接種微生物對(duì)采礦伴生黏土中植物生長(zhǎng)的影響

黃劍威，宋子恒，畢銀麗，3，楊惠惠，張延旭

（1.國(guó)能寶日希勒能源有限公司，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021000；2.中國(guó)礦業(yè)大學(xué)（北京） 煤炭資源與安全開采國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；3 西安科技大學(xué) 西部礦山生態(tài)環(huán)境修復(fù)研究院，陜西 西安 710054）

0 引 言

中國(guó)東部草原處于“三屏四帶”生態(tài)格局北部區(qū)域，在保障中國(guó)北方生態(tài)安全具有重要作用，煤炭資源豐富，區(qū)域大規(guī)模露天開采對(duì)生態(tài)環(huán)境造成干擾和損傷，嚴(yán)重威脅當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)安全，亟需復(fù)墾修復(fù)[1]。由于草原礦區(qū)土層瘠薄，在復(fù)墾覆土?xí)r表土虧缺，無法滿足復(fù)墾需要，急需開發(fā)表土替代基質(zhì)。通常復(fù)墾工程中就地取材利用或改造排棄巖土剝離物、廢棄物等作為表土替代材料是一種相對(duì)經(jīng)濟(jì)可行的方案。寶日希勒礦區(qū)在采礦剝離過程中有一層16～20 m厚的采礦伴生黏土，賦存量大且具有較豐富的營(yíng)養(yǎng)，是一種較好的潛在替代材料。但是由于其物理結(jié)構(gòu)性差、粘性強(qiáng)、微生物活性低等原因，不利于植物生長(zhǎng)。為滿足復(fù)墾需求，前期有研究通過沙黏土配比添加等手段，取得了一定效果[2-3]。如何通過更為簡(jiǎn)便的方法對(duì)伴生黏土進(jìn)行直接利用改善土壤、促進(jìn)植物生長(zhǎng)，微生物修復(fù)技術(shù)為礦區(qū)復(fù)墾工作提供了新的動(dòng)力和工具。近年來微生物技術(shù)因其綠色、高效、低成本、可持續(xù)等特點(diǎn)逐漸成為礦區(qū)修復(fù)研究熱點(diǎn)。土壤中有益微生物如解磷細(xì)菌，針對(duì)土壤磷虧缺特點(diǎn)，可幫助植物將不溶性磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷，在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中有著廣泛的應(yīng)用；叢枝菌根真菌在生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)中起著關(guān)鍵作用，有利于植物對(duì)不同環(huán)境脅迫的抗性[4-5]。目前關(guān)于解磷菌和叢枝菌根的研究相關(guān)研究成果不盡一致。解磷菌、叢枝菌根真菌可有效促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增加土壤微生物活性和磷元素的轉(zhuǎn)化率，但解磷菌僅在一定條件下發(fā)揮作用[6-7]。目前研究主要針對(duì)常規(guī)農(nóng)田土壤或一般土質(zhì)，缺少采礦伴生高黏性土壤基質(zhì)條件下叢枝菌根真菌、解磷細(xì)菌等對(duì)植物生長(zhǎng)、土壤酶活性影響研究。結(jié)合寶日希勒礦區(qū)采礦伴生黏土特性，通過盆栽試驗(yàn)，選擇適于礦區(qū)種植、可作為露天排土場(chǎng)復(fù)墾區(qū)經(jīng)濟(jì)作物玉米為供試植物，以采礦伴生黏土為基質(zhì)，研究伴生黏土基質(zhì)接種解磷菌和叢枝菌根對(duì)植物生長(zhǎng)和土壤性質(zhì)的影響，研究可為露天采礦伴生黏土復(fù)墾和微生物改良提供技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

露天礦采礦伴生黏土取自內(nèi)蒙古呼倫貝爾草原的寶日希勒露天煤礦，土壤基礎(chǔ)性狀見表1。將黏土風(fēng)干、粉碎，過2 mm篩。土樣經(jīng)高溫高壓蒸汽滅菌（121 ℃，2 h），風(fēng)干后，將土均勻放置于試驗(yàn)塑料盆（上口徑21 cm、下內(nèi)徑14 cm、盆高20 cm），每盆5 kg。種植玉米品種為品糯28，試驗(yàn)使用的叢枝菌根真菌菌種為摩西管柄囊霉（Funneliformismosseae，BGC XJ01），菌劑由含侵染根段、孢子和沙土混合物組成。所用解磷細(xì)菌為斯式泛菌（Pantoeastewartii），由中國(guó)礦業(yè)大學(xué)（北京）微生物復(fù)墾實(shí)驗(yàn)室從寧夏粉煤灰樣品自主分離并純化培養(yǎng)，將菌株活化后添加入相應(yīng)處理。

表1 黏土土壤性狀

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在中國(guó)礦業(yè)大學(xué)（北京）微生物復(fù)墾實(shí)驗(yàn)室人工溫室內(nèi)進(jìn)行。設(shè)計(jì)4種微生物接種處理：Funneliformismosseae（AMF）、Pantoeastewartii（PSB）、Funneliformismosseae+Pantoeastewartii（AMF+PSB）、CK。溫室內(nèi)日間空氣溫度維持35 ℃左右，空氣相對(duì)濕度為70%～80%。栽種前土壤澆水至最大持水量，水分自然平衡24 h。挑選顆粒飽滿的玉米種子，用10% H2O2溶液浸泡10 min消毒，置于恒溫箱內(nèi)25 ℃催芽24 h后播種于盆中，埋深3～5 cm，每穴3株。栽種時(shí)AMF處理于玉米根部加入50 g菌劑，PSB處理每盆加入20 mL活化解磷細(xì)菌溶液，未接種AMF的處理加入50 g滅活的AMF菌劑，未接種PSB處理加入20 mL滅活解磷細(xì)菌培養(yǎng)液。播種后將裝置放于溫室內(nèi)培養(yǎng)，采用自然光照。待玉米三葉一心期后間苗，每盆保留1株。

1.3 樣品的采集與處理

試驗(yàn)期間每隔5 d稱重，補(bǔ)足土壤含水量，記錄每次玉米澆水日期及澆水量。試驗(yàn)進(jìn)行60 d后收獲。收獲前測(cè)定玉米株高、葉片SPAD值和光合速率，每株玉米葉片隨機(jī)選擇3個(gè)點(diǎn)作為葉片SPAD和光合速率的一次重復(fù)值。收獲時(shí)分別取玉米地上部分和地下根系，留少許植物根系洗凈后用于測(cè)定根系侵染率，其余地上、地下部分烘干測(cè)干重，同時(shí)輕輕抖動(dòng)并收集附著在根系上的土壤用于測(cè)定土壤團(tuán)聚體。

1.4 測(cè)試項(xiàng)目及方法

1.4.1 侵染率和菌絲密度

采用PHILLIPS和HAYMAN的方法測(cè)定侵染率，顯微鏡下觀察侵染根段數(shù)，依據(jù)被侵染根段數(shù)占觀察根段數(shù)比值計(jì)算菌根侵染率[8]。菌絲密度采用真空泵微孔濾膜抽濾-網(wǎng)格交叉法測(cè)定[9]。

1.4.2 球囊霉素相關(guān)土壤蛋白

球囊霉素相關(guān)土壤蛋白的提取方法參照WRIGHT的方法[10]，分為總球囊霉素（Total Glomalin，T-GRSP）和易提取球囊霉素（Easily Extractable Glomalin，EE-GRSP）進(jìn)行提取。

1.4.3 菌根貢獻(xiàn)率

Rm=（Mm-Mck）/Mck×100%

（1）

式中Rf為微生物貢獻(xiàn)率；Mm為微生物處理植株生物量；Mck對(duì)照處理植株生物量。

1.4.4 植物生長(zhǎng)指標(biāo)

在玉米葉片隨機(jī)選取6個(gè)點(diǎn)用 SPAD-502 Plus（Konica公司，日本）測(cè)定葉片SPAD值，取平均值。將植物地上和地下部分分別收獲后，進(jìn)行烘干稱重，測(cè)定植物生物量。

1.4.5 植物中的磷元素含量

收集玉米地上、地下部分烘干磨碎，過孔徑為0.25 mm篩，消煮后利用ICP-AES（電感耦合等離子發(fā)射光譜儀）測(cè)定[11]。

1.4.6 脲酶、磷酸酶活性

土壤脲酶測(cè)定采用改進(jìn)的苯酚-次氯酸鈉比色法，采用改進(jìn)的TABATABAI和BREMNER的方法測(cè)定土壤磷酸酶活性[12]。

1.5數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS 19.0（IBM公司，美國(guó)）軟件和EXCEL 2016（Microsoft公司，美國(guó)）軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因子方差分析方法對(duì)植物生長(zhǎng)狀態(tài)、菌根相關(guān)指標(biāo)和土壤酶活性數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，顯著性水平為α=0.05。同一組微生物處理內(nèi)數(shù)據(jù)采用雙因素統(tǒng)計(jì)分析；考慮不同微生物處理因素，采用雙因素統(tǒng)計(jì)進(jìn)行顯著性分析；采用Pearson相關(guān)性分析對(duì)土壤因子、植物因子、微生物因子之間關(guān)系進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種微生物對(duì)植物生長(zhǎng)的影響

2.1.1 對(duì)侵染率、菌絲密度和植株生物量的影響

菌根侵染率是反映菌根真菌侵染宿主植物根系程度的指標(biāo)。接種叢枝菌根真菌處理侵染率達(dá)到80%，添加PSB處理對(duì)侵染率無顯著影響（表2）。菌絲密度可體現(xiàn)叢枝菌根真菌與植物的共生狀態(tài)，PSB處理和CK處理中未發(fā)現(xiàn)菌絲，AMF處理和AMF+PSB處理中菌絲密度分別為1.54 m/g和1.52 m/g，表明在黏土中解磷細(xì)菌對(duì)叢枝菌根真菌無顯著影響。與CK對(duì)照相比，AMF處理、AMF+PSB處理、PSB處理地上生物量分別提高11.9%,11.4%,0.04%，地下生物量分別提高34.3%,32.8%,1.4%。單接AMF處理和聯(lián)合接種AMF+PSB處理能夠顯著促進(jìn)玉米生長(zhǎng)發(fā)育，而接種PSB對(duì)玉米的影響并不明顯，表明在黏土中單獨(dú)接種解磷菌未能有效增加植物生物量。

表2 植株的侵染率、菌絲密度和生物量

2.1.2 對(duì)植物SPAD值、株高和光合影響

對(duì)黏土中的玉米接種叢枝菌根真菌，可以有效增加葉片SPAD值和凈光合速率。AMF和AMF+PSB的處理中，葉片SPAD值顯著高于PSB處理和CK處理，其中AMF處理SPAD值是PSB的1.16倍，是CK的1.26倍，接種解磷菌雖提高了葉片的SPAD值，但與CK處理差異不顯著。凈光合速率方面，AMF處理和AMF+PSB處理間差異不顯著，PSB處理雖然高于CK處理，差異也不顯著。AMF處理凈光合速率比PSB處理提高了22.4%，較CK處理提高了27.4%。接種PSB對(duì)葉片SPAD值和凈光合速率無顯著影響，而接種AMF可顯著影響葉片SPAD值和凈光合速率，AMF+PSB處理植物葉片的反應(yīng)與單接AMF處理均無顯著差異。AMF處理和AMF+PSB處理可顯著增加玉米的株高，較CK分別提高20.17%，20.99%。接種PSB的處理中植物株高比CK處理增加了4.6%，差異不顯著，AMF+PSB處理與AMF處理株高差異不顯著，但二者均顯著高于PSB處理和CK處理（表3）。

2.1.3 對(duì)植株養(yǎng)分含量的影響

AMF處理、AMF+PSB處理有效提高了植株磷吸收量，植株地上部分、地下部分及總吸收量均顯著高于PSB和CK處理，PSB處理略高于CK，但差異不顯著（表4）。同時(shí)AMF處理和AMF+PSB處理玉米地上部分磷濃度高于PSB和CK處理，達(dá)到顯著差異；AMF和AMF+PSB處理地下部分磷濃度高于PSB和CK處理，差異不顯著。總體而言，接種AMF處理和AMF+PSB處理中微生物對(duì)磷元素吸收的貢獻(xiàn)率分別為16.9%和18.4%，PSB處理微生物貢獻(xiàn)率僅為0.6%，這可能是由于黏土黏粒含量多，微生物、養(yǎng)分遷移能力差，叢枝菌根真菌可以通過菌絲來吸收更遠(yuǎn)處的養(yǎng)分，而解磷細(xì)菌則難以發(fā)揮作用，分解養(yǎng)分也難以被植物吸收[13]。

表3 植物的SPAD值、凈光合速率和株高

2.1.4 對(duì)植物根系發(fā)育的影響

接種AMF處理顯著增加了根尖數(shù)、總根長(zhǎng)、根表面積、根體積，分別為PSB處理的1.3倍、1.66倍、1.49倍和1.71倍，為CK處理的1.28倍、1.67倍、1.53倍和1.87倍（表5）。AMF和AMF+PSB處理差異不顯著，2組處理顯著高于PSB處理和CK處理，表明叢枝菌根促進(jìn)了根系發(fā)育，這可能由于菌根真菌可在黏土中生長(zhǎng)，促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)發(fā)育[14]。

2.2 對(duì)土壤酶活性、球囊霉素、團(tuán)聚體的影響

AMF處理和AMF+PSB處理中土壤脲酶含量顯著高于CK處理和PSB處理，其中AMF處理是CK處理的1.35倍，是PSB處理的1.36倍（表6）。PSB處理、AMF處理和AMF+PSB處理磷酸酶活性均高于CK處理，但是差異不顯著，表明在激活土壤磷酸酶的活性上解磷細(xì)菌和叢枝菌根真菌能夠起到一定作用[15]，但在純黏土狀態(tài)下效果有限。同時(shí)由表6可知，接種叢枝菌根真菌的處理T-GRSP和EE-GRSP及水穩(wěn)性團(tuán)聚體都顯著高于無叢枝菌根真菌的處理，表明黏土環(huán)境下叢枝菌根在土壤改良方面可發(fā)揮一定積極作用。

表4 植物磷元素濃度和吸收量

表5 不同微生物處理對(duì)植物根系發(fā)育影響

表6 接種微生物對(duì)土壤酶活性和土壤團(tuán)聚體的影響

2.3 相關(guān)性分析

對(duì)不同處理下土壤微生物特性、玉米生長(zhǎng)和土壤酶活性之間進(jìn)行相關(guān)性分析表明（表7），侵染率和菌絲密度與玉米的株高、生物量、磷累積量等生長(zhǎng)指標(biāo)和脲酶、T-GRSP，EE-GRSP，土壤團(tuán)聚體等土壤指標(biāo)有顯著相關(guān)性，與土壤磷酸酶活性沒有顯著相關(guān)性。玉米的生物量與叢枝菌根的微生物特性和脲酶、T-GRSP，EE-GRSP,土壤團(tuán)聚體等存在顯著相關(guān)關(guān)系，磷酸酶對(duì)玉米的生物量和磷的累積無顯著影響。菌絲密度和侵染率顯著影響玉米對(duì)磷元素的積累，同時(shí)T-GRSP和EE-GRSP也顯著影響了玉米對(duì)磷的積累，這可能是由于叢枝菌根真菌分泌的GRSP具有很好的粘合能力，從而增加土壤中團(tuán)聚體數(shù)量，對(duì)土壤結(jié)構(gòu)進(jìn)行改良，改善植物根系生長(zhǎng)發(fā)育狀況，增加菌絲吸收范圍，從而擴(kuò)大植物對(duì)磷元素的吸收。

表7 不同處理下微生物特性、玉米生長(zhǎng)和土壤酶活性之間的皮爾遜相關(guān)分析

3 討 論

3.1 伴生黏土基質(zhì)接種不同微生物對(duì)植物生長(zhǎng)的影響

叢枝菌根真菌的種類、土壤基質(zhì)等都會(huì)影響菌根對(duì)植物的侵染[16]。叢枝菌根真菌在宿主植物根系的定殖與植物生長(zhǎng)發(fā)育息息相關(guān)，單接AMF處理和AMF+PSB處理玉米根系侵染率顯著提高，叢枝菌根真菌與玉米形成良好的共生關(guān)系，同時(shí)由于黏土保水性，當(dāng)玉米遭到水分脅迫時(shí)，叢枝菌根真菌可有效提高玉米抗逆性，對(duì)玉米生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用，尤其是增加玉米地下部分生物量。土壤中菌絲密度增加，大量產(chǎn)生的菌絲可在密度更高的黏土基質(zhì)中伸展到更廣的范圍內(nèi)吸收養(yǎng)分，擴(kuò)大植物根系吸收范圍，增加玉米生物量，提高水分和養(yǎng)分利用率。YOUSEFI[17]的研究發(fā)現(xiàn)土壤類型、磷肥的使用、微生物肥的使用會(huì)顯著影響解磷菌的數(shù)量，并且叢枝菌根真菌聯(lián)合解磷細(xì)菌能夠顯著增加小麥的生物量，與本研究的結(jié)果不同，這是由于YOUSEFI的試驗(yàn)中使用的基質(zhì)不同，該研究中過高的黏粒含量導(dǎo)致土壤通透性下降，磷元素遷移能力降低，解磷菌群落難以增殖，從而導(dǎo)致玉米生物量的降低。解磷細(xì)菌能夠促進(jìn)植物對(duì)磷元素的吸收[18]，該研究中，AMF處理 和AMF+PSB處理都顯著增加了植物地上和地下部分的生物量，而單接PSB的處理微生物貢獻(xiàn)率極低，這可能與黏土的黏性太強(qiáng)、土壤通透性太低有關(guān)；在未施加外源磷的情況下，接種叢枝菌根真菌的處理中植物對(duì)磷元素的吸收量顯著高于接種解磷細(xì)菌的處理，表明在高黏粒土壤中叢枝菌根真菌能夠有效促進(jìn)土壤磷轉(zhuǎn)化并促進(jìn)植物的吸收[19]。前人研究表明，解磷菌可有效提高植株葉綠素含量及葉片光合速率[20]。而該研究中單獨(dú)接種解磷菌效果不佳，與對(duì)照差異不顯著，接種AMF或與AMF聯(lián)合作用時(shí)則可較好發(fā)揮作用，這表明二者可以產(chǎn)生一定協(xié)同作用，叢枝菌根可以一定程度上減輕黏土礦物對(duì)解磷菌的抑制作用?？傮w來看，伴生黏土對(duì)AMF及AMF+PSB的限制作用較小，黏粒含量過高、土壤通透性差和該采礦伴生黏土中有機(jī)質(zhì)含量低可能是導(dǎo)致解磷細(xì)菌效果較差的主要原因[21]。未來應(yīng)考慮篩選耐性更強(qiáng)的菌種，用于該種土質(zhì)或配合其他菌種使用。

3.2 接種土壤微生物對(duì)土壤指標(biāo)影響

土壤酶活性能夠反映土壤微生物活性和土壤生物化學(xué)反應(yīng)情況[22]。譚曉燕等表明接種叢枝菌根真菌后根際土壤磷酸酶和蔗糖酶活性顯著提高[23]。武志海等研究發(fā)現(xiàn)，解磷細(xì)菌能顯著影響黑土中的磷酸酶和蔗糖酶活性[24]。劉紅杰等研究發(fā)現(xiàn)，摩西球囊霉和微生物復(fù)合肥聯(lián)合能有效增加土壤脲酶、蔗糖酶、磷酸酶的酶活性[25]。試驗(yàn)結(jié)果表明，AMF和AMF+PSB處理可有效促進(jìn)脲酶活性，對(duì)磷酸酶活性有一定促進(jìn)但差異不顯著，此與前人研究不完全一致，這可能是黏土基質(zhì)土壤結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等造成水分、溫度、透氣性條件等使得解磷細(xì)菌微生物活性降低，影響其代謝過程和方式，一定程度限制了微生物作用發(fā)揮[21，26]。解磷細(xì)菌對(duì)磷酸酶活性有一定促進(jìn)，但是對(duì)脲酶活性沒有顯著影響，可能是由于接種叢枝菌根真菌和解磷菌后使植物根系周圍的磷元素得到激活[16]。

叢枝菌根真菌接菌AMF處理和AMF+PSB處理球囊霉素相關(guān)土壤蛋白和水穩(wěn)性蛋白含量均大大增加，這可能與叢枝菌根真菌分泌的相關(guān)土壤蛋白有關(guān)，GRSP對(duì)于土壤微粒很好的粘合能力，利用其粘合能力，土壤中的微小團(tuán)聚體不斷形成大團(tuán)聚體、水穩(wěn)性團(tuán)聚體，從而使土壤結(jié)構(gòu)逐漸得到改善[10]。這也表明，在伴生黏土土壤改良方面叢枝菌根作用效果總體優(yōu)于解磷菌，具有更強(qiáng)的適應(yīng)能力。

4 結(jié) 論

1）在黏土基質(zhì)中叢枝菌根可與玉米形成良好共生關(guān)系，接種叢枝菌根真菌能夠顯著增加根系的侵染率和土壤中的菌絲密度。

2）接種叢枝菌根真菌及叢枝菌根與解磷菌聯(lián)合接種可有效提高玉米葉片SPAD值、凈光合速率、株高，提高玉米生物量，促進(jìn)根系發(fā)育及植物體磷元素的吸收。

3）接種叢枝菌根真菌能有效提高土壤酶活性、土壤T-GRSP，EE-GRSP、土壤團(tuán)聚體數(shù)量，而解磷細(xì)菌在純黏土環(huán)境下改良效果較弱。黏土中叢枝菌根真菌及其與解磷菌組合相較于單接解磷細(xì)菌對(duì)植物具有更好的促生作用，可用于礦區(qū)黏土基質(zhì)生態(tài)修復(fù)。