致羔羊腹瀉沙門菌的分離鑒定及耐藥性檢測(cè)

劉蒙恩，劉 洋，左春生

(1.河南省葉縣中等專業(yè)學(xué)校，河南 葉縣 467200；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003 ；3.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000)

沙門菌是臨床主要的食物源病原菌之一，該菌具有廣泛的宿主性，可以感染多種動(dòng)物及人，引起動(dòng)物和人發(fā)病的沙門菌的血清型目前有2 523個(gè)，該菌感染主要引起多種動(dòng)物的敗血癥、腸胃炎和流產(chǎn)等，其感染率和死亡率均較高[1-3]。沙門菌可以在運(yùn)輸中的動(dòng)物和未煮熟的動(dòng)物食品間傳播，對(duì)人的危害也較大，已成為公共衛(wèi)生研究的熱點(diǎn)問(wèn)題[4-5]。羊沙門菌病主要由鼠傷寒沙門菌、都柏林沙門菌、羊流產(chǎn)沙門菌等不同血清型的沙門菌引起。沙門菌可以感染不同階段、不同品種的羊，其中斷奶或斷奶不久的羊較新生羔羊易感，且以血性下痢為主要臨床癥狀，其死亡率可達(dá)60%以上[6-7]。因此，養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)注重該病的防治。目前，臨床中應(yīng)用抗生素是控制沙門菌感染的主要手段之一，但隨著抗生素的濫用，沙門菌的耐藥現(xiàn)象也日趨嚴(yán)重，且產(chǎn)生多重耐藥菌菌株，對(duì)該菌的防控帶來(lái)一定的困難，同時(shí)可導(dǎo)致肉產(chǎn)品中的藥物殘留，危害人類的身體健康[8-11]。因此，對(duì)沙門菌的合理防控具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

本試驗(yàn)于2018—2020年采集信陽(yáng)地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)中患腹瀉羔羊的肛拭子、糞便等病料組織274份，進(jìn)行沙門菌的分離鑒定，并檢測(cè)分離菌株的致病性、耐藥表型和耐藥基因的攜帶情況，以期為該地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)中致羔羊腹瀉沙門菌的綜合防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 2018—2020年采集自河南省信陽(yáng)地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)中患腹瀉羔羊的肛拭子、糞便等病料組織274份。

1.2 主要試劑 沙門菌增菌液(TTB)、沙門菌顯色鑒定培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯，均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；32E腸桿科菌生化鑒定試紙條，購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司；藥敏紙片，購(gòu)自北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DL2 000 Marker、2×TaqMaster Mix，均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 675只昆明系小鼠，體重約22 g，由信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng)與初步鑒定 將采集的樣品進(jìn)行處理后接種于TTB，37 ℃震蕩培養(yǎng)8～12 h，增菌后接種于沙門菌顯色鑒定培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～18 h后，挑單菌落純化培養(yǎng)，革蘭染色顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)特征。取純化的分離菌株，按照說(shuō)明書(shū)調(diào)整濃度進(jìn)行生化鑒定試驗(yàn)。

1.5 細(xì)菌PCR鑒定 參照參考文獻(xiàn)[12]，根據(jù)GenBank中沙門菌基因序列，設(shè)計(jì)沙門菌保守區(qū)引物invA(5′-ACAGTGCTCGTTTACGACCTGAAT-3′；5′-AGACGACTGGTACTGATCGATAAT-3′),引物擴(kuò)增片段大小為244 bp，引物由深圳華大基因股份有限公司合成。采用細(xì)菌基因組DNA試劑盒制備DNA模板，進(jìn)行PCR鑒定?；厥誔CR產(chǎn)物送華大基因測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的沙門菌參考株進(jìn)行同源性比對(duì)鑒定。

1.6 致病性試驗(yàn) 將分離菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，菌落計(jì)數(shù)，每株分離菌株灌胃攻毒組5只小鼠，劑量為0.25 mL(107CFU/mL)，對(duì)照組灌胃等量的無(wú)菌肉湯，觀察6 d，記錄小鼠的發(fā)病和死亡情況。

1.7 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)2019年推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行操作和判斷耐藥(R)、敏感(S)或中介(I)，分析分離菌株的耐藥性。

1.8 耐藥基因的檢測(cè) 參照參考文獻(xiàn)[13]，根據(jù)GenBank中登錄的沙門菌耐藥基因序列：β-內(nèi)酰胺類耐藥基因(tem、cmy、shv)，磺胺類耐藥基因(sul1、sul2、sul3)，氨基糖苷類耐藥基因[aac(3)-Iv、aac(6′)-Ib]，喹諾酮類耐藥基因[gyr(A)、gyr(B)、qur(S)]，四環(huán)素類耐藥基因[tet(A)、tet(M)、tet(R)]，酰胺醇類耐藥基因[flo(R)]，多肽類耐藥基因(mcr-1)，用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，并由華大基因合成引物，對(duì)上述7類耐藥基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與初步鑒定 在沙門菌顯色培養(yǎng)基上長(zhǎng)出邊緣整齊、大小一致、藍(lán)紫色的菌落，染色鏡檢可見(jiàn)無(wú)莢膜、兩端鈍圓的陰性短桿菌，通過(guò)生化試驗(yàn)初步鑒定為沙門菌，共有134株。

2.2 細(xì)菌PCR鑒定 對(duì)初步鑒定的134株沙門菌，用沙門菌特異性引物invA進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，134株沙門菌均擴(kuò)增出大約為244 bp的目的條帶(圖1)，且134株分離菌的測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的沙門菌參考株同源性均在97.9%以上，從分子生物水平說(shuō)明分離菌株為沙門菌。

圖1 細(xì)菌PCR鑒定

2.3 致病性試驗(yàn) 攻毒組的小鼠出現(xiàn)精神沉郁、采食量減少、寒顫，個(gè)別出現(xiàn)腹瀉，有的未表現(xiàn)出臨床癥狀即出現(xiàn)急性死亡，對(duì)照組小鼠至試驗(yàn)結(jié)束未出現(xiàn)發(fā)病和死亡情況。從發(fā)病死亡的小鼠體內(nèi)分離得到沙門菌，經(jīng)統(tǒng)計(jì)102株沙門菌能引起小鼠發(fā)病。

2.4 耐藥性分析 抗生素敏感性試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，分離的102株沙門菌對(duì)氨芐西林、慶大霉素、新霉素、大觀霉素、多西環(huán)素、土霉素、多黏菌素、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺噁唑啉、磺胺間甲氧嘧啶10種藥物的耐藥性比較嚴(yán)重，耐藥率在70.6%～100%。對(duì)頭孢噻肟、頭孢噻呋、恩諾沙星、氟苯尼考、氧氟沙星、環(huán)丙沙星6種藥物的耐藥率較低，耐藥率在8.8%～31.3%。說(shuō)明該地分離的沙門菌耐藥性嚴(yán)重。如表2所示，臨床中分離的102株沙門菌呈現(xiàn)多重耐藥性，耐16、6種藥物各有6株，耐 15、14、9種藥物各有7株，耐7種藥物有5株，耐12、11、10種藥物分離菌株最多，分別占分離菌株的15.7%、16.7%和14.7%。

表1 耐藥性檢測(cè)結(jié)果

表2 多重耐藥性檢測(cè)結(jié)果

2.5 耐藥基因檢測(cè) 分離的沙門菌對(duì)7類藥物的16種耐藥基因的PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3，分離的102株沙門菌共攜帶16種耐藥基因；其中耐藥基因sul1、sul2、sul3、aac(3)-Iv、aac(6′)-Ib、tet(A)、tet(M)、tet(R)、mcr-1檢出率為61.4%～100%；耐藥基因tem、cmy、shv、gyr(A)、gyr(B)、qur(S)、flo(R)檢出率為4.9%～20.6%。說(shuō)明分離的沙門菌攜帶多種耐藥基因。

表3 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

3 討論

沙門菌具有多種血清型，可以感染多種動(dòng)物和人類，并且該菌傳播途徑較廣泛，易引發(fā)食物中毒和敗血癥等，成為臨床重要的人獸共患病病原之一[14-15]。隨著肉羊養(yǎng)殖數(shù)量的增加，關(guān)于羊的沙門菌病報(bào)道逐漸增多，且對(duì)羔羊危害較嚴(yán)重。許多研究表明，沙門菌具有多種血清型且發(fā)病具有地區(qū)性，給疫苗研制帶來(lái)一定困難，也是導(dǎo)致其廣泛流行的重要因素之一[9-11]。因此，相關(guān)部門應(yīng)該重視沙門菌病的綜合防控。本試驗(yàn)于2018—2020年采集信陽(yáng)地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)中患腹瀉羔羊的肛拭子、糞便等病料組織274份，從中分離得到102株致病性沙門菌，說(shuō)明該區(qū)的養(yǎng)殖場(chǎng)中致羔羊腹瀉沙門菌感染嚴(yán)重，存在一定的潛在威脅，應(yīng)該注意該病的綜合防控。

國(guó)內(nèi)許多研究表明，從豬場(chǎng)、雞場(chǎng)分離的沙門菌具有很強(qiáng)的耐藥性，呈現(xiàn)多重耐藥性[16-17]。國(guó)內(nèi)關(guān)于致羔羊腹瀉沙門菌耐藥性的報(bào)道較少。本試驗(yàn)表明，分離的102株沙門菌對(duì)常用的抗生素產(chǎn)生了很強(qiáng)的耐藥性，對(duì)氨芐西林、慶大霉素、新霉素等10種藥物的耐藥率介于70.6%～100.0%，對(duì)其他藥物的耐藥率介于8.8%～31.3%。說(shuō)明沙門菌耐藥性是普遍存在的，在臨床中應(yīng)該注意抗生素的合理使用。研究表明，沙門菌耐藥性的產(chǎn)生與抗生素的使用有關(guān)，還與攜帶的耐藥基因有關(guān)，耐藥基因可以通過(guò)多種途徑在動(dòng)物和人類之間傳播，對(duì)人類健康造成隱患[18-19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，分離的102株沙門菌共攜帶16種耐藥基因，尤其對(duì)磺胺類和四環(huán)素類耐藥基因檢出率較高，攜帶耐藥基因型是否是引起耐藥性的主要因素，有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)結(jié)果為該地區(qū)的致羔羊腹瀉沙門菌的綜合防控提供了數(shù)據(jù)支持。