KLK14與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究進展*

崔欣 葉聯(lián)華

隨著分子靶向治療的興起和廣泛應(yīng)用，惡性腫瘤的診斷和個體化治療取得了積極的進展，但由于惡性腫瘤的高復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率，目前病死率仍然較高。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤細胞從原發(fā)病灶擴散到遠處器官的過程，涉及包括細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的降解、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、免疫逃逸、組織微環(huán)境的調(diào)節(jié)和耐藥等多種細胞機制，由于癌癥轉(zhuǎn)移過程的綜合性和復(fù)雜性，對這一復(fù)雜現(xiàn)象仍缺乏系統(tǒng)了解，限制了轉(zhuǎn)移性疾病治療的進展。因此，挖掘與腫瘤轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)的新的分子標(biāo)志物，并探索在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用，對于深入了解惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移過程及腫瘤的診治具有重要意義。

人組織激肽釋放酶家族（Kallikrein-related peptidases，KLKs）是一類具有胰蛋白酶和糜蛋白酶雙重活性的分泌型絲氨酸蛋白酶，其成員人組織激肽釋放酶14（Kallikrein-related peptidase 14，KLK14）作為癌癥發(fā)展過程中重要的信號分子，有望成為癌癥個體化治療的新靶點[1]。大量研究表明KLK14可以調(diào)節(jié)多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，并且參與到腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的各個階段[2-4]。而腫瘤轉(zhuǎn)移這一惡性腫瘤的基本生物學(xué)特性，是導(dǎo)致疾病難治和患者死亡的重要原因，本文將就KLK14在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用和可能機制進行綜述。

1 KLK14概述

KLK14是KLKs中的一員，其基因定位于染色體19q13.4，全長約5.4 kb，由7個外顯子（5個編碼的外顯子）和4個內(nèi)含子組成，其生物學(xué)功能由編碼產(chǎn)物KLK14蛋白介導(dǎo)，其酶原前體由251個氨基酸構(gòu)成，包含18個氨基酸構(gòu)成的信號肽和6個氨基酸構(gòu)成的活性肽，并具有胰島素樣和糜蛋白樣活性[5]。

2000年，Hooper等[6]通過Northern blot分析以及原位雜交技術(shù)首次在正常前列腺上皮細胞、前列腺癌細胞以及骨骼肌中檢測到KLK14基因的表達。KLK14廣泛表達于多種組織，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，KLK14中度表達，與其他KLKs共同參與層黏連蛋白、纖維連接蛋白和膠原蛋白等細胞外基質(zhì)的降解,以及蛋白酶激活受體-2的激活[7]。KLK14在皮膚中表達，激活皮膚脫屑的主要效應(yīng)物KLK5和KLK7，并在體外直接降解橋粒核心糖蛋白-1，進一步參與表皮生理學(xué)[8]。而在惡性腫瘤細胞中觀察到了KLK14表達的失調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，KLK14受類固醇激素的調(diào)節(jié)[9]，在前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌中對比正常組織均有不同程度的升高[4，9]，而隨著對KLK14更深入的研究，在包括結(jié)直腸癌和非小細胞肺癌等非激素依賴性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)KLK14的異常表達[10-11]。KLK14可以通過激活HGF/c-MET信號通路、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶和降解細胞外基質(zhì)等多種途徑促進腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移[2，12]。

2 KLK14和腫瘤轉(zhuǎn)移

腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的顯著特征，也是導(dǎo)致癌癥患者死亡的重要因素。近年來，越來越多的惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)了KLK14的異常表達，研究者推薦將KLK14作為惡性腫瘤轉(zhuǎn)移及較差預(yù)后的分子標(biāo)志物，并提出將其作為新的靶點以達到腫瘤治療的目的。

2.1 KLK14與激素依賴性腫瘤

研究發(fā)現(xiàn)，KLK14受類固醇激素調(diào)節(jié)促進腫瘤進展和轉(zhuǎn)移[9]。有研究表明，與正常前列腺組織相比，前列腺癌中KLK14的表達升高。Rose等[13]通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中前列腺癌的數(shù)據(jù)分析表明，高Gleason評分前列腺癌的KLK14 mRNA表達顯著高于低Gleason評分的前列腺癌。特別是在檢測到前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen/Kallikrein-related peptidase 3，PSA/KLK3）的復(fù)發(fā)患者中[14]。同時，與原發(fā)性前列腺癌相比，轉(zhuǎn)移性前列腺癌中KLK14的表達顯著升高[3]。KLK14與前列腺癌的關(guān)聯(lián)也得到了遺傳學(xué)研究的支持，KLK14基因的多態(tài)性與前列腺癌侵襲性顯著相關(guān)[13]。以上證據(jù)提示靶向該基因可能提供一個新的途徑來限制前列腺癌的進展和轉(zhuǎn)移。KLK14在其他內(nèi)分泌腫瘤中同樣高表達，Georgia等[15]研究表明，在乳腺癌和正常組織標(biāo)本中的表達分析顯示，惡性腫瘤中KLK14的轉(zhuǎn)錄水平較正常組織更高，定量KLK14的表達可以作為乳腺良惡性病變鑒別診斷的獨立生物標(biāo)志物，同時，KLK14轉(zhuǎn)錄水平升高與腫瘤的形態(tài)大小呈正相關(guān)，且較高的KLK14基因水平與乳腺癌的侵襲性相關(guān)。在卵巢癌中，KLK14的表達水平高于正常卵巢組織和卵巢良性腫瘤[9]。Zhang等[16]利用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）下調(diào)KLK14基因在人卵巢癌細胞SK-OV-3和OVCAR-3中的表達，發(fā)現(xiàn)抑制KLK14可明顯降低細胞的增殖和侵襲能力并增加細胞凋亡率，表明KLK14可能是治療和抑制卵巢癌轉(zhuǎn)移的潛在靶點。

而Dettmar等[17]在晚期高級別漿液性卵巢癌中觀察到KLK14的表達與腫瘤預(yù)后呈負相關(guān)。相似的，在睪丸癌中，KLK14轉(zhuǎn)錄水平的表達相比正常組織下調(diào)[18]，但目前還無關(guān)于其與睪丸癌生存率相關(guān)性的研究。提示KLK14在不同種腫瘤細胞中可能存在雙向調(diào)節(jié)，但其機制仍需進一步闡明。

2.2 KLK14與非激素依賴性腫瘤

隨著研究的深入，在越來越多的非激素依賴性腫瘤中同樣發(fā)現(xiàn)了KLK14表達的上調(diào)。由于結(jié)腸癌中可用標(biāo)記物缺乏敏感性和特異性，Devetzi等[10]利用實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測了175例患者的245份結(jié)腸組織標(biāo)本，證實KLK14在結(jié)腸癌中轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。進一步的受試者工作特征曲線分析顯示，KLK14基因表達可作為結(jié)腸癌患者預(yù)后不良的生物標(biāo)志物，并對結(jié)腸癌和腺瘤患者有較強的鑒別能力，而KLK14轉(zhuǎn)錄水平上高表達與陽性淋巴結(jié)狀態(tài)和更晚的TNM分期具有顯著性相關(guān)，分別為P=0.019和P=0.043，提示KLK14在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮促進作用。

而KLK14在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中的表達存在爭議，Planque等[19]采用qPCR技術(shù)，分析了57例原發(fā)性NSCLC患者配對樣本中的KLK14 mRNA表達水平，與配對的癌旁組織相比，KLK14在NSCLC組織中高表達（P=0.022），進一步研究發(fā)現(xiàn)KLK14還與NSCLC的高風(fēng)險相關(guān)，證實了KLK14可作為NSCLC患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。而Tailor等[20]利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析了KLKs家族中的所有成員在15種腫瘤中的表達水平，結(jié)果顯示在肺鱗癌和肺腺癌中KLK14的表達與正常組織比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 。Zhang等[21]通過對112例宣威女性肺腺癌和配對樣本進行全外顯子測序，利用mRNA-Seq技術(shù)對33例正常和115例腫瘤樣本進行測序，并與TCGA數(shù)據(jù)庫比較，將KLK14鑒定為顯著突變基因，是潛在的宣威女性肺腺癌的驅(qū)動基因。然而關(guān)于KLK14對NSCLC轉(zhuǎn)移的影響及可能機制則需進一步研究。

3 KLK14促進腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機制

惡性腫瘤轉(zhuǎn)移是一個多步驟的級聯(lián)過程，包括局部侵襲，癌細胞進入附近的血管/淋巴管，進而到達遠處組織形成微轉(zhuǎn)移，最后定植形成轉(zhuǎn)移灶 。而蛋白酶在癌癥進展的幾乎所有階段都起著十分復(fù)雜的作用。特別是蛋白酶參與到了一些癌細胞從原發(fā)部位轉(zhuǎn)移到繼發(fā)部位的必要細胞事件[1]。KLKs可以通過降解ECM、促進EMT、免疫逃逸和促進血管生成等途徑促進腫瘤細胞浸潤轉(zhuǎn)移。KLK14是KLKs家族中發(fā)現(xiàn)的新成員，可能在上述細胞生物學(xué)程序的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。

3.1 KLK14與ECM

ECM（extracellular matrix，ECM）是由細胞合成、分泌的生物大分子，在細胞表面或細胞之間構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，經(jīng)典意義上的ECM包括膠原蛋白、彈性蛋白、氨基聚糖與蛋白聚糖及非膠原蛋白。KLKs家族在是維持ECM穩(wěn)態(tài)所必須的蛋白水解酶，參與ECM重構(gòu)[22]。而ECM重構(gòu)可以促進血管生成過程中內(nèi)皮細胞的遷移，以介導(dǎo)血管生成的方式促進惡性腫瘤轉(zhuǎn)移。ECM在腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，腫瘤細胞可以通過分泌各種酶類降解ECM，從而向周圍及遠處組織侵襲轉(zhuǎn)移。

Kryza等[3]通過對前列腺癌細胞的蛋白質(zhì)組學(xué)進行分析，發(fā)現(xiàn)包括硫酸肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans, HSPG）、集聚蛋白（agrin，AGRN）、多配體蛋白聚糖4（syndecan 4，SDC4）和模塊化結(jié)合蛋白2在內(nèi)的KLK14底物參與了ECM的形成，同時發(fā)現(xiàn)KLK14可以調(diào)節(jié)解整合素金屬蛋白酶10（a disintegrin and metalloprotease 10，ADAM10）和ST14蛋白酶的活性，從而促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。KLK14還可以通過選擇性激活膜型基質(zhì)金屬蛋白酶（membrane-type matrix metalloproteinases，MT-MMPs）參與癌細胞轉(zhuǎn)移的初始階段[2]。在卵巢癌中也觀察到了相似的結(jié)果，Zhang等[16]將KLK14小干擾RNA轉(zhuǎn)染到人卵巢癌SK-OV-3和OVCAR-3細胞中并進行Western blot分析，結(jié)果顯示存活蛋白（survivin）和MMP2的表達降低。Rajapakse等[4]將KLK14表達載體轉(zhuǎn)染到卵巢癌細胞COS-7中，并活化和純化重組KLK14蛋白進行生化和酶學(xué)表征，發(fā)現(xiàn)KLK14蛋白在卵巢癌中降解層黏連蛋白、纖維連接蛋白、I型膠原和IV型膠原，而這些ECM成分蛋白的降解被認為是癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。以上研究表明KLK14可以通過降解ECM或影響ECM重構(gòu)促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。

3.2 KLK14介導(dǎo)EMT

EMT（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是癌細胞發(fā)展侵襲性表型所必需的，E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的減少和波形蛋白表達增加是EMT的顯著特征[23]。有研究表明KLKs家族在調(diào)節(jié)EMT相關(guān)機制中發(fā)揮作用[24]。

蛋白酶激活受體-2（proteinase-activiated receptor-2，PAR-2）屬于G蛋白偶聯(lián)受體，作為各種蛋白水解信號傳遞的靶點參與到包括腫瘤在內(nèi)的多種病生理過程[25]，可被KLKs家族激活。有研究表明，PAR-2的表達在多種惡性腫瘤中顯著升高，并且可以通過促進腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移加速腫瘤進展。在肝癌細胞中PAR-2的激活可以誘導(dǎo)人肝癌LX-2細胞形成EMT所特有的絲狀偽足，并且可以通過 Src 蛋白激酶、Met蛋白、p42/P44 MAPK 信號通路和 MMP 依賴的方式增加腫瘤細胞的遷移能力[26]。Wu等[27]利用TCGA數(shù)據(jù)庫進行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PAR-2過表達有利于肺腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，進而影響患者的預(yù)后。同樣，Tsai等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌細胞系CL1-5和H1299中，PAR-2通過Slug介導(dǎo)的EMT促進腫瘤細胞遷移。Chung等[29]發(fā)現(xiàn)KLK14和PAR-2在結(jié)腸癌細胞中過表達，并且在人結(jié)腸癌HT-29細胞中，KLK14可以通過自分泌/旁分泌的方式裂解和激活PAR-2，利用共聚焦顯微鏡觀察到經(jīng)KLK14處理后的PAR-2迅速內(nèi)化并在胞內(nèi)彌漫性定位，進而發(fā)揮促癌作用。這些結(jié)果表明，KLK14可以激活PAR-2并通過其下游信號途徑介導(dǎo)的EMT促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。

然而，由于KLKs家族中的其他成員，如KLK6抑制乳腺癌進展可能是通過抑制EMT介導(dǎo)[30]。因此，關(guān)于KLKs家族促進還是抑制EMT尚未形成共識，仍需要更多的研究加以闡明。

3.3 KLK14與免疫逃逸

免疫系統(tǒng)是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要障礙，惡性腫瘤細胞可以通過消除誘導(dǎo)效應(yīng)細胞、破壞關(guān)鍵信號通路、對細胞毒性的抗性以及逃避免疫反應(yīng)的策略逃避免疫系統(tǒng)[31]。有研究發(fā)現(xiàn)KLKs家族與免疫逃逸機制間存在聯(lián)系，如KLK5和KLK7可以通過降解LL-37進而介導(dǎo)免疫-腫瘤微環(huán)境的調(diào)控[32]。

KLK14能有效降解補體系統(tǒng)級聯(lián)反應(yīng)的中心組分補體C3[33]進而發(fā)揮外部補體的作用。補體網(wǎng)絡(luò)是先天免疫系統(tǒng)的重要組成成分，補體C3是免疫細胞激活中發(fā)揮廣泛生物學(xué)效應(yīng)的主要信號效應(yīng)分子之一。因此，補體C3的水解激活構(gòu)成了可能有助于腫瘤免疫逃逸的機制。但由于相關(guān)研究有限，KLK14與免疫逃逸之間的具體作用機制需要進一步研究。

3.4 KLK14與HGF/c-Met信號通路

肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）是由間質(zhì)細胞產(chǎn)生的一種活性多肽，是致癌基因c-Met目前唯一已知的配體，在正常細胞中HGF激活c-Met后，細胞質(zhì)中酪氨酸殘基發(fā)生自身磷酸化，從而激活酪氨酸激酶。隨后，多種效應(yīng)蛋白被快速磷酸化發(fā)揮復(fù)雜的生物學(xué)功能[34]。HGF/c-Met信號通路在多種癌細胞轉(zhuǎn)移的多個階段均發(fā)揮關(guān)鍵作用，可以促進細胞增殖、侵襲和遷移[35]。HGF可以導(dǎo)致細胞間連接的不穩(wěn)定、支持細胞骨架重構(gòu)、控制整合素功能并刺激MMP介導(dǎo)的ECM蛋白水解，進而促進腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[36]。一項研究也表明，胰腺癌細胞可通過上調(diào)MMP-9從而激活HGF/c-Met信號通路，促進胰腺癌以神經(jīng)周浸潤的方式形成腫瘤轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)[37]。另外，研究表明，HGF/c-Met信號通路可通過細胞可塑性中的關(guān)鍵作用和增加與腫瘤微環(huán)境的串?dāng)_促進免疫逃逸[38]。

Reid等[14]提出KLK14可以通過激活HGF影響HGF/c-Met信號級聯(lián)。更深入的研究發(fā)現(xiàn)，KLK14以蛋白水解的方式抑制肝細胞生長因子激活物抑制劑-1（hepatocyte growth factor activator inhibitor type-1，HAI-1），而HAI-1可以顯著抑制HGF的激活[12]。綜上所述，KLK14可能通過HGF/c-Met信號通路的激活促進腫瘤細胞的增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸。

3.5 KLK14與胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3

胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3（insulin-like growth factor binding protein-3，IGFBP-3）是一種p53抑癌基因調(diào)控蛋白，是腫瘤發(fā)生的負性調(diào)控因子。其特異性受體IGFBP-3R已經(jīng)被證明與IGFBP-3誘導(dǎo)的癌細胞核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）活性的抑制有關(guān)，進而增強對腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制作用[39]。自分泌移動因子（autocrine motility factor，AMF）又稱磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（phoshoglucose isomerase，PGI）是一種腫瘤細胞分泌的細胞因子，可通過自分泌途徑進入胞內(nèi)調(diào)節(jié)細胞遷移和增殖，而IGFBP-3被證明能夠在人乳腺癌細胞T47D和MCF-7中抑制AMF/PGI誘導(dǎo)的細胞遷移[40]。在胰腺導(dǎo)管腺癌中，腫瘤組織相比正常胰腺組織中的IGFBP-3R表達降低，且與預(yù)后不良相關(guān)[41]。目前的研究結(jié)果均表明，IGFBP-3/IGFBP-3R信號通路可能是一種新的抗腫瘤/抗轉(zhuǎn)移信號通路，是新的潛在癌癥治療靶點[42]。

研究發(fā)現(xiàn)，KLK14蛋白具有胰蛋白酶樣活性，并且能夠快速水解IGHBP-3[4]?；谝陨涎芯?，KLK14可能在體內(nèi)通過水解IGFBP-3抑制IGFBP-3/IGFBP-3R信號通路，進而促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，但仍需要更多的研究進行驗證。

4 結(jié)語及展望

精準醫(yī)學(xué)是隨著人類社會的健康需求提高和科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展而興起的新的醫(yī)療理念和模式，分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用是未來我國精準醫(yī)學(xué)的重點任務(wù)。KLK14參與多種病理生理過程，并與包括侵襲和轉(zhuǎn)移在內(nèi)的多種腫瘤細胞惡性生物學(xué)行為顯著相關(guān)，這提示KLK14在腫瘤的診斷、治療及預(yù)后中具有巨大的潛在研究價值。至今，在多種腫瘤細胞中都觀察到KLK14表達的上調(diào)，檢測其表達可以反應(yīng)腫瘤狀態(tài)，有效預(yù)測患者預(yù)后。而在睪丸癌和晚期高級別漿液性卵巢癌中存在KLK14表達下調(diào)則提示，KLK14在不同惡性腫瘤中可能存在雙向調(diào)節(jié)。最近，在宣威女性肺腺癌中的發(fā)現(xiàn)將KLK14鑒定為潛在的驅(qū)動基因，為全球死亡率最高的區(qū)域性肺癌的診斷及精準治療提供了新的潛在靶點。同時，由于KLK14下游靶點的信號通路和蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)的多樣性，其在調(diào)節(jié)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移之外還參與包括腫瘤細胞增殖和血管生成等多種生物學(xué)行為的改變。隨著研究的不斷深入，KLK14有望為惡性腫瘤的診斷及個體化治療提供新靶點和新思路。