菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料對(duì)肉雞肌肉風(fēng)味物質(zhì)含量、腸道轉(zhuǎn)錄組及菌群組成的影響

林標(biāo)聲 何玉琴，2 謝璐娜 周孝瓊 羅 建 李 焰,2 戴愛(ài)玲，2*

(1. 龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，龍巖 364000；2.福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，龍巖 364000；3.福建省龍巖市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，龍巖 364000；4.福建龍巖金和動(dòng)物飼料有限公司，龍巖 364000)

隨著減抗、無(wú)抗時(shí)代的來(lái)臨，更多的抗生素替代品被大量應(yīng)用在動(dòng)物飼糧中，其中菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料作為一種新型的綠色飼料添加劑在“禁抗替抗”中具有良好的應(yīng)用前景。菌酶協(xié)同發(fā)酵其微生物益生菌與酶解技術(shù)相結(jié)合的功能，是發(fā)酵飼料重大的技術(shù)突破點(diǎn)，是將來(lái)生物飼料發(fā)展的一個(gè)重要方向[1]。大量研究證實(shí)，在飼糧中添加復(fù)合酶特別是非淀粉多糖酶(NSP)對(duì)畜禽生產(chǎn)及品質(zhì)具有積極的影響。研究表明，在肉雞飼糧中添加NSP，能彌補(bǔ)機(jī)體分泌NSP不足的缺陷，消除NSP的黏度效應(yīng)，間接提高飼糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率，從而促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)[2-3]。另有報(bào)道表明，菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料能夠促進(jìn)雞腸上皮細(xì)胞的形成，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率，維持腸道微生態(tài)平衡，改善雞的腸道健康并預(yù)防腸道病原菌感染[4]。但已有的研究中探討菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料影響畜禽生長(zhǎng)及腸道功能的機(jī)理研究報(bào)道較少。

此外，隨著人們生活水平的提高，消費(fèi)者越來(lái)越注重雞肉的質(zhì)量，對(duì)肉質(zhì)有了更高的要求。然而，隨著動(dòng)物生產(chǎn)性能的不斷提高，其風(fēng)味品質(zhì)呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì)[5-6]。因此，既能充分發(fā)揮肉雞的生長(zhǎng)潛力又能夠改善雞肉風(fēng)味品質(zhì)的各類型發(fā)酵飼料添加劑在肉雞飼養(yǎng)中越來(lái)越受到人們的重視。研究表明，發(fā)酵飼料通過(guò)好氧厭氧發(fā)酵對(duì)底物進(jìn)行深層發(fā)酵，對(duì)肉雞的生長(zhǎng)性能、消化代謝、肉品質(zhì)、肌肉脂肪酸組成等方面均有不同程度的改善，還能顯著提高肉雞的屠宰率、腿肌率以及胸肌率[7]。

高通量測(cè)序已經(jīng)成為一種常規(guī)的試驗(yàn)技術(shù)用于生命科學(xué)領(lǐng)域，包括轉(zhuǎn)錄水平和腸道菌群分析等。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)通過(guò)高通量測(cè)序來(lái)全面快速地獲得特定細(xì)胞或組織在某一狀態(tài)下幾乎所有轉(zhuǎn)錄的序列信息和表達(dá)信息，準(zhǔn)確地分析基因的表達(dá)差異[8]；而基于16S rRNA基因高通量測(cè)序已成為動(dòng)物腸道菌群組成及多樣性分析的常用技術(shù)[9]。因此，本研究將河田雞作為研究對(duì)象，研究菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料對(duì)肉雞肌肉風(fēng)味物質(zhì)含量、腸道轉(zhuǎn)錄組及菌群組成的影響，探討其作用肉雞腸道功能的機(jī)理，以期為菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料在肉雞生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

NSP組成及其活性：木聚糖酶活性10 000～20 000 U/g，β-葡聚糖酶活性1 000～1 500 U/g，甘露聚糖酶活性200～300 U/g，纖維素酶活性2 000～4 000 U/g，果膠酶活性100～300 U/g。

發(fā)酵裝置：選擇帶有單向透氣孔的PE膜，該膜5～7層厚，透氣口徑9～12 mm，透氧量2.25～4.42 cm3/(m2·d·Pa)，排氣壓力6 644～7 350 Pa。

菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料：采用某公司自動(dòng)化生產(chǎn)工藝設(shè)備進(jìn)行生產(chǎn)，具體流程如下：1)發(fā)酵復(fù)合菌株(乳酸菌6.2×109～7.7×109CFU/g、酵母菌3.3×108～4.6×108CFU/g和芽孢桿菌2.5×108～4.2×108CFU/g的復(fù)合菌劑)提前用25～30 ℃紅糖水活化；2)發(fā)酵原料(玉米、豆粕、麩皮、糖蜜豆皮、米糠粕)與1.0%復(fù)合多維、0.07% NSP和前述活化好的發(fā)酵復(fù)合菌株共同混合，并補(bǔ)充水分至30%，攪拌均勻；3)混合好的物料裝入帶有單向透氣孔的PE膜袋中密封，在25 ℃下發(fā)酵5～7 d得成品。發(fā)酵產(chǎn)品中主要營(yíng)養(yǎng)成分含量：粗蛋白質(zhì)≥16.0%、粗纖維12.5%、粗灰分≤12.0%、有機(jī)酸≥13.8%、酸溶蛋白12.0%、鈣2.5%～3.5%、總磷≥10.1%、氯化鈉0.1%～0.8%、賴氨酸≥0.35%，最終活菌總數(shù)7.3×109～8.1×109CFU/g。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在福建省長(zhǎng)汀縣眾益農(nóng)牧有限公司飼養(yǎng)的長(zhǎng)汀河田肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)選取體重相近、健康無(wú)病的60日齡河田肉雞18 000羽，隨機(jī)分為2組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1 500羽，飼養(yǎng)于單層平養(yǎng)雞籠內(nèi)。對(duì)照組飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧(組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1)，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼糧中添加5.0%菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料，混合均勻飼喂，試驗(yàn)期90 d。自由采食，自由飲水，飼養(yǎng)管理按場(chǎng)內(nèi)統(tǒng)一技術(shù)規(guī)程進(jìn)行。試驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取體重相似的肉雞6只(每個(gè)重復(fù)1只)進(jìn)行屠宰，取左側(cè)胸肌、髂脛外側(cè)肌同一部位的腿肌樣品用于風(fēng)味物質(zhì)含量測(cè)定。再用無(wú)菌剪刀將所屠宰的6組肉雞分別沿腹底部向上剖開(kāi)腹腔，剪切雞的整個(gè)腸道，其中3組整個(gè)腸道分別裝入無(wú)菌封口塑料袋中；另外3組腸道再分別剪切下十二指腸、空腸、回腸、盲腸和直腸組織，挑起各腸道內(nèi)容物于無(wú)菌離心管中。2類樣品均先液氮預(yù)凍-80 ℃保存，再用干冰運(yùn)輸送至北京奧維森基因科技有限公司，整個(gè)腸道樣品用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，各腸道不同區(qū)段內(nèi)容物用于菌群組成分析。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 風(fēng)味物質(zhì)含量的測(cè)定

分別使用氨基酸分析儀(茚三酮衍生系統(tǒng)，蘭博PCR3+)和全自動(dòng)凱氏定氮儀(海能K1160)參照中國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測(cè)定》和GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》的方法測(cè)定肌肉中的氨基酸和蛋白質(zhì)含量；采用高效液相色譜儀(安捷倫 1260)參照GBDB 37/T 3816—2019 《畜禽肌肉中肌苷酸含量測(cè)定 高效液相色譜法》和GB 5009.169—2016《食品中?；撬岬臏y(cè)定》的方法測(cè)定肌肉中的肌苷酸和?；撬岷浚徊捎脷庀嗌V儀(Agilent Technologies 7890B)參照GB 5009.128.2016《食品中膽固醇的測(cè)定》和GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測(cè)定》的方法測(cè)定肌肉中膽固醇和不飽和脂肪酸含量；以上指標(biāo)測(cè)定均送至中國(guó)廈門(mén)譜尼測(cè)試有限公司檢測(cè)。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

將2組肉雞整個(gè)腸道樣本分別放置液氮中，邊研磨邊粉碎，再取粉碎后部分樣品采用RNA 6000 Nano Kit試劑盒(Agilent公司，型號(hào)5067-1511)提取總RNA，通過(guò)Nanodrop和Agilent 2100檢測(cè)RNA純度[吸光度(OD)260/280、OD260/230]及RNA片段長(zhǎng)度，樣品檢測(cè)合格后委托北京奧維森基因科技有限公司完成文庫(kù)的構(gòu)建和測(cè)序工作，建好的測(cè)序文庫(kù)采用Illumina HiSeq 4000高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。去除帶有測(cè)序接頭(adapter)、N(不確定堿基)含量≥10%和低質(zhì)量堿基(Q≤20)含量大于50%的測(cè)序原始數(shù)據(jù)后，采用Tophat2軟件將測(cè)序序列和轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行比對(duì)，隨后采用Cufflinks軟件組裝比對(duì)結(jié)果，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行RNA-Seq相關(guān)性檢查。采用HTSeq軟件對(duì)各樣品進(jìn)行基因表達(dá)水平的分析，使用FPKM值為1作為判斷基因是否表達(dá)的闕值，只分析FPKM>1的基因[10]，并使用DESeq進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選條件為qvalue<0.05[11]?；赪allenius non-central hyper-genometic發(fā)布的方法，通過(guò)GOseq軟件對(duì)差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行GO富集分析[12]；將測(cè)序結(jié)果與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，通過(guò)超幾何檢驗(yàn)，找出差異表達(dá)基因當(dāng)中最顯著富集的通路，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和分類[13]。

1.5 腸道菌群分析

分別取3組雞腸道十二指腸、空腸、回腸、盲腸和直腸組織內(nèi)容物，采用MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit(100)提取其細(xì)菌總DNA。獲得總DNA后委托北京奧維森基因科技有限公司進(jìn)行具體分析工作，采用Miseq PE300高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行建庫(kù)，應(yīng)用16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序，經(jīng)過(guò)濾數(shù)據(jù)中的嘈雜序列，去雜、拼接獲得高質(zhì)量有效序列再通過(guò)Usearch軟件，按照97%的相似度CD-HIT分類方法進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類，以豐度最大的序列為代表序列通過(guò)RDP Classifier與GreenGene數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU代表序列進(jìn)行物種注釋(闕值為0.8～1.0)[14]，計(jì)算OTU數(shù)量、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Chao l指數(shù)等α多樣性指數(shù)[15]，并進(jìn)行主成分分析(PCA)(R軟件，vegan包)[16]和線性判別分析(LEFSe)(LDA score>4)[17]，探討腸道各區(qū)段菌群組成的差異性。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用Statistics 17.0軟件中的Independent-SampletTest獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)分析試驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料對(duì)肉雞肌肉風(fēng)味物質(zhì)含量的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組肉雞的各項(xiàng)風(fēng)味物質(zhì)含量均有增長(zhǎng)或改善，其中，試驗(yàn)組胸肌的總氨基酸、風(fēng)味氨基酸、肌苷酸、不飽和脂肪酸含量和腿肌的總氨基酸、風(fēng)味氨基酸、蛋白質(zhì)、膽固醇、?；撬岷筒伙柡椭舅岷坎町惥_(dá)顯著水平(P<0.05)，表明菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料對(duì)肉雞肌肉風(fēng)味具有良好的改善作用。

表2 菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料對(duì)肉雞肌肉風(fēng)味物質(zhì)含量的影響

續(xù)表2 項(xiàng)目 Items胸肌 Chest muscle對(duì)照組 Control group試驗(yàn)組 Test group腿肌 Leg muscle對(duì)照組 Control group試驗(yàn)組 Test group膽固醇 Cholesterol0.044±0.0000.042±0.0010.074±0.0010.037±0.000??；撬?Taurine0.064±0.0010.067±0.0020.254±0.0100.278±0.021?不飽和脂肪酸 Unsaturated fatty acids0.43±0.050.68±0.06?0.83±0.031.57±0.02?

2.2 菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料對(duì)肉雞腸道轉(zhuǎn)錄組的影響

2.2.1 樣品測(cè)序質(zhì)量評(píng)估

對(duì)照組和試驗(yàn)組各樣品總RNA提取效果較好，其OD260/280在2.027～2.063，OD260/230在1.450～2.254，RNA完整值(RIN)在9.8～10.0，28S/18S在2.2～4.0，樣品質(zhì)量滿足建庫(kù)測(cè)序要求。RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將構(gòu)建好的cDNA文庫(kù)，通過(guò)Illumina HiSeq 4000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。測(cè)序得到的下機(jī)數(shù)據(jù)去除帶有接頭(adapter)、N(不確定堿基)含量≥10%和低質(zhì)量堿基(Q≤20)含量超過(guò)50% reads的原始序列，得到質(zhì)控序列(clean reads)。6個(gè)樣本均獲得了7.00 G以上容量的原始數(shù)據(jù)，GC含量都在50.00%以上，平均錯(cuò)誤率均為0.03%，Q20與Q30分別都在97.00%及93.00%以上(表3)，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所獲得數(shù)據(jù)的質(zhì)量較好，可用于后續(xù)分析。2組樣本之間的相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.960，表明結(jié)果可靠且樣本選擇合理(圖1)。

表3 2組樣品測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及質(zhì)量檢驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 差異表達(dá)基因篩選

對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行表轉(zhuǎn)化處理后，根據(jù)|log2(fold change)|>1且qvalue<0.05的原則篩選差異表達(dá)基因。與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組共篩選出7 751個(gè)差異表達(dá)基因，其中試驗(yàn)組有3 833個(gè)基因上調(diào)表達(dá)(圖2-A)，占總差異表達(dá)49.45%，3 918個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，占總差異表達(dá)50.55%。以FPKM>1作為判斷基因表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)，2個(gè)樣品共同表達(dá)基因13 089個(gè)，試驗(yàn)組特有的表達(dá)基因363個(gè)(圖2-B)。

2.2.3 上調(diào)差異表達(dá)基因GO富集

對(duì)2組樣品差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果顯示，總共有12 782個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因被富集到3 167個(gè)GO term。對(duì)富集最顯著的30個(gè)GO term功能富集分析表明，富集的基因條目集中在與生物過(guò)程(biological process)相關(guān)的條目，個(gè)別在細(xì)胞組成(cellular component)相關(guān)的條目。在生物過(guò)程類別中，富集到差異表達(dá)基因最多的類別是對(duì)壓力的反應(yīng)(response to stress)、免疫系統(tǒng)過(guò)程(immune system process)和免疫反應(yīng)(immune response)(圖3)。

CK1、2、3和TG1、2、3分別為對(duì)照組和試驗(yàn)組樣品。CK1, 2, 3 and TG1, 2, 3 were samples in control and test groups, respectively.

2.2.4 上調(diào)差異表達(dá)基因KEEG富集

2組樣品上調(diào)差異表達(dá)基因KEEG富集分析表明，共有2 772個(gè)基因被注釋到162條KEGG代謝通路中，其中2組富集最顯著的20條KEGG代謝通路如圖4所示。與新陳代謝有關(guān)的信號(hào)通路11個(gè)，包括脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路(adipocytokine signaling pathway)、嘧啶代謝(pyrimidine metabolism)、次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)、氨基酸的生物合成(biosyn-thesis of amino acids)、嘌呤代謝(purine metabo-lism)、N-聚糖生物合成(N-glycan biosynthesis)、2-氧羰基酸代謝(2-oxocarboxylic acid metabolism)、賴氨酸生物合成(lysine biosynthesis)、氨酰tRNA生物合成(aminoacyl-tRNA biosynthesis)、丙酮酸代謝(pyruvate metabolism)及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成(valine, leucine and isoleucine biosynthesis)，其中富集差異表達(dá)基因數(shù)目最多的信號(hào)通路為次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成，共富集到差異表達(dá)基因66個(gè)，與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；富集程度最高的信號(hào)通路是氨基酸的生物合成，共富集到差異表達(dá)基因13個(gè)，與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。與免疫有關(guān)信號(hào)通路9個(gè)，包括NOD樣受體信號(hào)通路(NOD-like receptor signaling pathway)、甲型流感(influenza A)、單純皰疹病毒1型感染(herpes simplex virus 1 infection)、吞噬體(phagosome)、胞漿DNA感應(yīng)途徑(cytosolic DNA-sensing pathway)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)、C型凝集素受體信號(hào)通路(c-type lectin receptor signaling pathway)、細(xì)胞黏附分子(cell adhesion molecules)和凋亡(apoptosis)，其中富集差異表達(dá)基因數(shù)最多的信號(hào)通路為細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)，共富集到差異表達(dá)基因80個(gè)，與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；富集程度最高的信號(hào)通路是吞噬體(phagosome)，共富集到差異表達(dá)基因16個(gè)，與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。

圖2 2組樣品差異表達(dá)基因火山圖(A)和韋恩圖(B)

2.3 菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料對(duì)肉雞腸道菌群組成的影響

2.3.1 肉雞腸道菌群Alpha多樣性分析

通過(guò)對(duì)測(cè)序所得的序列進(jìn)行預(yù)處理，去除低質(zhì)量序列和冗余序列，2組樣品30個(gè)樣本Index完全匹配的有效序列量見(jiàn)表4所示。各樣本菌群組成差異性較大，2組腸道各區(qū)段菌群的數(shù)量均為盲腸>直腸>回腸>空腸>十二指腸；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組各對(duì)應(yīng)腸道區(qū)段OTUs數(shù)目和Chao1指數(shù)增加，表明各樣本的菌群數(shù)量增加；試驗(yàn)組各對(duì)應(yīng)腸道區(qū)段Shannon和Simpson指數(shù)略小于對(duì)照組，表明各樣本的菌群的種類略有下降?？傊?，益生菌發(fā)酵飼料的添加改變了肉雞腸道不同區(qū)段的微生物菌群組成。

圖3 上調(diào)差異表達(dá)基因的GO功能富集分析

從細(xì)菌的有效序列長(zhǎng)度圖可以看出，細(xì)菌序列主要分布在400～440 bp(圖5-A)。利用Mothur軟件做稀釋曲線分析，從各樣本中細(xì)菌的稀釋度(rarefaction)曲線(圖5-B)可以看出，30條曲線均趨向平坦，2組樣本不同腸道區(qū)段樣本曲線均較為集中的聚類在一起，表明所測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，大多數(shù)細(xì)菌類群包括在各樣本文庫(kù)中，能夠比較真實(shí)地反映樣本的微生物群落多樣性。

表4 各樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)及OTUs、多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)

圖5 各樣本序列長(zhǎng)度分布圖(A)和稀釋度曲線(B)

2.3.2 肉雞腸道菌群組成分析

對(duì)照組和試驗(yàn)組肉雞各腸道不同區(qū)段樣本均值的OTUs物種注釋結(jié)果如圖6所示，2組樣品中均存在著占很大比例的未能培養(yǎng)(uncultured)和未定義(unidentified)菌群，從門(mén)水平上看，2組樣品菌群中相對(duì)豐度最高的為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)(24%～66%)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)(12%～45%)和變形菌門(mén)(Proteobacteria)(1%～16%)；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組各對(duì)應(yīng)腸道區(qū)段樣本菌群的厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度增加，擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)和放線菌門(mén)(Actinobacteriota)相對(duì)豐度降低。從屬的水平上看，2組樣品菌群的優(yōu)勢(shì)菌屬均為乳桿菌屬(Lactobacillus)(12%～43%)、擬桿菌屬(Bacteroides)(13%～41%)和乳球菌屬(Lactococcus)(5%～21%)。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組各對(duì)應(yīng)腸道區(qū)段樣本菌群的乳桿菌屬、乳球菌屬、克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)、另支菌屬(Alistipes)等有益菌屬相對(duì)豐度增加，擬桿菌屬、腸球菌屬(Enterococcus)、彎曲桿菌屬(Campylobacte)、罕見(jiàn)小球菌屬(Subdoligranulum)、大腸桿菌-志賀菌群(Escherichia-Shigella)、薩特氏菌屬(Sutterella)、密螺菌屬(Treponema)等病原菌屬相對(duì)豐度降低。

使用R語(yǔ)言vegan包，通過(guò)vegdist和hclust進(jìn)行距離計(jì)算和聚類分析，對(duì)各樣本菌群相對(duì)豐度前20的屬進(jìn)行聚類分析到Heatmap(圖7)，結(jié)果表明，各樣本菌群組成差異較大，其中相對(duì)豐度最高的是乳桿菌屬、擬桿菌屬、乳球菌屬和克里斯滕森菌科R-7群。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組中乳桿菌屬、乳球菌屬、克里斯滕森菌科R-7群和另支菌屬等益生菌群的相對(duì)豐度增加，擬桿菌屬、大腸桿菌-志賀菌群、厭氧螺菌屬(Anaerobiospirillum)、彎曲桿菌屬和幽門(mén)螺桿菌屬(Helicobacter)等腸道病原菌相對(duì)豐度降低，所得結(jié)果與前述的各樣本OTUs物種注釋結(jié)果一致。

A：對(duì)照組十二指腸；B：對(duì)照組空腸；C：對(duì)照組回腸；D：對(duì)照組盲腸；E：對(duì)照組直腸；F：試驗(yàn)組十二指腸；G：試驗(yàn)組空腸；H：試驗(yàn)組回腸；I：試驗(yàn)組盲腸；J：試驗(yàn)組直腸。下圖同。A: duodenum of control group; B: jejunum of control group; C: ileum of control group; D: cecum of control group; E: rectum of control group; F: duodenum of test group; G: jejunum of test group; H: ileum of test group; I: cecum of test group; J: rectum of test group. The same as below.

圖7 各樣本屬水平微生物菌群Heatmap分析

2.3.3 肉雞腸道各部位菌群差異性分析

采用R語(yǔ)言PCA統(tǒng)計(jì)分析和作圖，對(duì)照組和試驗(yàn)組肉雞各腸道不同區(qū)段菌群的組成差異性PCA結(jié)果如圖8所示。同一腸道區(qū)段3個(gè)取樣樣本菌群能較好地聚類在一起，但2組間各對(duì)應(yīng)腸道區(qū)段樣本的菌群組成差異明顯，無(wú)法較好地聚類在一起，表明試驗(yàn)組添加菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料飼喂后其腸道菌群的組成明顯改變。另外，2組樣品的十二指腸、空腸和回腸菌群組成均較為相近，可以較好地聚類在一起，但盲腸、直腸與它們的菌群組成差異較大，無(wú)法聚類在一起。

圖8 各樣本屬水平微生物菌群PCA

2組樣品各樣本LEFSe分析表明(圖9)，共富集了13個(gè)屬菌群，其中彎曲桿菌屬、擬桿菌屬、腸球菌屬、薩特氏菌屬、罕見(jiàn)小球菌屬、大腸桿菌-志賀菌群、厭氧螺菌屬和密螺菌屬腸道常見(jiàn)病原菌群在對(duì)照組腸道樣本中的相對(duì)豐度最高，而乳球菌屬、另支菌屬、弗尼雷拉菌屬(Fournierella)、乳桿菌屬和克里斯滕森菌科R-7群在試驗(yàn)組中相對(duì)豐度最高，所得結(jié)果與前述結(jié)果基本一致。

3 討 論

近年來(lái)，菌酶協(xié)同發(fā)酵成為了生物飼料發(fā)酵技術(shù)研究的熱點(diǎn)，菌酶協(xié)同作用是微生物參與的生命活動(dòng)過(guò)程和酶參與的生物化學(xué)過(guò)程的有機(jī)結(jié)合，在協(xié)同過(guò)程中涉及到多種基質(zhì)、菌種和酶，其機(jī)理極其復(fù)雜。研究已證實(shí)，飼糧中添加菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料對(duì)畜禽的生長(zhǎng)性能具有良好的促進(jìn)作用[18-19]，但對(duì)畜禽肉品質(zhì)的影響及機(jī)理的研究報(bào)道較少。本研究表明，與對(duì)照組相比，添加菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料飼喂，肉雞肌肉的各項(xiàng)風(fēng)味物質(zhì)含量、肉品質(zhì)指標(biāo)均有明顯的增長(zhǎng)或改善。推測(cè)原因一方面是復(fù)合微生物有益菌群如乳酸菌產(chǎn)生了乳酸、脂肪酸等代謝物[20]，由畜禽吸收并進(jìn)一步沉積到肌肉中，促進(jìn)畜禽肌肉中風(fēng)味物質(zhì)的生成；另一方面，NSP的加入，飼料原料中的淀粉多糖得到了切割、分解，黏度降低，包裹的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被溶解釋放，促進(jìn)了消化吸收[21]，有利于肌苷酸、牛磺酸等一些代謝中間產(chǎn)物的風(fēng)味物質(zhì)形成；最后，發(fā)酵飼料的添加降低了肌肉中的膽固醇類物質(zhì)含量，提高了不飽和脂肪酸的含量，改善肌肉營(yíng)養(yǎng)成分，表明發(fā)酵飼料及其代謝產(chǎn)物可能可以直接或間接地參與畜禽機(jī)體內(nèi)的膽固醇、脂肪酸合成與代謝調(diào)控，進(jìn)一步影響肉雞肌肉中脂肪酸的組成，從而影響肉品質(zhì)。

圖9 各樣本微生物菌群的LEFSe分析

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表明，壓力的反應(yīng)、免疫系統(tǒng)過(guò)程和免疫反應(yīng)是試驗(yàn)組肉雞整個(gè)腸道上調(diào)差異表達(dá)基因的GO功能富集的最多的類別。KEGG富集分析表明，上調(diào)差異表達(dá)基因被注釋到162條代謝通路中，其中與新陳代謝有關(guān)11個(gè)、與免疫相關(guān)的9個(gè)，這些結(jié)果表明，菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料的添加對(duì)肉雞的氨基酸代謝、次級(jí)產(chǎn)物代謝及免疫功能產(chǎn)生了重要的影響。試驗(yàn)組在脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、嘧啶代謝、氨基酸的生物合成、嘌呤代謝等代謝通路上調(diào)差異表達(dá)，有利于肉雞氨基酸、膽固醇、?；撬岷筒伙柡椭舅岬蕊L(fēng)味物質(zhì)的形成。試驗(yàn)組添加菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料后可能激活肉雞體內(nèi)產(chǎn)生吞噬體[22]，進(jìn)而通過(guò)細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、C型凝集素受體信號(hào)通路和細(xì)胞黏附分子信號(hào)通路進(jìn)行信號(hào)傳遞[23]，刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞因子[24]，并通過(guò)增強(qiáng)甲型流感、單純皰疹病毒1型感染等病毒代謝通路免疫反應(yīng)最終起到綜合免疫作用。

雞的腸道內(nèi)多種微生物共生在宿主體內(nèi)形成了一個(gè)復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的微生物群落，對(duì)宿主健康和生產(chǎn)性能具有重要的生理學(xué)意義，主要表現(xiàn)在免疫屏障、免疫系統(tǒng)發(fā)育調(diào)節(jié)、宿主營(yíng)養(yǎng)吸收和解毒方面的作用[25]。研究表明，畜禽飼養(yǎng)中添加益生菌發(fā)酵制劑，可以起到增加腸道有益菌數(shù)量、維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)、增強(qiáng)抵抗力、降低病原菌數(shù)量、改善其生長(zhǎng)性能的功效[26-27]。本研究腸道各部位菌群的組成分析表明，肉雞腸道每1個(gè)區(qū)段都有自己獨(dú)特的菌群組成，從而發(fā)揮其不同的代謝功能，從菌群數(shù)量和種類上看，盲腸>直腸>十二指腸>回腸>空腸，其中十二指腸、回腸、空腸的菌群組成較為一致，但與盲腸、直腸的菌群組成差異較大。盲腸是肉雞中菌群數(shù)量和種類最高的腸道區(qū)段，而十二指腸由于pH低，加上胰腺和膽分泌物的抑制和稀釋作用，其菌群組成數(shù)量最少[28]。肉雞腸道各區(qū)段菌群組成從門(mén)水平上看，相對(duì)豐度最多的2個(gè)門(mén)是厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)，研究認(rèn)為兩者豐度之比(F/B)是評(píng)價(jià)畜禽腸道菌群組成的重要指標(biāo)，F(xiàn)/B增加，有利于提高厚壁菌門(mén)細(xì)菌獲取能量的能力，從而促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)[29]。沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、霍亂弧菌等變形菌門(mén)細(xì)菌在肉雞腸道內(nèi)定植會(huì)導(dǎo)致腸道感染引發(fā)腸道及腸道外疾病，是影響畜禽腸道健康的重要因素[30]。從屬水平上看，乳桿菌屬和乳球菌屬是肉雞腸道主要優(yōu)勢(shì)益生菌，其在肉雞腸道定植，產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸和抑菌因子，降低腸道pH，限制了病原菌增殖，具有預(yù)防感染和腹瀉的功效[31]?？死锼闺芌-7群、另支菌屬能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)炎癥，對(duì)某些疾病有保護(hù)作用，對(duì)調(diào)節(jié)腸道健康、促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)起到了一定的作用[32]。擬桿菌屬、腸球菌屬、彎曲桿菌屬、罕見(jiàn)小球菌屬、大腸桿菌-志賀菌群、葡萄球菌屬、幽門(mén)螺桿菌屬、厭氧螺菌屬和密螺菌屬都是畜禽腸道中常見(jiàn)的病原菌屬，如彎曲桿菌屬為空腸中的主要研究對(duì)象，是“人畜共患病”的食源性病原菌之一，常引起血液炎癥，導(dǎo)致畜禽痙攣、疼痛和腹瀉[33]；葡萄球菌屬易引起肉雞壞死性腸炎[34]；密螺菌屬細(xì)菌易引起的豬血痢[35]等。本研究證實(shí)，添加益生菌發(fā)酵飼料，試驗(yàn)組腸道各區(qū)段微生物菌群的相對(duì)豐度上升，但菌群的多樣性下降，推測(cè)原因可能是乳酸菌等益生菌的繁殖降低了腸道pH，抑制了一些腸道菌和病原菌的生長(zhǎng)，增強(qiáng)了畜禽的免疫功能[36]，所得結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)論一致。試驗(yàn)組各腸道不同區(qū)段的厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度顯著增加，擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度降低，乳桿菌屬、乳球菌屬、克里斯滕森菌科R-7群、另支菌屬相對(duì)豐度增加，擬桿菌屬、腸球菌屬、彎曲桿菌屬等肉雞腸道常見(jiàn)病原菌屬相對(duì)豐度減少，有利于改善肉雞腸道健康，保持菌群穩(wěn)態(tài)，提高免疫功能，促進(jìn)氨基酸、?；撬?、不飽和脂肪酸等代謝物的形成，最終降低畜禽腸道疾病的發(fā)病率，促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)，提高肉雞肌肉風(fēng)味品質(zhì)的含量。

4 結(jié) 論

飼糧中添加5.0%的菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料可以提高肉雞胸肌、腿肌的總氨基酸、風(fēng)味氨基酸、肌苷酸、不飽和脂肪酸等風(fēng)味物質(zhì)的含量，在轉(zhuǎn)錄組水平上加強(qiáng)氨基酸、次級(jí)產(chǎn)物及免疫功能等代謝通路基因的上調(diào)差異表達(dá)，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)、保持菌群穩(wěn)態(tài)，對(duì)病原菌免疫、調(diào)節(jié)肉雞腸道健康起到了一定的作用。