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    Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化白屈菜紅堿mPEG-PLGA納米粒處方制備工藝及其藥動學(xué)研究

    2022-12-08 07:01:22劉萬路
    中草藥 2022年23期
    關(guān)鍵詞:凍干粉藥動學(xué)水相

    劉萬路

    Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化白屈菜紅堿mPEG-PLGA納米粒處方制備工藝及其藥動學(xué)研究

    劉萬路

    威海海洋職業(yè)學(xué)院,山東 威海 264300

    Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化白屈菜紅堿單甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物(methoxy poly(ethylene glycol)-poly(lactic-co-glycolic acid,mPEG-PLGA)納米粒[chelerythrine mPEG-PLGA nanoparticles,Che@mPEG-PLGA/NPs]處方,并對最佳處方進行體外評價及體內(nèi)藥動學(xué)研究。納米沉淀法制備Che@mPEG-PLGA/NPs,以包封率、載藥量和粒徑為指標(biāo),采用單因素試驗結(jié)合Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法篩選Che@mPEG-PLGA/NPs的最佳處方。將Che@mPEG-PLGA/NPs混懸液進一步制備成凍干粉,并考察凍干粉的穩(wěn)定性和體外釋藥行為。SD大鼠分為Che原料藥組、物理混合物組和Che@mPEG-PLGA/NPs組,分別按20 mg/kg劑量ig后采血,HPLC法測定血藥濃度,計算主要藥動學(xué)參數(shù)及相對生物利用度。Che@mPEG-PLGA/NPs最佳處方為mPEG-PLGA用量572 mg、水相與有機相的體積比為2.3∶1、泊洛沙姆188用量為1.2%。Che@mPEG-PLGA/NPs的包封率為(83.49±1.59)%,載藥量為(4.61±0.14)%,粒徑為(163.93±8.02)nm。Che@mPEG-PLGA/NPs在不同pH值釋藥介質(zhì)中的體外釋藥具有明顯的緩釋特征。藥動學(xué)結(jié)果顯示,Che@mPEG-PLGA/NPs的達峰時間(max)延后至(2.12±0.46)h,半衰期(1/2)延長至(5.66±0.93)h,達峰濃度(max)增加至4.49倍,相對口服吸收生物利用度提高至4.66倍。Che@mPEG-PLGA/NPs可顯著提高Che的口服吸收生物利用度,值得進一步研究。

    白屈菜紅堿;mPEG-PLGA;納米粒;Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法;緩釋;藥動學(xué);口服生物利用度;納米沉淀法

    白屈菜紅堿(chelerythrine,Che)屬于異喹啉類苯并菲啶型生物堿,主要存在于白屈菜、博落回等中藥植物根莖中[1],具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、改善肝功能、消炎、抑菌等活性[1-3],且毒性極低[1]。另據(jù)研究結(jié)果顯示[4],Che可以通過調(diào)節(jié)SARS-CoV-2感染的關(guān)鍵信號通路,來防止過度炎癥性免疫反應(yīng),且本身獨特的抗病毒機制,使其非常有潛力成為治療新型冠狀病毒的候選藥物之一,開發(fā)價值較高。經(jīng)測定,Che在25 ℃下水中溶解度為(91.28±0.31)μg/mL,半衰期為(2.49±0.49)h[5],存在一定的首關(guān)效應(yīng)[6],導(dǎo)致口服吸收生物利用度較低(僅為13.29%)[7],臨床應(yīng)用受到較大限制。目前,Che制劑新技術(shù)研究有固體分散體[5]、脂質(zhì)體[6]、固體脂質(zhì)納米粒[8]等報道。

    將難溶性藥物制備成納米粒,可提高生物利用度及藥效等,因而在藥物制劑新技術(shù)研究中占據(jù)重要的地位。與脂質(zhì)納米粒相比,聚合物納米粒具有更高的包封率及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,且可通過結(jié)構(gòu)修飾賦予納米粒更多功能,因而具有更高的生物利用度及藥效[9],頗受醫(yī)藥研究者的重視。甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物[methoxy poly(ethylene glycol)-poly(lactic-co-glycolic acid),mPEG-PLGA]是一種兩親性嵌段共聚物,具有良好的生物相容性,作為一種優(yōu)良的藥物載體被廣泛用于醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域。已有國內(nèi)外文獻報道將其應(yīng)用于制備mPEG-PLGA納米粒[10-11],可供口服或注射給藥,有效解決了難溶性藥物溶解度和溶出度低的問題,提高生物利用度及療效等。本研究采用Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法對白屈菜紅堿-甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸納米粒(chelerythrine mPEG-PLGA nanoparticles,Che@mPEG-PLGA/NPs)進行處方研究[12],比較體外釋藥行為和口服藥動學(xué)行為,期望為Che納米制劑研究提供新策略。

    1 儀器與材料

    1260型高效液相色譜儀,DAD檢測器,美國Agilent公司;BSA224S型電子天平,賽多利斯儀器公司;KH-501型超聲儀,昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;08-2G型恒溫磁力攪拌器,上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;RC-6D型溶出儀,天津創(chuàng)興電子設(shè)備制造股份有限公司;超濾離心管,截留相對分子質(zhì)量為8000,美國Millipore公司;Talos F200S G2型透射電子顯微鏡(TEM),賽默飛儀器公司;Empyrean型X射線衍射儀,馬爾文帕納科公司;透析袋,截留相對分子質(zhì)量為8000~10 000,美國Viskae公司;Master-sizer型粒度分析儀,英國馬爾文儀器公司;FD-1D-80型真空凍干機,江蘇天翔儀器有限公司。

    Che對照品,批號110807-201009,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.9%,中國食品藥品檢定研究院;Che原料藥,批號191125,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%,南京邦諾生物科技有限公司;鹽酸小檗堿對照品,批號20201028,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.2%,成都德思特生物技術(shù)有限公司;mPEG-PLGA,相對分子質(zhì)量2000~18 000,廣州市碳水科技有限公司;海藻糖,批號190210,南京松冠生物科技有限公司;泊洛沙姆188,批號WPEE587E,德國巴斯夫有限公司;甘露醇,批號20191105,上??道噬锟萍加邢薰荆痪凵嚼骢?80,批號20191105,湖南爾康制藥有限公司;其他試劑均為分析純。

    SD大鼠,雌雄兼用,購自吉林大學(xué)動物實驗中心,許可證號:SCXK(吉)2016-007,購時周齡為6周,體質(zhì)量為(200±20)g,實驗室繼續(xù)飼養(yǎng)1周至體質(zhì)量為(240±20)g,藥動學(xué)實驗前禁食12 h。所有動物實驗遵循威海海洋職業(yè)學(xué)院有關(guān)實驗動物管理和使用的規(guī)定,均符合3R原則。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 Che@mPEG-PLGA/NPs的制備[11]

    取60 mg的Che和處方量的mPEG-PLGA溶于15 mL丙酮,超聲溶解,得有機相。配制一定濃度含有乳化劑的水溶液作為水相,在磁力攪拌速率為850 r/min條件下將有機相逐滴滴加至水相中,滴畢后繼續(xù)磁力攪拌15 min。將混懸液置于45 ℃水浴中減壓旋蒸25 min,以除盡有機溶劑,在一定功率下超聲一定時間,過0.45 μm水相微孔濾膜,補加蒸餾水至初始水相體積,即得Che@mPEG-PLGA/ NPs混懸液??瞻譵PEG-PLGA/NPs同法制備(不加Che)。

    2.2 Che@mPEG-PLGA/NPs含量測定

    2.2.1 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為1%三乙胺水溶液(稀磷酸調(diào)pH至3.2)-甲醇(70∶30);柱溫為30 ℃;體積流量為1.0 mL/min;檢測波長為264 nm;進樣體積為10 μL。理論塔板數(shù)以Che峰計不低于6500。

    2.2.2 對照品儲備液的配制 精密稱取Che對照品10 mg,置于25 mL量瓶中,甲醇溶解稀釋至刻度,即得400 μg/mL Che對照品儲備液。

    2.2.3 供試品溶液的配制 取Che@mPEG-PLGA/NPs混懸液1 mL至100 mL量瓶中,加入丙酮30 mL超聲6 min,放置30 min,甲醇稀釋至刻度線。精密量取2 mL置于10 mL量瓶中,流動相稀釋至刻度線,取適量過0.45 μm微孔濾膜,即得供試品溶液。

    2.2.4 空白對照溶液 取空白mPEG-PLGA/NPs,按“2.2.3”項下方法制備,即得空白對照溶液。

    2.2.5 專屬性考察 分別取空白對照溶液、Che對照品溶液和Che@mPEG-PLGA/NPs供試品溶液進樣,結(jié)果見圖1??芍o料不干擾Che含量測定,專屬性高。

    圖1 空白對照溶液(A)、Che對照品溶液(B)和Che@mPEG-PLGA/NPs供試品溶液(C)的HPLC圖

    2.2.6 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項對照品儲備液,采用流動相分別配制成質(zhì)量濃度為10、5、1、0.5、0.1、0.05 μg/mL的系列對照品溶液,按照“2.2.1”項色譜條件進樣測定,記錄Che的峰面積。以Che質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(),Che各質(zhì)量濃度對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(),進行線性回歸,得回歸方程為=21.049 6-0.715 8,=0.999 6,結(jié)果表明Che線性范圍為0.05~10 μg/mL。

    2.2.7 精密度考察 取質(zhì)量濃度分別為10、1、0.05 μg/mL的Che對照品溶液,各質(zhì)量濃度連續(xù)進樣6次,計算得Che峰面積RSD值分別為0.31%、0.26%、0.58%,結(jié)果表明儀器精密度良好。

    2.2.8 穩(wěn)定性考察 取Che@mPEG-PLGA/NPs供試品溶液,于制備后0、2、4、6、8、12 h進樣測定,計算得Che峰面積的RSD為1.04%,表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

    2.2.9 重復(fù)性考察 取Che@mPEG-PLGA/NPs混懸液,平行制備6份供試品溶液,進樣測定,計算得Che質(zhì)量濃度的RSD為1.71%,表明該實驗重復(fù)性良好。

    2.2.10 加樣回收率考察 取9份0.5 mL的Che@ mPEG-PLGA/NPs混懸液,分為低、中、高3組,每組均3份,分別加入400 μg/mL的對照品儲備液1、2、3 mL。按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,進樣測定,并計算Che質(zhì)量濃度及其加樣回收率。結(jié)果顯示,Che平均加樣回收率為99.26%,RSD為1.70%,結(jié)果表明該實驗加樣回收率較高。

    2.3 包封率、載藥量、粒徑及ζ電位的測定

    2.3.1 游離藥物回收率的測定[13]采用1.2%泊洛沙姆188配制Che質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL,作為游離藥物溶液。取9份0.5 mL的Che@mPEG-PLGA/NPs混懸液,分為低、中、高3組,每組3份,分別加入游離藥物溶液0.25、0.50、0.75 mL,于低溫(4 ℃)條件下10 000 r/min離心(離心半徑4 cm)30 min,取外管超濾液進HPLC測定游離Che質(zhì)量濃度,計算Che的回收率。結(jié)果顯示低、中、高3組的平均加樣回收率為101.73%,RSD為1.48%,因此方法回收率良好。

    2.3.2 包封率和載藥量的測定 取Che@mPEG-PLGA/NPs混懸液1 mL至超濾管中,于低溫(4 ℃)條件下10 000 r/min離心(離心半徑4 cm)30 min,取外管中的續(xù)濾液進行HPLC測定游離Che質(zhì)量濃度,計算含量(游離)。按“2.2.2”項下方法處理,進HPLC測定Che總質(zhì)量濃度,并計算總量(總)。精密量取5 mL納米粒混懸液置于干燥恒定質(zhì)量的稱量瓶中,預(yù)凍后冷凍干燥,稱定質(zhì)量(0),計算包封率和載藥量。

    包封率=(總-游離)/總

    載藥量=(總-游離)/0

    2.3.3 粒徑及ζ電位的測定 取Che@mPEG-PLGA/ NPs混懸液0.1 mL置于離心管中,加入4 mL蒸餾水搖勻。取適量,于粒度分析儀上測定粒徑、多分散性指數(shù)(polydispersity index,PDI)及ζ電位。

    2.4 Che@mPEG-PLGA/NPs處方單因素考察

    2.4.1 mPEG-PLGA型號的選擇 Che為60 mg,mPEG-PLGA用量為500 mg,泊洛沙姆188用量為0.8%,水相與有機相體積比為2∶1,超聲功率為300 W,超聲時間為10 min的條件下,分別考察不同mPEG-PLGA型號對包封率等考察指標(biāo)的影響,結(jié)果見表1。包封率和載藥量均隨著PLGA相對分子質(zhì)量的增加而增加,可能是由于PLGA相對分子質(zhì)量越大,載體的親水性降低,遇到水相形成的納米粒愈牢固、穩(wěn)定,故后續(xù)均選擇mPEG-PLGA(2000~18 000)來制備Che@mPEG-PLGA/NPs。

    表1 mPEG-PLGA型號的影響(,n = 3)

    2.4.2 mPEG-PLGA用量的考察 固定Che為60 mg,泊洛沙姆188用量為0.8%,水相與有機相體積比為2∶1,超聲功率為300 W,超聲時間為10 min條件下,分別考察不同mPEG-PLGA用量對包封率等考察指標(biāo)的影響,結(jié)果見表2。隨著mPEG-PLGA用量的增加,包封率先增加后減小,可能是由于體系中mPEG-PLGA用量增加可有效包載藥物,但用量過多時mPEG-PLGA之間可能會發(fā)生聚集,反而不利于包載藥物[10],導(dǎo)致包封率及載藥量下降,且粒徑也有增大趨勢,因此有必要進一步優(yōu)化其用量。

    2.4.3 水相與有機相體積比的考察 Che用量為60 mg,泊洛沙姆188用量為0.8%,mPEG-PLGA用量為500 mg,超聲功率300 W,超聲時間為10 min條件下,分別考察不同水相與有機相體積比對包封率等考察指標(biāo)的影響,結(jié)果見表3。水相較少時體系黏度較大,不利于mPEG-PLGA包裹藥物形成納米粒。隨著水相的增加,納米粒包封率先增加后減小,可能是由于隨著水相的增加,處方中表面活性劑的用量也隨之增加,進而在表面活性劑的作用下使藥物進入水相中,導(dǎo)致包封率及載藥量出現(xiàn)下降。但水相的增加有利于形成較小粒徑的Che@mPEG-PLGA/NPs。水相與有機相體積比為2∶1時納米粒各項指標(biāo)相對較好,但有必要進一步優(yōu)化。

    表2 mPEG-PLGA用量的影響(,n = 3)

    表3 水相與有機相體積比的影響(,n = 3)

    2.4.4 表面活性劑種類的考察 Che用量為60 mg,表面活性劑用量均為0.8%,mPEG-PLGA用量為500 mg,水相與有機相體積比為2∶1,超聲功率300 W,超聲時間為10 min條件下,分別考察不同表面活性劑種類對對包封率等考察指標(biāo)的影響,結(jié)果見表4。聚山梨酯-80或聚乙烯醇作為表面活性劑時各項指標(biāo)均較泊洛沙姆188差,聚乙烯醇具有一定的毒性[10],故選擇泊洛沙姆188作為制備Che@ mPEG-PLGA/NPs的表面活性劑。

    2.4.5 泊洛沙姆188用量的影響 Che用量為60 mg,mPEG-PLGA用量為500 mg,水相與有機相體積比為2∶1,超聲功率300 W,超聲時間為10 min條件下,分別考察不同泊洛沙姆188用量對納米粒包封率等考察指標(biāo)的影響,結(jié)果見表5。未加泊洛沙姆188時包封率、載藥量均較低,粒徑較大。隨著泊洛沙姆188用量的增加,包封率及載藥量均增加后減小,可能是由于泊洛沙姆188用量越大,體系的黏度越大,藥物與水相反應(yīng)變慢,影響了載體對藥物的包裹,也增加了制劑中輔料用量,使載藥量下降。另外,表面活性劑的增溶作用使藥物進入水相,最終影響了包封率及載藥量。當(dāng)泊洛沙姆188用量較低時油水之間的界面張力較大,導(dǎo)致粒徑較大,隨著用量的增加,油水界面張力下降,有利于形成粒徑較小的納米粒,但濃度過高時體系的黏度也隨之上升,反而導(dǎo)致粒徑有所變大。因此需要對泊洛沙姆188用量進行優(yōu)化。

    表4 表面活性劑種類的影響(,n = 3)

    表5 表面活性劑泊洛沙姆188用量的影響(,n = 3)

    2.4.6 超聲功率的影響 超聲的主要目的是為了降低mPEG-PLGA納米粒粒徑[13],而且適當(dāng)?shù)某曈欣趍PEG-PLGA材料包載藥物,但過大的超聲功率或過長的超聲時間會對材料造成破壞[14],從而影響包封率及載藥量,因此有必要進行考察。Che用量為60 mg,mPEG-PLGA用量為500 mg,水相與有機相體積比為2∶1,泊洛沙姆188用量為1.0%,超聲時間為10 min條件下,分別考察超聲功率對包封率等考察指標(biāo)的影響,結(jié)果見表6。當(dāng)超聲功率達到400 W時,納米粒的包封率和載藥量均下降,超聲功率達到500 W時粒徑明顯開始變大,可能是較高的超聲功率對納米粒有破壞作用所致。由于功率為300 W時納米粒各項指標(biāo)相對理想,故確定超聲功率為300 W。

    2.4.7 超聲時間的影響 Che用量為60 mg,mPEG-PLGA用量為500 mg,水相與有機相體積比為2∶1,泊洛沙姆188用量為1%,超聲功率為300 W條件下,分別考察不同超聲時間對包封率等考察指標(biāo)的影響,結(jié)果見表7。合適的超聲時間有利于mPEG-PLGA包裹藥物,但超聲時間過長反而對納米粒有破壞作用,超聲增溶作用也使藥物進入水相,最終影響包封率及載藥量等。較長的超聲時間也會使納米粒重新融合、聚集,導(dǎo)致粒徑變大。綜合考慮納米粒的各項指標(biāo),最終確定超聲時間為12 min。

    表6 超聲功率的影響(,n = 3)

    表7 超聲時間的影響(,n = 3)

    2.5 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化處方

    2.5.1 試驗設(shè)計 單因素試驗結(jié)果顯示,mPEG-PLGA用量、水相與有機相體積比和泊洛沙姆188用量對Che@mPEG-PLGA/NPs各項指標(biāo)影響較大,分別作為自變量1、2、3。對納米制劑來講,包封率和載藥量是重要參數(shù),故作為考察指標(biāo);納米粒粒徑大小可能影響制劑的生物利用度[15],因而也選為考察指標(biāo),Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法試驗設(shè)計見表8。為更直觀地評價,將包封率、載藥量和粒徑轉(zhuǎn)化為總評歸一值(overall desirability,OD),計算過程:①包封率(1)和載藥量(2)計算公式為1或2=(M-min)/(max-min);粒徑(3)計算公式為3=(max-i)/(max-min)。②OD=(12…d)1/k,為指標(biāo)數(shù)。結(jié)果見表8,其中各試驗組的包封率RSD均在0.57%~1.94%,載藥量RSD在0.13%~1.84%,粒徑RSD在0.48%~1.92%。

    2.5.2 模型的擬合、效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測 對數(shù)據(jù)擬合后得OD的2次多元回歸方程為OD=0.82+0.151+0.122+0.133-0.1112+0.2813+0.1323-0.1312-0.2322-0.2732,方差分析結(jié)果見表9,該模型的=0.019 0<0.05,說明該模型具有顯著性意義。另外,2=0.932 9,adj2=0.900 8,失擬項=0.215 1>0.05,證明該數(shù)學(xué)模型干擾小,可信度較高。因此,可采用此模型對Che@mPEG-PLGA/NPs的處方進行研究。1、3、13、22和32均具統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05、0.01)。

    三維曲面圖見圖2,Che@mPEG-PLGA/NPs最佳處方為mPEG-PLGA用量572.41 mg、水相與有機相的體積比為2.28∶1、泊洛沙姆188用量為1.17%。預(yù)測的包封率、載藥量和粒徑分別為83.67%、4.69%和160.94 nm。

    表8 Box-Behnken試驗設(shè)計結(jié)果(n = 3)

    表9 方差分析

    圖2 各自變量與響應(yīng)值的三維圖

    2.6 最佳處方工藝的確定及微觀形態(tài)觀察

    考慮到實際可操作性,調(diào)整mPEG-PLGA用量為572 mg、水相與有機相的體積比為2.3∶1、泊洛沙姆188用量為1.2%。平行制備3批Che@mPEG-PLGA/NPs,分別測定包封率、載藥量和粒徑,計算偏差[偏差=(預(yù)測值-實際值)/預(yù)測值],結(jié)果見表10。Che@mPEG-PLGA/NPs包封率、載藥量和粒徑相對偏差均小于±5%,證明采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化Che@mPEG-PLGA/NPs處方具有預(yù)測性較好,可靠性高的特點。粒徑分布圖見圖3,粒徑分布范圍在60~400 nm,PDI為0.093±0.014;ζ電位為(?23.91±1.84)mV,見圖4。

    表10 預(yù)測值和實際值的比較(,n = 3)

    取Che@mPEG-PLGA/NPs混懸液,蒸餾水稀釋50倍,滴加于帶支持膜的銅網(wǎng)上,鋪展后靜置6 min,滴加2%磷鎢酸染色,晾干,于TEM下觀察Che@mPEG-PLGA/NPs形態(tài),拍照,結(jié)果見圖5。外貌呈球形或類球形,納米粒子之間無黏連。TEM觀察到粒徑與粒度分析儀測得的粒徑存在一定的差別,這可能由于粒度分析儀測得的是水化粒子的粒徑,而TEM觀察的是干燥粒子的粒徑[16]。

    圖3 Che@mPEG-PLGA/NPs的粒徑分布

    圖4 Che@mPEG-PLGA/NPs的ζ電位

    圖5 Che@mPEG-PLGA/NPsTEM圖

    2.7 凍干粉的制備

    取Che@mPEG-PLGA/NPs混懸液加入6%的凍干保護劑(海藻糖-甘露醇1∶1),搖勻至溶解澄清,置于溫度為?30 ℃的超低溫冰箱中預(yù)凍2 d。迅速置于初始溫度為?30 ℃冷凍干燥機中,抽真空,進行低溫凍干1 d,然后緩慢回復(fù)常壓,取出凍干粉,立即密封,置于干燥器中保存。所得凍干粉外觀飽滿,色澤均一。凍干前后外觀見圖6。

    取適量凍干粉蒸餾水復(fù)溶,測得包封率略下降至(82.64±1.41)%,粒徑增長至(172.64±9.13)nm,ζ電位為(?22.86±1.72)mV。

    圖6 Che@mPEG-PLGA/NPs(A)及凍干粉外觀(B)

    2.8 體外釋藥行為研究及模型擬合

    取Che@mPEG-PLGA/NPs凍干粉,使Che含量均為30 mg,加入空白釋藥介質(zhì)5 mL,制備混懸液并置于透析袋中,兩端扎緊。釋放介質(zhì)為900 mL的pH 6.8緩沖鹽水溶液,介質(zhì)溫度(37±1)℃,轉(zhuǎn)速為75 r/min,分別于0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24、36 h取樣3 mL,并補加3 mL空白釋放介質(zhì)。各樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過,按照“2.2.1”項色譜條件,進樣測定Che質(zhì)量濃度。同法考察Che@mPEG-PLGA/NPs凍干粉在pH 1.2鹽酸水溶液和pH 7.4緩沖鹽水溶液的釋藥情況,結(jié)果見圖7。Che@mPEG-PLGA/NPs在3種不同pH值介質(zhì)中均呈現(xiàn)兩相特征,0~4 h時間段釋藥相對較快,而在4~36 h呈現(xiàn)緩釋特征。Che@ mPEG-PLGA/NPs凍干粉在pH 1.2鹽酸水溶液、pH 6.8緩沖鹽水溶液和pH 7.4緩沖鹽水溶液中36 h的累積釋放率分別為75.25%、70.09%、68.93%。Che@ mPEG-PLGA/NPs在pH 1.2鹽酸水溶液中的釋藥速率快于pH 6.8緩沖鹽水溶液和pH 7.4緩沖鹽水溶液[10]。分別采用零級、一級、Higuchi和Weibull模型對Che@mPEG-PLGA/NPs在3種不同pH值介質(zhì)體外釋藥進行擬合,并采用擬合相關(guān)系數(shù)(2)作為判斷依據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在3種不同pH值介質(zhì)體外釋藥過程均與Weibull模型擬合度最高。其中在pH 1.2鹽酸水溶液中Weibull擬合方程為lnln[1/(1-M/¥)]=0.384 2 ln-1.014 3,2=0.975 2,在pH 6.8磷酸水溶液中Weibull擬合方程為lnln[1/(1-M/¥)]=0.398 4 ln-1.206 1,2=0.988 6,在pH 7.4磷酸水溶液中Weibull擬合方程為lnln[1/(1-M/¥)]=0.429 0 ln-1.347 4,2=0.991 2。代表時間,M為時間累積釋放度,¥為¥時間累積釋放度,M/¥為時間累積釋放率。

    圖7 Che@mPEG-PLGA/NPs體外釋放曲線(,n = 6)

    2.9 晶型研究

    X射線粉末衍射法(X-ray powder diffraction,XRPD)對Che@mPEG-PLGA/NPs凍干粉作晶型分析,取Che原料藥、空白輔料、物理混合物(Che和輔料比例與Che@mPEG-PLGA/NPs凍干粉一致)和Che@mPEG-PLGA/NPs凍干粉適量進行掃描。條件為Cu-Kα靶,掃描角度(2)為3°~45°,速度為5°/min,見圖8。Che原料藥在7.8°、9.6°、10.0°、14.6°、16.1°、25.8°、26.7°等處出現(xiàn)明顯的晶型峰。由于輔料的掩蔽作用,Che在物理混合物中僅可觀察到在7.8°、9.6°、16.1°、25.8°、26.7°的晶型峰,說明Che在物理混合物中仍是晶型物質(zhì)。但Che@mPEG-PLGA/NPs凍干粉的XRPD圖譜中,未見Che原料藥的任何晶型峰,說明Che在凍干粉轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定型物質(zhì)。

    2.10 凍干粉穩(wěn)定性考察 前期考察發(fā)現(xiàn),未凍干的Che@mPEG-PLGA/NPs混懸液在第10天即可觀察到沉淀,說明未凍干時穩(wěn)定性較差,故將其制備成凍干粉來改善穩(wěn)定性。取制備的Che@mPEG- PLGA/NPs凍干粉,密封,置于恒溫恒濕箱中(溫度30 ℃,濕度55%),分別于0、10、20、30、40、60、90 d取樣,測定包封率、粒徑和ζ電位,結(jié)果見表11。結(jié)果顯示,Che@mPEG-PLGA/NPs凍干粉各個指標(biāo)波動較小,穩(wěn)定性得到明顯改善。

    圖8 Che@mPEG-PLGA/NPs凍干粉(A)、物理混合物(B)、空白輔料(C)和Che原料藥(D)的XRPD結(jié)果

    表11 穩(wěn)定性試驗結(jié)果(,n = 3)

    2.11 口服藥動學(xué)研究

    2.11.1 實驗方案 取Che、物理混合物(Che和輔料比例同Che@mPEG-PLGA/NPs)和Che@mPEG-PLGA/NPs凍干粉適量,加入0.5%的CMC-Na水溶液配制灌胃液,臨用現(xiàn)配。取禁食12 h的健康SD大鼠18只,拋幣法隨機分成3組,每組6只,對每只大鼠進行稱定質(zhì)量,ig劑量均為20 mg/kg,計時,于0.167、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12 h,Che@mPEG-PLGA/NPs取血點延長至18 h,各點均取血約0.2 mL,引流至肝素化EP管中,4000 r/min離心3 min,取血漿于?20 ℃保存。

    2.11.2 血漿樣品的制備[6]取解凍后的血漿樣品100 μL至5 mL的EP管中,加入20 μL鹽酸小檗堿內(nèi)標(biāo)溶液(質(zhì)量濃度為1200 ng/mL)和甲醇0.5 mL(沉淀蛋白),渦旋混勻得混懸液,繼續(xù)加入2 mL氯仿進行提取,渦旋2 min。10 000 r/min離心5 min(溫度為?4 ℃,離心半徑4 cm),取上清液于40 ℃水浴中氮氣吹干后得殘渣,加入甲醇100 μL復(fù)溶,繼續(xù)10 000 r/min離心5 min(溫度為?4 ℃),即得血漿樣品溶液。

    2.11.3 血漿對照品的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線 取鹽酸小檗堿對照品,甲醇配制成1200 ng/mL作為藥動學(xué)研究用內(nèi)標(biāo)溶液。取Che對照品,用甲醇配成2500、2000、1000、500、100、50 ng/mL,各質(zhì)量濃度分別量取100 μL于40 ℃水浴中氮氣吹干后得殘渣,加入100 μL空白血漿,渦旋混勻,后續(xù)按“2.11.2”項方法處理后進HPLC。以Che與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)(),Che質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(),得血漿對照品回歸方程為=0.033 8-0.379 2,相關(guān)系數(shù)()=0.996 2,線性范圍為50~2500 ng/mL。

    2.11.4 方法學(xué)驗證 取空白血漿、血漿對照品溶液和血漿樣品,進樣測定,考察該色譜條件的專一性,結(jié)果見圖9??梢姡獫{內(nèi)源性物質(zhì)未對內(nèi)標(biāo)及Che色譜峰產(chǎn)生干擾,專屬性高。

    圖9 空白血漿(A)、血漿對照品溶液(B)、血漿樣品(C)的HPLC圖

    取Che質(zhì)量濃度為50(低)、1000(中)、2500 ng/mL(高)的血漿對照品溶液,各質(zhì)量濃度連續(xù)進樣6次,計算得Che和內(nèi)標(biāo)峰面積比值RSD分別為7.05%、4.11%、6.30%,因此日內(nèi)精密度良好。

    低、中、高質(zhì)量濃度每天進樣1次,連續(xù)測定6 d,測定Che和內(nèi)標(biāo)峰面積,計算得兩者比值的RSD分別為8.04%、4.79%、6.28%,因此日間精密度良好。

    取血漿樣品分別于0、2、4、8、12、24 h進樣,測定Che和鹽酸小檗堿的峰面積,計算得兩者比值的RSD為9.27%,因此血漿樣品穩(wěn)定性良好。

    取50(低)、1000(中)、2500 ng/mL(高)Che的對照品溶液各100 μL,共3組,于40 ℃水浴中氮氣吹干后得殘渣,加入空白血漿100 μL,渦旋混勻,按“2.11.2”項方法操作,進樣,測定Che和內(nèi)標(biāo)峰面積,兩者比值帶入方程=0.033 8-0.379 2計算測得Che質(zhì)量濃度,與實際質(zhì)量濃度比較得出回收率。結(jié)果顯示,平均回收率為94.07%(=9),RSD為6.91%,說明回收率較高。

    取質(zhì)量濃度為50 ng/mL血漿對照品溶液(不含內(nèi)標(biāo))逐步稀釋后進樣測定,以信噪比為10作為定量限,信噪比為3作為檢測限,結(jié)果顯示Che的定量限和檢測限分別為5.0、2.5 ng/mL。

    2.11.5 藥動學(xué)結(jié)果 采用3P97軟件對各組數(shù)據(jù)進行處理,采用非參數(shù)法秩和對達峰時間(max)及半衰期(1/2)檢驗,峰濃度(max)和曲線下面積(AUC)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行獨立樣本檢驗。Che、物理混合物和Che@mPEG-PLGA/NPs藥動學(xué)曲線見圖10,主要藥動學(xué)參數(shù)見表12。

    Che和輔料的物理混合物主要藥動學(xué)參數(shù)與Che原料藥相比無統(tǒng)計學(xué)意義(>0.05),說明輔料在一定程度上影響了Che的口服吸收,但影響并不顯著。Che@mPEG-PLGA/NPs的max延后至(2.12±0.46)h,1/2延長至(5.66±0.93)h,max增加至4.49倍,均具有極顯著性差異(<0.01),相對口服吸收生物利用度提高至4.66倍(與Che相比)??梢?,處方中的輔料具有一定的促吸收作用(>0.05),但Che@mPEG-PLGA/NPs對Che藥動學(xué)行為影響更大,促吸收作用顯著。

    3 討論

    本研究采用mPEG-PLGA作為納米載體,保留了PLGA載體的相容性好、安全性高等優(yōu)勢[17-18],經(jīng)mPEG修飾后彌補了PLGA疏水性強的缺陷。楊錦等[2]采用mPEG-PLGA(2000~15 000)制備了mPEG-PLGA納米粒,其包封率(80.18±1.11)%低于采用mPEG-PLGA(2000~18 000)制得的納米粒,且表面活性劑用量(1.8%)較大,可能存在一定的安全隱患,可見mPEG-PLGA型號的選擇較為重要,可能會影響處方中其他輔料的用量。mPEG-PLGA納米粒的粒徑一般較PLGA納米粒低,可能是由于mPEG修飾后增加了聚合物載體的親水性,在形成納米粒時與水相之間的表面張力下降所致[17]。但mPEG-PLGA納米粒的ζ電位絕對值往往不高,可能是由于納米粒表面的mPEG接枝具有屏蔽作用所致[11],故本研究將其制備成凍干粉來增加Che@ mPEG-PLGA/NPs的穩(wěn)定性。

    圖10 藥-時曲線(,n = 6)

    表12 藥動學(xué)參數(shù)(,n = 6)

    與Che比較:**<0.01;與物理混合物比較:##<0.01

    **< 0.01Che bulk drug;##< 0.01physical mixture

    在一定范圍內(nèi)的mPEG-PLGA載體用量及水相與有機相體積比會影響體系黏度,進而對包封率產(chǎn)生影響,分析原因可能是由于體系黏度較高時不利于mPEG-PLGA材料在溶劑中充分舒展[19],從而影響載體mPEG-PLGA和Che的聚合幾率及速度。較大的水相體積導(dǎo)致包封率較低,可能是由于水相體積較大時增加了表面活性劑用量,在其增溶作用下促使Che進入水相[13],從而影響了包封率。但較大的水相比例制得的納米粒粒徑較小,可能是由于水相體積較大時可降低體系黏度,納米粒更易分散,減少融合或聚合幾率,從而有助于降低粒徑。結(jié)合單因素考察結(jié)果,選擇mPEG-PLGA用量優(yōu)化區(qū)間為400~600 mg,水相與有機相體積比優(yōu)化區(qū)間為1∶1~3∶1。泊洛沙姆188用量也會影響Che@ mPEG-PLGA/NPs的各項指標(biāo),可能是由于當(dāng)其濃度較低時乳化能力有限,影響制劑的粒徑;濃度過大時不僅影響制劑的安全性,也會因增溶作用最終對包封率及載藥量造成影響,故也選為主要因素之一,結(jié)合單因素考察結(jié)果選擇優(yōu)化區(qū)間為0.6%~1.4%。

    Che@mPEG-PLGA/NPs體外釋藥過程分為2個階段,即快速釋藥期和緩慢釋藥期。納米制劑中的游離藥物與納米藥物存在交換平衡,如將游離藥物除去不僅可能會打破兩者之間的平衡,進而影響制劑的穩(wěn)定性,也可能破壞mPEG-PLGA納米粒的結(jié)構(gòu),故未將游離藥物除去。由于未除去的游離藥物快速釋放,另一方面分散于納米粒淺表層藥物釋放相對容易,因而產(chǎn)生了快速釋藥期。包裹于mPEG-PLGA納米粒內(nèi)部藥物釋放出去需經(jīng)歷載體材料的溶蝕后才能緩慢擴散出去,釋藥相對困難,故出現(xiàn)了緩慢釋藥期,這種釋藥方式很可能會改變Che原料藥的藥動學(xué)行為[9,19-20]。

    藥動學(xué)結(jié)果顯示,Che@mPEG-PLGA/NPs的max發(fā)生極顯著性延后,可能與Che@mPEG-PLGA/NPs本身具有緩釋特征有關(guān)[21];其1/2延長至(5.66±0.93)h,極顯著性增加了藥物的消除半衰期,增加了體內(nèi)循環(huán)時間,從而利于增加生物利用度及提高藥效;max增加至4.49倍,可能是由于mPEG增加了納米粒子的親水性,減弱了黏液中黏蛋白對藥物的靜電吸引[22-23],利于Che@mPEG-PLGA/NPs能夠透過黏液層達到上皮細(xì)胞,進而進入體循環(huán)。Che在胃腸道中容易被代謝[7],制備成Che@mPEG-PLGA/NPs后降低了胃腸道對Che的破壞幾率,提高了藥物的穩(wěn)定性;Che@mPEG-PLGA/NPs粒徑較小,更易于通過派伊爾氏結(jié),實現(xiàn)高效吸收[10, 24],最終使max及相對口服吸收生物利用度得到明顯提高。本研究完成了Che@mPEG-PLGA/NPs處方工藝研究,重復(fù)性良好。凍干粉在90 d內(nèi)穩(wěn)定性較好,體外釋藥具有明顯的緩釋特征。Che以無定形狀態(tài)存在于Che@mPEG-PLGA/NPs凍干粉中,且口服吸收生物利用度得到顯著提高。今后繼續(xù)對Che@mPEG-PLGA/NPs的注射藥動學(xué)、組織分布、藥效學(xué)等展開研究[25-26],進一步豐富研究資料,為Che新型納米制劑研發(fā)提供借鑒。

    志謝 本研究由山東省職業(yè)教育欒會妮名師工作室資助(2019)

    利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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    Formulation optimization of chelerythrine-mPEG-PLGA by Box-Behnken design-response surface method and oral pharmacokinetics study

    LIU Wan-lu

    Weihai Ocean Vocational College, Weihai 264300, China

    Box-Behnken design-response surface method was employed to optimize the formulation of chelerythrine methoxy poly(ethylene glycol)-poly(lactic-co-glycolic acid (mPEG-PLGA) nanoparticles (Che@mPEG-PLGA/NPs), and carry outevaluation and oral pharmacokinetics study of optimal prescriptions.Nano-precipitation method was employed to prepare Che@mPEG-PLGA/NPs. Encapsulation rate, drug loading and particle size were used as evaluation indexes, single factor investigation method combined with Box-Behnken response surface design method was combined to investigate the optimal prescriptions of Che@mPEG-PLGA/NPs, and then its lyophilized powder was prepared. Stability and release behaviorof lyophilized powder was investigated. SD rats were divided into Che suspension, physical mixture and Che@mPEG-PLGA/NPs groups, blood samples were collected after gastric administration at a dose of 20 mg/kg. The plasma concentrations were determined by HPLC, main pharmacokinetic parameters and relative bioavailability were calculated.The optimal formulation of Che@ mPEG-PLGA/NPs: mPEG-PLGA dosage was 572 mg, water phase to organic phase volume ratio was 2.3∶1 and concentration of poloxamer 188 was 1.2%. Envelopment efficiency, drug loading and particle size of Che@mPEG-PLGA/NPs were (83.49 ± 1.59)%, (4.61 ± 0.14)% and (163.93 ± 8.02) nm. Drug releasehad obvious sustained-release characteristics in different pH dissolution media. Pharmacokinetic results showed thatmaxof Che@mPEG-PLGA/NPs was delayed to (2.12 ± 0.46) h,1/2was prolonged to (5.66 ± 0.93) h,maxwas increased to 4.49 times and relative oral bioavailability was enhanced to 4.66 times.Che@mPEG-PLGA/NPs can significantly improve the oral bioavailability of Che, which was worthy of further study.

    chelerythrine; mPEG-PLGA; nanoparticles; Box-Behnken design-response surface method; sustained release; pharmacokinetic; oral bioavailability; nano-precipitation method

    R283.6

    A

    0253 - 2670(2022)23 - 7361 - 11

    10.7501/j.issn.0253-2670.2022.23.006

    2022-08-29

    國家自然科學(xué)青年基金資助項目(51804021)

    劉萬路(1981—),男,碩士,講師,研究方向為現(xiàn)代給藥系統(tǒng)。Tel: (0631)7697687 E-mail: liuwanlu2010@126.com

    [責(zé)任編輯 鄭禮勝]

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