阿司匹林對高脂乳劑致大鼠骨丟失的骨形態(tài)計量學(xué)研究

張新樂，何 康，梁大紅，陳文雙，陳春玲，吳 鐵，陳光華，許碧蓮

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 湛江 524023；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東 湛江 524000)

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis)是一種以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性代謝性骨病，已成為全球發(fā)病率、致殘率較高且保健費用消耗很大的世紀性疾病[1]。高脂血癥是體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂導(dǎo)致血脂升高的一類疾病，表現(xiàn)為血漿中總膽固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)升高，高密度脂蛋白膽固醇(High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)降低，在我國其發(fā)病率已達到41.9%[2]。研究表明，骨質(zhì)疏松癥患者常伴有高脂血癥，骨量與骨髓腔內(nèi)脂肪量成反比[3]，可見，骨丟失和高脂血癥是有關(guān)聯(lián)的。

阿司匹林又稱乙酰水楊酸，具有解熱鎮(zhèn)痛作用，兼具抗炎抗風濕等功效[4]。據(jù)2010年美國全國健康訪談?wù){(diào)查(National Health Interview Survey)顯示，在27 157名18歲及以上的受試者中，19%的人經(jīng)常服用阿司匹林(每周至少3次，持續(xù)3個月以上)。與2005年相比，經(jīng)常使用阿司匹林的人數(shù)增加了57%，這可能是由于其廣泛報道的對心血管系統(tǒng)的保護作用[5]。鑒于阿司匹林在易骨質(zhì)疏松的老年人群中廣泛使用，人們越發(fā)關(guān)注其對骨量的影響。早在1991年，Waters等通過制動模型，發(fā)現(xiàn)阿司匹林治療顯著降低了這些制動模型動物的骨損失率[6]。目前，研究中使用比較多的是去卵巢模擬的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動物模型，Chen等發(fā)現(xiàn)阿司匹林治療組大鼠椎體骨密度(Bone mineral density,BMD)值均明顯高于去卵巢對照組，且呈劑量依賴性[7]。鑒于目前尚未見關(guān)于阿司匹林對高脂血癥所致骨質(zhì)疏松的影響的報道，本試驗建立高脂乳劑模型，通過血脂和骨形態(tài)計量學(xué)數(shù)據(jù)評價模型是否成功，并觀察阿司匹林對大鼠血脂、脛骨上段(Tibial metaphysis,PTM)松質(zhì)骨和脛骨中段(Tibial shaft,Tx)皮質(zhì)骨的作用效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 總膽固醇試劑盒、甘油三酯試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒,均購自南京建成生物工程研究所；阿司匹林，購自廣州白云山光華制藥股份有限公司，用少量乙醇促溶后用生理鹽水配至濃度為1.8 g/L；高脂乳劑由本實驗室制備(配方：每升高脂乳劑含500 g豬油、50 g膽固醇、200 mL 1,2丙二醇、10 g膽酸鈉、5 g丙硫氧嘧啶片、50 mL吐溫80)。膽固醇、膽酸鈉,均購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；丙基硫氧嘧啶，購自廣州康和藥業(yè)有限公司。

1.2 主要儀器 752紫外光柵分光光度計(上海第三分析儀器廠產(chǎn)品)，LEICA QW IN圖像分析儀(德國LEICA公司制造)，LEICA2155硬組織切片機(德國LEICA公司制造)。

1.3 實驗動物 3月齡SPF級SD大鼠30只，雌雄各半，體重(220±25) g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(桂)2014—0002]。

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗設(shè)計 將30只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機分為3個組，即生理鹽水(Normal saline，NS)組、高脂乳劑(High fat emulsion,HFE)組和阿司匹林(Aspirin,AP)組，每組10只。生理鹽水組正常飼養(yǎng),每天用生理鹽水灌胃1 mL/(100 g·bw)，高脂乳劑組每天用高脂乳劑灌胃1 mL/(100 g·bw)，阿司匹林組每天用阿司匹林溶液[濃度1.8 g/L，0.5 mL/(100 g·bw)]和高脂乳劑[1 mL /(100 g·bw)]灌胃，連續(xù)16周。

1.4.2 血脂指標的檢測 在試驗結(jié)束前1天下午開始禁食，試驗結(jié)束時心臟取血處死大鼠，離心收集血清，按照試劑盒說明書操作檢測TC、TG、HDL-C含量。

1.4.3 骨形態(tài)計量學(xué)參數(shù)的檢測 在試驗結(jié)束后分離大鼠左側(cè)脛骨，左側(cè)脛骨上段制成不脫鈣骨切片(用硬組織切片機切成5 μm薄片)、中段骨制成不脫鈣骨磨片(手工打磨成40 μm 厚片)，進行骨組織形態(tài)計量學(xué)參數(shù)檢測。采用半自動圖像數(shù)字化分析儀測量并計算出骨的靜態(tài)參數(shù)，包括骨小梁面積百分數(shù)(%Tb.Ar)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁寬度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、破骨細胞周長百分率(%Oc.S.Pm)、每毫米破骨細胞數(shù)量(Oc.N/mm)、每平方毫米破骨細胞數(shù)量(Oc.N/mm2)、成骨細胞周長百分率(%Ob.S.Pm)、皮質(zhì)骨面積(Ct.Ar)、皮質(zhì)骨面積百分數(shù)(%Ct.Ar)和骨髓腔面積百分數(shù)(%Ma.Ar)。

2 結(jié)果

2.1 阿司匹林對高脂乳劑大鼠血脂的影響 由表1可知，與生理鹽水組相比，高脂乳劑組大鼠TC升高了865.0%(P<0.01)、HDL-C降低了75.7%(P<0.01)，TG雖下降，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果提示，高脂乳劑灌胃可以成功建立高脂血癥動物模型。與高脂乳劑組相比，阿司匹林組大鼠TC降低了33.2%(P<0.05)、TG降低了38.1%(P<0.05)、HDL-C升高了90.3%(P<0.05)。結(jié)果表明，阿司匹林可以有效降低高血脂癥大鼠的血脂水平。

表1 阿司匹林對高脂乳劑大鼠血脂的影響

2.2 阿司匹林對高脂乳劑大鼠脛骨上段形態(tài)計量學(xué)靜態(tài)和吸收參數(shù)的影響 阿司匹林對高脂乳劑大鼠脛骨上段骨組織計量學(xué)中靜態(tài)參數(shù)%Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp和骨吸收參數(shù)%Oc.S.Pm、Oc.N/mm，骨形成參數(shù)%Ob.S.Pm的影響見圖1、圖2。與生理鹽水組相比，高脂乳劑組%Tb.Ar和Tb.N分別降低了48.6%(P<0.01)和37.8%(P<0.01)，Tb.Sp增加了83.3%(P<0.01)，而Oc.N/mm、Oc.N/mm2和%Oc.S.Pm分別增加了392.2%(P<0.01)、618.5%(P<0.01)和655.7%(P<0.01)；%Ob.S.Pm降低了32.5%(P<0.05)；由以上數(shù)據(jù)和圖3染色結(jié)果可知，高脂乳劑使大鼠脛骨上段松質(zhì)骨的骨小梁顯著減少，微觀結(jié)構(gòu)疏松退化，且破骨細胞的數(shù)量明顯增加，成骨細胞的數(shù)量減少。與高脂乳劑組相比，阿司匹林組的%Tb.Ar、Tb.Th 和Tb.N分別升高了76.5%(P<0.01)、19.6%(P<0.05)和50.6%(P<0.01)，Tb.Sp減少了39.8%(P<0.01)；Oc.N/mm、Oc.N/mm2和%Oc.S.Pm分別減少了74.0%(P<0.01)、78.9%(P<0.01)和73.1%(P<0.01)；%Ob.S.Pm增加了108.3%(P<0.01)；結(jié)果表明，阿司匹林可有效預(yù)防高脂乳劑對大鼠脛骨上段松質(zhì)骨顯微結(jié)構(gòu)的破壞，抑制骨吸收，促進骨形成。

圖1 阿司匹林對高脂乳劑大鼠脛骨上段形態(tài)計量學(xué)靜態(tài)參數(shù)的影響

圖2 阿司匹林對高脂乳劑大鼠脛骨上段骨吸收和形成參數(shù)的影響

圖3 大鼠脛骨上段5 μm切片(Masson-Goldner Trichrome 染色，10×)

2.3 阿司匹林對高脂乳劑大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨靜態(tài)參數(shù)的影響 阿司匹林對高脂乳劑大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨靜態(tài)參數(shù)Ct.Ar、%Ct.Ar、%Ma.Ar的影響見圖4、圖5。與生理鹽水組比較，高脂乳劑組大鼠的骨髓腔擴大，皮質(zhì)骨面積比例下降；靜態(tài)參數(shù)%Ct.Ar下降了4.7%(P<0.01)，%Ma.Ar增加了15.3%(P<0.01)，提示高脂乳劑使大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨面積比例下降，骨髓腔變大，且均有統(tǒng)計學(xué)意義，說明高脂可引起大鼠皮質(zhì)骨骨量丟失。與高脂乳劑組比較，阿司匹林組的%Ct.Ar增加了4.6%(P<0.05)、%Ma.Ar下降了12.5%(P<0.01)，說明阿司匹林可有效預(yù)防高脂乳劑大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨骨量丟失。

圖4 阿司匹林對高脂乳劑大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨靜態(tài)參數(shù)的影響

圖5 大鼠脛骨中段40 μm 磨片(不脫鈣骨未染色，10×)

3 討論

本試驗建立的高脂模型表現(xiàn)為總膽固醇升高伴高密度脂蛋白膽固醇下降，與臨床高脂血癥類似。本試驗結(jié)果顯示,高脂大鼠脛骨出現(xiàn)了明顯的骨丟失：(1)骨量減少：高脂乳劑組脛骨上段反映骨量變化的重要指標——骨小梁面積百分數(shù)明顯下降，松質(zhì)骨丟失；脛骨中段皮質(zhì)骨面積比例下降，說明皮質(zhì)骨骨量減少。(2)骨顯微結(jié)構(gòu)變差：高脂乳劑組骨小梁數(shù)量減少，分離度增加，表明脛骨上段松質(zhì)骨的骨小梁顯著減少，微觀結(jié)構(gòu)疏松退化。(3)骨吸收增加：高脂乳劑組單位面積內(nèi)破骨細胞數(shù)量增加，說明骨吸收增加。(4)骨形成減少：高脂乳劑組單位面積內(nèi)成骨細胞數(shù)目減少，說明骨形成減少。研究顯示，骨髓基質(zhì)細胞可分化成脂肪細胞和成骨細胞，Wnt信號通路可調(diào)控骨髓基質(zhì)細胞的雙向分化功能，當Wnt信號通路被中斷時骨髓基質(zhì)細胞主要朝脂肪細胞分化，那么向成骨細胞分化就會減少，骨生成減少，導(dǎo)致骨量減少，這是脂代謝紊亂導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的原理[8]。

阿司匹林所具有的解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗血小板聚集作用。最近研究顯示，阿司匹林還有抗骨質(zhì)疏松的作用[9]，但其對高脂所致骨質(zhì)疏松的影響未見報道，因此，本試驗通過觀察阿司匹林對血脂、骨形態(tài)計量學(xué)的影響，評價其對高脂血癥大鼠骨丟失的保護作用。試驗結(jié)果顯示，阿司匹林可以明顯降低高脂大鼠TC和TG水平，提高HDL-C水平。這與華軼男等[10]報道的阿司匹林均有一定程度的降低兔血清TC及增加HDL-C的作用的研究結(jié)果相符。阿司匹林的調(diào)脂機制可能與增加體外培養(yǎng)的單核-巨噬細胞B族I型清道夫受體(Scavenger receptor class B type I，SR-BI)和三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1編碼基因(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)的表達[11]有關(guān)，SR-BI通過結(jié)合HDL-C，促進總膽固醇的逆轉(zhuǎn)運。另有研究顯示，阿司匹林的調(diào)脂機制與阿司匹林抗氧化功能有關(guān)[12]。

本試驗骨形態(tài)計量學(xué)結(jié)果顯示，阿司匹林對高血脂導(dǎo)致的骨丟失有明顯的保護作用：(1)骨量增加：阿司匹林組大鼠骨小梁面積百分數(shù)明顯上升；脛骨中段皮質(zhì)骨面積比例增加，說明皮質(zhì)骨骨量增加。(2)骨顯微結(jié)構(gòu)變良：阿司匹林組骨小梁數(shù)量增加，寬度增厚，分離度減少，表明脛骨上段松質(zhì)骨的骨小梁變粗、變密，微觀結(jié)構(gòu)疏松改善。(3)骨吸收減少：阿司匹林組單位面積內(nèi)破骨細胞數(shù)目減少，說明骨吸收受到抑制。(4)骨形成增加：阿司匹林組單位面積內(nèi)成骨細胞數(shù)目增加，說明促進骨形成。阿司匹林具有骨保護作用，主要是由于：一方面阿司匹林能降血脂，使骨髓基質(zhì)干細胞向脂肪細胞分化受到抑制，從而促進成骨細胞前體細胞的存活和成骨細胞的分化；還能抑制核因子κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)通路，減少核因子κB受體活化因子配體 (Receptor activator for nuclear Factor-κB ligand,RANKL)的表達，從而抑制破骨細胞的分化[13];另一方面，前列腺素E2(PGE2)在骨細胞中機械信號的傳導(dǎo)中起著重要的作用，其通過改變RANKL-OPG軸[骨保護素(Osteoprotegerin,OPG)]影響破骨細胞的形成[14]。阿司匹林抑制環(huán)氧酶(COX)從而抑制前列腺素的合成起到解熱鎮(zhèn)痛抗炎的作用[15]，所以阿司匹林抑制了前列腺素的合成,最終也影響了破骨細胞的形成。

綜上所述，高脂飲食會導(dǎo)致脂質(zhì)紊亂進而造成骨量丟失。形態(tài)計量學(xué)結(jié)果顯示，阿司匹林主要是通過抑制骨吸收和促進骨形成而防止骨丟失。其抑制骨吸收可能是通過抑制RANKL的表達和抑制前列腺素E2生成，其促進骨形成可能是通過抑制骨髓基質(zhì)干細胞向脂肪細胞分化。