雞源緩慢葡萄球菌的分離鑒定與耐藥性分析

李 濤，陳 廣，溫貴蘭，劉蔓蔓，張小波，曾熙雯

(1.貴州省動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽 550025；2. 貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025 ；3. 貴州省動物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550016)

緩慢葡萄球菌(Staphylococcuslentus)屬于微球菌科、葡萄球菌屬，是一種凝固酶陰性葡萄球菌(Coagulase-negativeStaphylococci,CNS)，最早由Kloos等[1]命名。目前，緩慢葡萄球菌使動物致病的報道越來越多[2-6]，但關(guān)于禽源緩慢葡萄球菌的報道較為罕見。2019年12月，貴州省某養(yǎng)殖場麻黃雞出現(xiàn)死亡，病雞臨床癥狀表現(xiàn)為面部腫脹，剖檢主要病變?yōu)樾呐K纖維素性滲出、心包積液等。本試驗從病雞中分離出1株革蘭陽性球菌，經(jīng)病原形態(tài)觀察、生化試驗和16S rRNA鑒定為緩慢葡萄球菌，并對其進行藥敏試驗、耐藥基因檢測、動物回歸試驗，為臨床禽類防控緩慢葡萄球菌病提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料及試驗動物 2只患病麻黃雞源自貴州某養(yǎng)殖場；16只SPF級昆明小鼠，購自貴州醫(yī)科大學實驗動物中心；16只1日齡麻黃雞，購自貴州大學科研雞場。

1.2 主要試劑 固體瓊脂培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基、革蘭染料、藥敏紙片，均購自杭州微生物試劑有限公司；2×EsTaqDNA聚合酶，購自康為世紀有限公司；DL-2 000 Marker、DL-5 000 Marker，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成 參照參考文獻[7-10]合成細菌16S rRNA引物和耐藥基因引物，檢測的耐藥基因包括大環(huán)內(nèi)酯類erm(B)、erm(C)，喹諾酮類oqx(A)，四環(huán)素類tet(B)，磺胺類sul1，β-內(nèi)酰胺類blaTEM、blaVIM。引物序列見表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 細菌分離純化及形態(tài)觀察 無菌環(huán)境下取病雞的肝臟、心臟、眶下窩和腹腔積液在鮮血瓊脂平板上進行細菌分離培養(yǎng)，將血平板分成2個組，分別置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h和37 ℃燭缸培養(yǎng)12 h。染色鏡檢后進行純化，純化后取單個菌落于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。

1.5 生化試驗 挑取純培養(yǎng)后的單菌落接種于16種常見生化管(表2)，37 ℃培養(yǎng)24～48 h后記錄結(jié)果。血漿凝固酶試驗：在2塊玻片上均加100 μL的新鮮兔血漿，然后分別加入等量的待測菌液和PBS，混合1 min后記錄結(jié)果。

1.6 16S rRNA序列分析 使用1.3中16S rRNA引物進行PCR擴增。PCR反應產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，陽性產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.7 藥敏試驗 挑取分離純化后單菌落于37 ℃搖菌12～16 h，取100 μL菌液用無菌涂布棒均勻涂抹于LB固體培養(yǎng)基中，用紙片法將藥敏紙片緊貼于平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，記錄藥敏紙片的抑菌圈直徑，參照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會 (CLSI 2016) 抗微生物藥物敏感試驗標準進行分離菌藥物敏感性判斷。

1.8 耐藥基因檢測 使用1.3中合成的耐藥基因引物對分離菌進行PCR檢測。反應產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.9 動物致病性試驗 挑取純化后的單菌落搖菌24 h，使用平板菌落計數(shù)法計算出原始菌液中所含菌落總數(shù)為5.8×108CFU/mL。將小鼠分為4個組，每組4只，將菌液用滅菌PBS稀釋成5.8×108、5.8×107CFU/mL和5.8×106CFU/mL，分別注射于3個試驗組的小鼠，每只腹腔注射0.5 mL菌液，對照組腹腔注射等體積的滅菌PBS。連續(xù)觀察7 d，記錄對照組和試驗組小鼠情況。雛雞致病性試驗同小鼠致病性試驗。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離純化及形態(tài)觀察 從病雞內(nèi)臟分離到形態(tài)均一菌落，且需氧培養(yǎng)比厭氧培養(yǎng)生長狀態(tài)好，鮮血瓊脂平板上可見乳白色、表面凸起、邊緣整齊的菌落。革蘭染色鏡檢可見葡萄串狀的球菌，將分離菌株命名為GZSL20191203。

2.2 生化試驗 GZSL20191203尿素等12種反應陽性，木糖醇等4種反應陰性，血漿凝固酶試驗陰性，結(jié)果如表2所示。

表2 GZSL20191203生化試驗

2.3 16S rRNA序列分析 對分離菌進行16S rRNA PCR擴增，結(jié)果在1 450 bp左右出現(xiàn)條帶(圖1)。經(jīng)測序獲得大小為1 439 bp的序列，將序列與GenBank下載的參考菌株16S rRNA基因序列進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)GZSL20191203與下載的6株緩慢葡萄球菌的16S rRNA同源性均≥99.8%，與黑龍江分離株CICCHLJ Q29親緣關(guān)系最遠，為99.8%，與伊朗分離株HM17親緣關(guān)系較近，為100%(圖2)。用生物學軟件Megalign對測序所得16S rRNA序列繪制遺傳進化樹，結(jié)果顯示GZSL20191203與緩慢葡萄球菌處于同一分支(圖3)。

圖1 16S rRNA基因的PCR擴增

圖2 GZSL20191203 16S rRNA基因序列核苷酸同源性分析

圖3 GZSL20191203 16S rRNA基因序列系統(tǒng)進化樹

2.4 藥敏試驗 選取28種藥敏紙片進行藥敏試驗，GZSL20191203對羧芐西林等21種抗菌藥耐藥，對頭孢氨芐等5種抗菌藥中度敏感，對頭孢哌酮和頭孢唑啉敏感(表3)。結(jié)果表明GZSL20191203耐藥性較高。

表3 GZSL20191203藥敏試驗

續(xù)表

2.5 耐藥基因檢測 GZSL20191203耐藥基因PCR檢測結(jié)果見圖4，大環(huán)內(nèi)酯類erm(B)、erm(C),β-內(nèi)酰胺類blaVIM、blaTEM,四環(huán)素類tet(B),磺胺類sul1耐藥基因呈陽性。

圖4 GZSL20191203耐藥基因的PCR擴增

2.6 動物致病性試驗 攻毒12 h后試驗組小鼠精神沉郁、呆立不動、畏寒、腹式呼吸，這與蘇接瑜等[5]緩慢葡萄球菌小鼠致病性試驗結(jié)果一致，而對照組小鼠精神相對較好；之后試驗組小鼠精神逐漸好轉(zhuǎn)，攻毒后7 d，精神恢復正常。雛雞按同樣方法同等劑量腹腔接種緩慢葡萄球菌，同樣觀察7 d，試驗組雛雞也未發(fā)生死亡。但試驗組雛雞生長緩慢，與對照組相比體重差異明顯，其中5.8×108CFU/mL接種量的雛雞差異最為明顯。結(jié)果表明GZSL20191203正常情況對小鼠和雛雞無致病性。

3 討論

目前，CSN被認為與人類和動物各種機會性感染有關(guān)[11]。緩慢葡萄球菌作為CSN的一種，隨著致病的報道增多而備受關(guān)注。2010—2019年，先后報道了緩慢葡萄球菌致倉鼠[3]、豬[4]、眼鏡蛇[5]、水貂[6]發(fā)病。但雞感染緩慢葡萄球菌的報道罕見，本試驗從病雞的心臟、肝臟、腎臟、眶下窩和腹腔積液分離到緩慢葡萄球菌，證實病雞確有緩慢葡萄球菌感染。Wos-Oxley等[12]發(fā)現(xiàn)，人的前鼻孔經(jīng)常被凝固酶陰性葡萄球菌定殖，眼結(jié)膜表面也常常被CNS定殖[13-14]。本試驗中病雞頭面部腫脹也與緩慢葡萄球菌定殖于動物眼結(jié)膜和鼻孔有關(guān)。

GZSL20191203對紅霉素等耐藥，能檢測到erm(B)等耐藥基因。雖然大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和β-內(nèi)酰胺類藥敏試驗與耐藥基因檢測結(jié)果一致；但喹諾酮類藥敏試驗與耐藥基因檢測結(jié)果不同，說明耐藥表型與耐藥基因型沒有嚴格的一一對應的聯(lián)系。這可能與基因的表達狀態(tài)以及在抗菌藥的選擇壓力下細菌產(chǎn)生抗性機制的多樣性等多種因素有關(guān)[15]。魏文娟等[16]研究也表明，一些耐藥菌株不攜帶耐藥基因可能是因為存在其他耐藥機制。已有文獻表明，葡萄球菌可以共享許多抗藥性基因[17-18]，因此GZSL20191203攜帶的耐藥基因可能會在環(huán)境中擴散，造成其他物種耐藥性增加。細菌耐藥機制有很多，包括耐藥基因和整合子介導的耐藥機制[19]，GZSL20191203檢測出β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM、blaVIM，說明該菌株能夠使β-內(nèi)酰胺類抗菌藥失活或產(chǎn)生低親和力而耐藥。Bhargava等[20]從牛、山羊、綿羊、豬和雞分離的緩慢葡萄球菌中檢測出大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因erm(A)、erm(B)、erm(C)，GZSL20191203也與此相符。這些研究都表明緩慢葡萄球菌有較高的耐藥性，并且可以作為貯存庫傳播給其他葡萄球菌，使得其他葡萄球菌耐藥性升高。本試驗成功分離到1株緩慢葡萄球菌，并對其進行耐藥基因PCR檢測、小鼠和雛雞致病性試驗，發(fā)現(xiàn)分離株GZSL20191203是1株多重耐藥的條件致病性緩慢葡萄球菌。