STAT3表達(dá)增加，足細(xì)胞nephrin、podocin表達(dá)水平顯著下降，足細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增加，提示EZH2可能參與JAK2/STAT3信號(hào)通路的調(diào)控并影響FSGS的進(jìn)展。但EZH2基因敲除促進(jìn)阿霉素誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的潛在發(fā)病機(jī)制仍不明確，后續(xù)研究需進(jìn)一步深入探討。