強(qiáng)力枇杷露微生物限度檢查方法的驗(yàn)證試驗(yàn)

汪正宇

安徽省宿州市食品藥品檢驗(yàn)所，安徽 宿州 234000

藥物研究

強(qiáng)力枇杷露微生物限度檢查方法的驗(yàn)證試驗(yàn)

汪正宇

安徽省宿州市食品藥品檢驗(yàn)所，安徽 宿州 234000

目的：建立強(qiáng)力枇杷露微生物限度檢查的方法驗(yàn)證。方法：按2010年版 《中華人民共和國藥典》，用大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉菌和白色念珠菌對(duì)強(qiáng)力枇杷露微生物限度檢查法進(jìn)行方法學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果：強(qiáng)力枇杷露對(duì)大腸埃希菌無抑菌作用或抑菌作用較弱。結(jié)論：強(qiáng)力枇杷露的細(xì)菌、霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)方法采用常規(guī)法，控制菌檢查采用常規(guī)法檢驗(yàn)，該方法用于強(qiáng)力枇杷露的質(zhì)量控制有效可行。

強(qiáng)力枇杷露；微生物限度檢驗(yàn)法；方法驗(yàn)證

強(qiáng)力枇杷露是由枇杷葉、罌粟殼、百部、白前、桑白皮、桔梗、薄荷腦等中藥制備的口服復(fù)方制劑，具有養(yǎng)陰斂肺，鎮(zhèn)咳祛痰的功效［1］。2010年版 《中國藥典》附錄ⅫⅠC微生物限度檢驗(yàn)方法中規(guī)定，藥品的微生物限度檢驗(yàn)方法必須進(jìn)行方法驗(yàn)證，確證供試液制備、測(cè)定方法及檢測(cè)系統(tǒng)適用于該藥品的檢驗(yàn)，從而保證微生物限度檢驗(yàn)方法的科學(xué)性和檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文參照2010年版 《中國藥典》［2］、《中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》［3］進(jìn)行試驗(yàn)，建立強(qiáng)力枇杷露的微生物限度檢驗(yàn)方法并進(jìn)行方法驗(yàn)證，結(jié)果表明常規(guī)法適用于細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)檢查，控制菌檢查采用常規(guī)法。

1 儀器與材料

1.1 試驗(yàn)環(huán)境 根據(jù)2010年版《中國藥典》規(guī)定，試驗(yàn)在環(huán)境潔凈度10000級(jí)，局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣的無菌室進(jìn)行，陽性菌操作在符合國家Ⅱ級(jí)生物安全標(biāo)準(zhǔn)的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 BHC－1300ⅡA2型生物安全柜（蘇州蘇凈儀器自控設(shè)備有限公司）；GHP－9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海金慧科電子有限公司）；MJX－160B－Z型微電腦霉菌培養(yǎng)箱 （上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；DYXDHS型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 （上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；YXQ－LS－75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海市博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；TZQ－Ⅱ型勻質(zhì)器型號(hào) （天津市津德實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)開發(fā)中心）。

1.3 供試品 強(qiáng)力枇杷露（批號(hào)：20140609、20140610、20140611，安徽省雪楓藥業(yè)有限公司）。

1.4 驗(yàn)證菌種 大腸埃希菌［Escherichia coli，CMCC（B）44 102］、枯草芽孢桿菌［Bacillus subtilis，CMCC（B）63 501］、金黃色葡萄球菌［Staphylococcus aureus，CMCC（B）26 003］、白色念珠菌［Candida albicans，CMCC（F）98 001］由中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心提供；黑曲霉［Aspergillus niger，CMCC（F）98 003］由中國藥品生物制品檢定所提供。試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)為3代。

1.5 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：121130）、玫瑰紅鈉瓊培養(yǎng)基 （批號(hào)：110811）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 （批號(hào)：110406）、改良馬丁培養(yǎng)基（批號(hào)：130227）、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)氧基（EMB，批號(hào)：1110102）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號(hào)：1111162）、4－甲基傘形酮葡糖苷酸（MUG，批號(hào)：1110102）均由北京三藥科技開發(fā)公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌懸液的制備 黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸埃希菌置營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) （培養(yǎng)條件為33℃培養(yǎng)24小時(shí)），各取上述培養(yǎng)物1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋法稀釋至10－5、10－6、10－7，備用；白色念珠菌置改良馬丁液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) （培養(yǎng)條件為25℃培養(yǎng)24小時(shí)），取上述培養(yǎng)物1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋法稀釋至10－5、10－6、10－7，備用；黑曲霉置改良馬丁液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) （培養(yǎng)條件為25℃培養(yǎng)1周），取上述培養(yǎng)物5ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫黑曲霉孢子，吸取孢子菌懸液 （經(jīng)無菌棉花過濾）1ml，用10倍稀釋法稀釋至10－6，備用。

2.2 菌懸液中含菌量檢驗(yàn) 取“2.1”中枯草芽孢桿菌10－5級(jí)稀釋液1m l放入已滅菌的培養(yǎng)皿中，用45℃無菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基20ml注培養(yǎng)皿，且平行測(cè)定兩皿，33℃培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)；取10－7級(jí)金黃色葡萄球菌、10－7級(jí)大腸埃希菌分別注培養(yǎng)皿培養(yǎng)，方法及培養(yǎng)條件同枯草芽孢桿菌。取“2.1”中白色念珠菌10－5級(jí)稀釋液和10－6級(jí)黑曲霉孢子菌懸液各1ml放入已滅菌的培養(yǎng)皿中，用低于45℃玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基20ml注培養(yǎng)皿，25℃培養(yǎng)5d，逐日觀察計(jì)數(shù)。根據(jù)2010年版 《中國藥典》規(guī)定，細(xì)菌、霉菌和酵母菌方法驗(yàn)證所用菌懸液含菌量應(yīng)為50～100 cfu／ml；控制菌方法驗(yàn)證所用菌懸液含菌量為10～100 cfu／m l。結(jié)果見表1，符合要求。

2.3 供試液制備 取本品最小包裝兩瓶，按微生物限度檢查法規(guī)定稱取10g，加pH7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100mL，混勻，即為1∶10的供試品溶液。

2.4 細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證 （平皿法）

2.4.1 試驗(yàn)組 取1∶10供試液1ml和金黃色葡萄球菌10－7級(jí)菌懸液1m l，注入同一無菌培養(yǎng)皿中，立即傾注低于45℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約20m l，待凝固后置于33℃陽性細(xì)菌培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～72h，逐日觀察結(jié)果并記錄?？莶菅挎邨U菌、大腸埃希菌的驗(yàn)證同金黃色葡萄球菌的實(shí)驗(yàn)方法。取1∶10供試液1m l，白色念珠菌10－5級(jí)菌懸液1ml，注入無菌培養(yǎng)皿，立即傾注45℃無菌玫瑰紅鈉培養(yǎng)基20m l，待凝固后置于25℃陽性霉菌培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5d，逐日觀察結(jié)果并記錄。黑曲霉的驗(yàn)證同白色念珠菌的實(shí)驗(yàn)方法。

2.4.2 菌液組 取金黃色葡萄球菌10－7級(jí)、枯草芽孢桿菌10－5級(jí)和大腸埃希菌10－7級(jí)菌懸液各1ml，分別注入培養(yǎng)皿中，立即傾注低于45℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，置33℃細(xì)菌陽性培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～72h，逐日觀察結(jié)果并記錄。取白色念珠菌10－5級(jí)和黑曲霉10－6級(jí)菌懸液各1ml，分別注入平皿，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后置25℃霉菌陽性培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，逐日觀察結(jié)果并記錄。

2.4.3 供試品對(duì)照組 取1∶10供試液1ml，注入平皿，立即傾注低于45℃無菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基置于33℃培養(yǎng)24～72h，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基置25℃培養(yǎng)5d，逐日觀察結(jié)果并記錄。

2.4.4 試驗(yàn)結(jié)果 由表2可知，3次平行試驗(yàn)大腸埃細(xì)菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉的試驗(yàn)組回收率均均大于70%，根據(jù)2010年版《中國藥典》的要求可以確定常規(guī)法作為檢查方法。

2.5 控制菌 （大腸埃希菌）檢查方法驗(yàn)證 （常規(guī)法）

2.5.1 試驗(yàn)組 取已滅菌的裝有100m l膽鹽乳糖培養(yǎng)基的三角瓶一瓶，用無菌移液槍加入1：10供試液10m l，10－7級(jí)大腸埃希菌菌懸液10ml，放置于35℃陽性培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，按大腸埃細(xì)菌的檢查法檢查。

2.5.2 供試品組 取1：10供試液10ml加入100ml無菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，放置于培養(yǎng)箱 （35℃）中培養(yǎng)24h，按大腸埃細(xì)菌的檢查法檢查。

2.5.3 陽性對(duì)照組 取規(guī)定量的大腸埃希菌加入到100ml無菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，放置于陽性培養(yǎng)箱 （35℃）中培養(yǎng)24h，按大腸埃希菌的檢查法檢查。

2.5.4 陰性對(duì)照組 取稀釋液10ml加入100m l無菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，放置于培養(yǎng)箱 （35℃）中培養(yǎng)24h，按大腸埃希菌的檢查法檢查。

2.5.5 陰性菌對(duì)照組 陰性對(duì)照菌采用金黃色葡萄球菌，方法同試驗(yàn)組。

2.5.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表3可知，大腸埃希菌陽性組、試驗(yàn)組生長(zhǎng)良好，說明強(qiáng)力枇杷露對(duì)大腸埃希菌無抑菌作用或抑菌作用較弱，可以采用常規(guī)法檢查。

3 討論

由上述驗(yàn)證結(jié)果可知，可以采用常規(guī)法對(duì)細(xì)菌、霉菌及酵母菌進(jìn)行檢查；控制菌大腸埃希菌可采用常規(guī)法檢驗(yàn)。

由于方法驗(yàn)證中陽性菌會(huì)造成環(huán)境污染，所以必須嚴(yán)格按照2010年版 《中國藥典》附錄中方法驗(yàn)證的規(guī)定，在陽性室的生物安全柜內(nèi)操作，做好防護(hù)措施。同時(shí)供試品組及陰性對(duì)照組應(yīng)在符合規(guī)定的潔凈室內(nèi)操作。

方法驗(yàn)證需進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，為使結(jié)果獲得良好的重現(xiàn)性，所加的培養(yǎng)基體積應(yīng)盡量一致，培養(yǎng)基與所加試液應(yīng)充分混合均勻。

菌落計(jì)數(shù)是方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)過程中極為重要的一步，因此計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)仔觀察，必要時(shí)可借助放大鏡等工具，排除藥渣和小氣泡的干擾，減少操作誤差。

［1］南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典 ［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：833－853.

［2］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典 （一部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：107－116.

［3］中國藥品生物制品檢定所，中國藥品檢驗(yàn)總所.中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社.2010：351－369.

Research on the determination of Validation method for microbiallimits test of Strong Loquat Syrup

WANG Zhengyu
Anhui Suzhou Institute for Food and Drug Control，Suzhou 234000，China

ObjectiveTo establish microbial limit test for Compound Yangjiao Granule.MethodEscherichia coli，Bacillu Subtilis，Staphy lococcus aureus，Aspergillus niger and Candida albicans were taken as the indexes，microbial limit tese for Strong Loquat Syrup was performed according to Chinese Pharmacopoeia of 2010 version.ResultStrong Loquat Syrup had no inhibitorg effect on Escherichia coli，or the inhibitorg effectwas weak.ConclusionIt is effective and feasible that bacteria，filamentons fungi and yeast countwere detected with common method；Themethod is practicable and could be used for quality control for Strong Loquat Syrup.

Strong Loquat Syrup；microbial limits test；method validation

R284.1

A

1007－8517（2015）16－0011－02

2015.05.08）