外泌體研究的方法學(xué)進(jìn)展

江晗，謝新暉，榮晗(通信作者)

(1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院精神衛(wèi)生學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272067；2.深圳市精神衛(wèi)生中心/深圳市康寧醫(yī)院，廣東 深圳 518020；3.武漢大學(xué)人民醫(yī)院精神科，湖北 武漢 430060)

0 引言

1 樣本的收集和處理

外泌體(Extracellular Vesicles，EV) 是胞內(nèi)多泡體與質(zhì)膜融合后，釋放到細(xì)胞外的納米級(jí)小囊泡，粒徑在30-150nm、具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)[1]。EV 在機(jī)體內(nèi)廣泛存在，包裹并運(yùn)輸脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸及代謝物等，參與細(xì)胞間通訊、物質(zhì)傳遞和免疫互作[2]。正是由于這些原因，外泌體被廣泛研究用于多種疾病的診斷和治療[3]。在此，我們將從以下幾個(gè)方面討論目前關(guān)于EV 的研究方法。我們將重點(diǎn)關(guān)注外周血中的EV，因?yàn)檠阂子讷@取、可常規(guī)分離且是與人體多種疾病最相關(guān)的體液。

1.1 血液采集

實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)血液采集可應(yīng)用于EV 研究。對(duì)于采集血液的受試者，年齡、晝夜節(jié)律周期和性別等變量有待研究，但在實(shí)踐可行的情況下，一般要求選取隔夜空腹血[4]。血漿通常是首選來源，因?yàn)樵谥苽溲鍟r(shí)，形成血凝塊期間會(huì)釋放額外的EV[5]。要制備血漿，血液需要抗凝。在選擇抗凝血?jiǎng)r(shí)，應(yīng)考慮離體采集的血液樣本中EV 釋放的抑制程度和預(yù)期的下游分析。目前有多種抗凝劑可供選擇，如EDTA、氟化鈉、草酸鉀、檸檬酸鹽等。其中，檸檬酸鹽(最終濃度為 0.109 mol/L)是最常用的抗凝劑，已被國際血栓與止血學(xué)會(huì)推薦[6]。

1.2 血漿制備

為了獲得血漿，需要對(duì)抗凝血液進(jìn)行離心處理，以去除紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板[7]。由于單次離心步驟后仍有少量血小板存在，血小板在激活時(shí)會(huì)釋放EV，并且在冷凍-解凍循環(huán)中碎裂，因此建議進(jìn)行兩次離心制備無血小板血漿(PFP)[8,9]。

1.3 培養(yǎng)基

從條件化細(xì)胞培養(yǎng)基中也可以分離EVs。如果細(xì)胞不能在無血清培養(yǎng)基中生長，專用生物反應(yīng)器可能是一種替代解決方案[10,11]。

1.4 存儲(chǔ)

為了防止冰晶的形成和減少低溫沉淀，將血漿樣本在液氮中速凍，在80℃或低于80℃的溫度下儲(chǔ)存，并在37℃下解凍[12]。在冷凍-解凍循環(huán)和儲(chǔ)存期間，血漿中的EV 被證明似乎是穩(wěn)定的[8]。

2 外泌體的分離

血液是最常研究的體液，也是最復(fù)雜的體液，不僅含有EV，還含有細(xì)胞、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸[13]。要從血液中研究EV，通常需要先分離EV。不同的生物物理和生物化學(xué)特性可用于分離 EV，包括大小、密度、形狀、電荷和抗原暴露等。

2.1 差速離心

差速離心法(DC)是根據(jù)顆粒大小和密度，通過依次增加離心速度(顆粒細(xì)胞和碎片<1500g、稍 大EV 為10 000-20 000g、較 小EV 為100 000-200 000g)的方法來分離外泌體[14]。盡管DC 應(yīng)用廣泛，但它仍有很大的局限性。首先，DC 無法單獨(dú)通過大小實(shí)現(xiàn)EV 的絕對(duì)分離，因?yàn)镋V 沉降速率取決于相對(duì)于介質(zhì)的形狀和質(zhì)量密度[14]。其次，DC 可能導(dǎo)致EV 聚集[15]，并且非EV 組分如蛋白質(zhì)聚集物等可能會(huì)在最后的超速離心過程中破壞EV[16]。最后，DC 報(bào)告的EV 回收率在2%至80%之間，這使得研究間的可比性值得懷疑。

2.2 密度梯度離心

密度梯度離心法(DEG) 的原理是根據(jù)大小和質(zhì)量密度(自上而下梯度)，或僅取決于質(zhì)量密度(自下而上梯度)。碘克沙醇是最常用的用于分離EV 的密度介質(zhì)，因其具有等滲性、惰性、無毒且粘性較小[17]。通常，DGC 制備的 EV 不含蛋白質(zhì)污染物，但其產(chǎn)量較低，EV 回收率僅有10%至50%，且費(fèi)力、耗時(shí)，這妨礙了其在臨床環(huán)境中的使用。

2.3 尺寸排阻色譜法

尺寸排阻色譜法(SEC)在單個(gè)色譜柱上實(shí)現(xiàn)了基于物質(zhì)大小的分離[18]。SEC 可去除 99%的可溶性血漿蛋白和大于95%的高密度脂蛋白(HDL)，不誘導(dǎo)EV 的聚集，并保持EV 的完整性和生物活性[19-21]。通過使用SEC，可獲得40% 至90% 的EV 回收率[22]。此外，SEC 速度快，每份樣品只需10 至20min，且相對(duì)便宜[23]，這使得 SEC 在臨床上比較適用。

2.4 超濾

超濾可將EV 與可溶性成分分離。要使可溶性組分通過過濾器，需施加壓力，或?qū)⑦^濾器置于(超)離心機(jī)中。由于所施加的外力，大于孔徑的可變形顆粒( 如EVs) 會(huì)通過過濾器。超濾比DC 更省時(shí)，濃縮100mL 樣本需要約20min，而DC需要3-9h[24]。超濾的回收率可達(dá)80%，EV 濃縮倍數(shù)可達(dá)240 倍。這意味著基于超濾的方法對(duì)濃縮EV 是有效的。

2.5 免疫捕獲實(shí)驗(yàn)

大多數(shù)免疫捕獲試驗(yàn)使用固定在表面(例如板珠或芯片)上的單克隆抗體來捕獲暴露于特定配體的EV?；诖祟惻潴w(通常為蛋白質(zhì))的存在，免疫捕獲可以分離EV 亞群[25]，因此在臨床上適用。

3 外泌體的檢測(cè)

對(duì)EV 檢測(cè)方法的選擇首先需要了解EV 的物理特性。PFP 含有球形EV(>95%；直徑50 nm 至1μm)、管狀EV(<5%，直徑1μm 至5μm) 和膜碎片(<0.5%，直徑1μm 至8μm)[26]。約50% 的EV小于400 nm，且>200 nm 的EV 其濃度隨著直徑的增加而降低[26,27]。報(bào)告的EV 濃度范圍為104 至1012EV/mL 血漿，但由于缺乏敏感性和特異性較高的方法，此數(shù)值存在誤差[26]。對(duì)于健康個(gè)體，EV生理濃度可能在107至109EV/ mL 血漿[28]，與血小板或紅細(xì)胞的濃度相當(dāng)，但低于血液中脂蛋白的濃度[29]。EV 的物理特性闡明了對(duì)于EV 檢測(cè)方法的要求，即理想的方法應(yīng)檢測(cè)50 nm 及以上的EV，對(duì)每種已知特性有檢測(cè)極限，有已知的樣本體積以測(cè)定EV 濃度，并能夠測(cè)定每種EV 的免疫表型[26,27]。

3.1 電子顯微鏡

電子顯微鏡(EM) 是EV 成像的金標(biāo)準(zhǔn)方法。透射電鏡的圖像分辨率約為1 至3 nm，掃描電鏡的圖像分辨率約為5 nm。在此，我們將重點(diǎn)介紹透射電子顯微鏡，它涵蓋了對(duì)EV 的大多數(shù)研究。

根據(jù)所研究樣本的類型，可采用多種制備方法對(duì)EV 進(jìn)行成像。細(xì)胞或組織通常是固定包埋在樹脂中，然后切成薄片(約100 nm)，并在觀察前進(jìn)行染色。通過這種經(jīng)典方法發(fā)現(xiàn)了存在于多囊體中并由細(xì)胞分泌的EV[30]。為了改善EV 超微結(jié)構(gòu)的保存，可采用高壓冷凍、低溫樹脂包埋和冷凍切片的方法。像血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液這樣的亞細(xì)胞制備物足夠薄，可以直接沉積到EM 網(wǎng)格上。上鏡后可以觀察到這些樣本在負(fù)染色后干燥，或者在冷凍液體薄膜中水合。為了對(duì)EV 進(jìn)行免疫表型分析，可將含EV 的樣本與膠體金顆粒一起孵育。這些金顆粒的直徑通常為4 nm 至40 nm，并與配體(如針對(duì)膜蛋白或脂質(zhì)的抗體)連接。這種被稱為免疫金標(biāo)記的方法可以應(yīng)用于所有類型的EM方法。盡管EM 成像在EV 研究中具有重要作用[31]，但EV-EM 方案尚未實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。

3.2 流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)(FC)是分析生物流體中EV 的有力方法，盡管這一潛力尚未完全實(shí)現(xiàn)[32]。在FC 中，粒子一個(gè)接一個(gè)地通過激光束，從而通過光的散射向多個(gè)測(cè)量點(diǎn)發(fā)射熒光信號(hào)。采用基于光散射的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行EV 檢測(cè)一直是眾多研究的主題[33]。在一些廣泛使用的FC 儀器上，與基于光散射的檢測(cè)相比，使用特定的熒光配體，例如膜聯(lián)蛋白V、抗體或膜染料，可以檢測(cè)到更多的EV[34]。免疫表型分型的合理方法是使用熒光標(biāo)記抗體測(cè)量表面抗原的存在。然而，盡管細(xì)胞可暴露于>1000 個(gè)被熒光標(biāo)記的表面抗原，但EV 通常暴露于<100 個(gè)表面抗原，這意味著可檢測(cè)目標(biāo)抗原的數(shù)量等于或低于大多數(shù)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)極限[32]。

通過FC 進(jìn)行的EV 分析易受群體偽影的影響，其中一種是由激光束中同時(shí)存在的多個(gè)EV 引起的[35]，因此需要進(jìn)行連續(xù)稀釋的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。其他混雜因素還包括非EV 成分的存在，如抗體聚集體、無機(jī)沉淀物、脂蛋白等[4,36]。盡管FC 的原理非常適合于對(duì)EV 進(jìn)行檢測(cè)、列舉和表型分析，但要在生物流體中對(duì)EV 進(jìn)行全面表型分析，還需提高儀器靈敏度。

3.3 納米顆粒跟蹤分析

納米顆粒跟蹤分析(NTA)通過用暗場(chǎng)顯微鏡跟蹤納米顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)來確定懸浮顆粒的大小和濃度。NTA 無法區(qū)分EV 和非EV 粒子。對(duì)于多分散樣本，包括大多數(shù)含EV 的生物流體，通過NTA 測(cè)定大小優(yōu)于動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)[27]，同時(shí)因?yàn)闄z測(cè)體積不是已知的，所以只能估計(jì)粒子的濃度。其他可測(cè)量EV 特性的方法有電泳遷移率、熒光和折射率。然而，這些選項(xiàng)在EV 的應(yīng)用上仍處于開發(fā)的早期階段[37]。

3.4 電阻脈沖傳感

電阻脈沖傳感(RPS) 通過使用庫爾特原理(Coulter)測(cè)定懸浮液中納米顆粒的大小和濃度，其中每種顆粒都通過一個(gè)孔進(jìn)行檢測(cè)[38]。RPS 無法區(qū)分EV 和非EV 粒子，且較大大EV 和粘性蛋白(如纖維蛋白原或血管性血友病因子)的存在可能會(huì)堵塞毛孔，使測(cè)量不精確[39]。與 EV 尺寸范圍兼容的RPS 設(shè)備具有固定孔隙和可調(diào)孔隙[39,40]，但固定孔隙設(shè)備剛推出仍有待評(píng)估，可調(diào)孔設(shè)計(jì)對(duì)于可檢測(cè)的尺寸仍有一定的局限性[38,39]。

3.5 新方法

三種全新的光學(xué)方法，包括頻率鎖定光學(xué)低語倏逝諧振器、干涉反射成像傳感器和納米流體光纖技術(shù)，能夠檢測(cè)小到50 nm 的單個(gè)EV[41-43]。納米鑷子或傳統(tǒng)的光學(xué)鑷子可能能夠捕獲EV，并通過測(cè)量其拉曼光譜，以獲得EV 的化學(xué)信息[44]。目前，這些方法仍需要進(jìn)一步的研究和商業(yè)化。

4 外泌體的組分測(cè)定

在EV 內(nèi)部和表面均可發(fā)現(xiàn)其包裹的“貨物”，包括RNA、DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和代謝產(chǎn)物。這些內(nèi)含物可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，引發(fā)一系列反應(yīng)。通過測(cè)量其組成成分，可以充分了解EV 的功能。

4.1 核糖核酸

EV 含有大量多樣的 RNA。要研究 RNA，必須從樣本中分離出EV，如前所述，應(yīng)用的分離方法不同，會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果[45]。例如，當(dāng)使用DC、碘克沙醇DGC 從條件培養(yǎng)基中分離EV 時(shí)，會(huì)發(fā)現(xiàn)不同的mRNA 表達(dá)譜[46]。在這些方法中，碘克沙醇產(chǎn)生的EV 數(shù)量最多，非EV 組分濃度最低，表明碘克沙醇在純度方面可能優(yōu)于其他檢測(cè)方法[46]。從EV 中分離出的RNA 的下一代測(cè)序已經(jīng)對(duì)EV中存在的所有RNA 類型進(jìn)行了綜合分類[47,48]，從RNA 測(cè)序中獲得的數(shù)據(jù)應(yīng)該通過擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，如定量PCR 或Northern 印跡[49]。在處理來自不同組織或細(xì)胞的EV 時(shí)，以及分離的EV 可能被攜帶的(脂)蛋白污染的情況下，這些EV-RNA 分析很難達(dá)到滿意的效果[50]。

4.2 脫氧核糖核酸

盡管與EV-RNA 相比，EV 中含有DNA 的證據(jù)很少，但越來越多的研究表明，在應(yīng)激條件下，細(xì)胞會(huì)釋放出含有DNA 的EV，這些DNA 被證實(shí)與凋亡小體中DNA 不同[51]。與 RNA 分析一樣，下一代測(cè)序、PCR 和其他方法可用于分析或驗(yàn)證EV-DNA 含量。

4.3 蛋白質(zhì)

證明EV 中存在特定蛋白質(zhì)的最廣泛使用的方法是蛋白印記法(Western blot)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)[52]。到目前為止，被報(bào)告的約有9700種和EV 相關(guān)的蛋白質(zhì)[53,54]。關(guān)于蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的分析，既可以在實(shí)驗(yàn)中比較選定的單個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，也可以對(duì)所鑒定出的蛋白質(zhì)進(jìn)行描述、分類和分組[55]。值得注意的是，當(dāng)從血液或含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中分離EV，會(huì)發(fā)生污染，即使使用無血清培養(yǎng)基或?qū)Ｓ蒙锓磻?yīng)器，培養(yǎng)基中的可溶性蛋白質(zhì)也可能導(dǎo)致偽影[10,11]。

4.4 代謝產(chǎn)物

EV 還可以攜帶由細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)生的<1500 Da 的小分子，包括糖、氨基酸、脂質(zhì)、核苷酸等代謝產(chǎn)物。EV 代謝產(chǎn)物的變化可能反映了母細(xì)胞的生化狀態(tài)，因此分析代謝產(chǎn)物可能有助于了解細(xì)胞間過程[56]。

5 小結(jié)

本綜述總結(jié)了目前關(guān)于EV 樣本收集、分離、檢測(cè)及下游分析的常見方法，并指出不同方法對(duì)結(jié)果可能造成一定偏差。認(rèn)識(shí)到從樣本采集到EV檢測(cè)所有步驟之間的相互關(guān)聯(lián)性，將有助于避免EV 研究中出現(xiàn)一些常見的錯(cuò)誤。隨著該領(lǐng)域的進(jìn)步，我們相信將會(huì)涌現(xiàn)出越來越多更靈敏、精確的標(biāo)準(zhǔn)化方案?？傊?，本綜述將有助于探索EV 這一仍然新穎的領(lǐng)域及其在健康和疾病中的作用。