瑪卡調(diào)控5-HT、DA對(duì)小鼠自閉癥樣行為及神經(jīng)環(huán)路的影響*

羅舒心，劉仲鈺，梁明坤，鐘振國(guó)，鐘 靜

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，廣西南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西南寧 530011；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西南寧 530200；4.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院博士后工作站，廣西南寧 530023)

自閉癥被視為除癌癥、心臟病之外影響人類生命健康的又一殺手，社交障礙是自閉癥的核心表現(xiàn)，社會(huì)行為改善是衡量自閉癥治療效果的重要指標(biāo)。藥物治療是自閉癥治療的重要方式，但目前針對(duì)自閉癥的治療藥物(包括抗精神藥物[1]、免疫抑制劑[2]、抗生素類藥物[3]、抗嘌呤類藥物[4]以及各種受體激動(dòng)劑與拮抗劑等[5-8])，都只能對(duì)癥狀有部分改善作用，仍達(dá)不到理想的治療效果。因此，開(kāi)發(fā)有效改善自閉癥社會(huì)行為障礙的藥物意義重大。瑪卡作為外來(lái)引種藥物，且引入后經(jīng)研究被賦予了中醫(yī)藥性能[9]，其所顯示的藥理作用可能對(duì)自閉癥的防治有效，值得深入研究。因此本研究選擇瑪卡作為受試藥物，探究其對(duì)小鼠自閉癥樣行為的具體作用，為開(kāi)發(fā)瑪卡治療自閉癥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR及C57/BL6小鼠，雄性，8周齡，各60只，體質(zhì)量(35±5) g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002。所有小鼠飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房，交替光照(12 h光照/12 h黑暗)，室溫(23±2)℃，自由進(jìn)食飲水。

1.2 藥物制備

瑪卡原藥材來(lái)源于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高山經(jīng)濟(jì)植物研究所。經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室滕建北副教授鑒定為十字花科植物瑪卡獨(dú)行菜(LepidiummeyeniiWalp.)的干燥根莖。將原藥材粉碎成粗粉浸泡過(guò)夜后，每次分別用10倍容量的純水煎煮2.5 h，共3次，合并煎煮液濾過(guò)，濃縮揮干得到瑪卡總浸膏，浸膏得率為50%，分裝后置于-20℃冰箱中保存待用。

1.3 分組與給藥

將受試的兩個(gè)種系動(dòng)物隨機(jī)各分為4組(4只/籠，每組數(shù)量n=15)：空白對(duì)照組、瑪卡高劑量組、瑪卡中劑量組和瑪卡低劑量組。將瑪卡總浸膏溶于水，分別制備高劑量(5.0 g/kg)、中劑量(2.5 g/kg)和低劑量(1.0 g/kg)等濃度的水溶液用于灌胃；空白對(duì)照組予等容積(10 mL/kg)純水灌胃。每日2次(8：00 AM，8：00 PM)，持續(xù)10 d，行為學(xué)測(cè)試期間持續(xù)給藥。

1.4 儀器設(shè)備與試劑

高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)設(shè)備、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備、三腔實(shí)驗(yàn)設(shè)備(上海徠卡儀器有限公司)，病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司，型號(hào)：RM2016)，正置白光拍照顯微鏡(日本Nikon公司，型號(hào)：Eclipse Ci-L)，抗c-Fos抗體(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab208942)，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體(武漢Servicebio公司，批號(hào)：GB23301)，組化試劑盒DAB顯色劑(武漢Servicebio公司，批號(hào)：G1211)，小鼠5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(美國(guó)SAB公司，批號(hào)：EK18305)，小鼠多巴胺(Dopamine，DA)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(美國(guó)SAB公司，批號(hào)：EK18271)。

1.5 行為學(xué)測(cè)試

1.5.1 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

高架十字迷宮離地高40 cm，由兩個(gè)對(duì)側(cè)的開(kāi)放臂(30 cm×5 cm)及兩個(gè)由黑色亞克力玻璃板圍起來(lái)的對(duì)側(cè)閉合臂(30 cm×5 cm×15 cm)組成，中心為5 cm×5 cm×15 cm的開(kāi)放區(qū)域[10,11]。測(cè)試時(shí)將測(cè)試小鼠由中心區(qū)域面朝一側(cè)開(kāi)放臂放入，任其在高架內(nèi)自由探索5 min，采用動(dòng)物行為學(xué)分析軟件ANY-maze記錄小鼠進(jìn)入開(kāi)放臂及閉合臂的次數(shù)及持續(xù)時(shí)間。

1.5.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

參照Wong等[12]方法進(jìn)行改良，實(shí)驗(yàn)用邊長(zhǎng)為60 cm×60 cm、高為20 cm的木制正方形敞箱。將敞箱分成3個(gè)區(qū)域，分別為外區(qū)(outer zone)、中心區(qū)(inner zone)及中心盒子區(qū)(inner cage zone)，inner zone平面大小為敞箱的1/4，inner cage zone平面尺寸為10 cm×8 cm。實(shí)驗(yàn)共有3個(gè)階段。(1)適應(yīng)性階段。將測(cè)試小鼠從箱子的角落放入，讓其在敞箱中自由探索10 min，用ANY-maze軟件記錄小鼠移動(dòng)總距離及進(jìn)入inner zone的次數(shù)及時(shí)間。(2)非社會(huì)性階段。在inner cage zone固定一個(gè)透明帶多氣孔的亞克力盒子(平面尺寸為8 cm×6 cm)，將測(cè)試小鼠從箱子的角落放入，讓其自由探索10 min，用ANY-maze軟件記錄小鼠進(jìn)入inner cage zone的次數(shù)及時(shí)間。(3)社會(huì)性階段。在第2階段的亞克力盒子中放入一只同系、同性別、同周齡的陌生鼠，將測(cè)試小鼠從箱子的角落放入，讓其自由探索10 min，用ANY-maze軟件記錄小鼠進(jìn)入inner cage zone的次數(shù)及時(shí)間。

1.5.3 三腔社交實(shí)驗(yàn)

三腔社交實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[13-15]所述并進(jìn)行改良，該實(shí)驗(yàn)于一自制的敞頂長(zhǎng)方形黑色亞克力玻璃箱(60 cm×20 cm×20 cm)中進(jìn)行，由2塊黑色亞克力玻璃板將其分為均等的3個(gè)腔室，板的底部預(yù)留空間允許測(cè)試小鼠自由穿過(guò)。正式測(cè)試前，將受試小鼠由中間腔室放入，允許其在3個(gè)腔室間自由探索適應(yīng)10 min。三腔社交實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)階段，分別為社交性階段(session-1)、社交偏好階段(session-2)和社交記憶階段(session-3)。3個(gè)階段依次進(jìn)行測(cè)試，每只測(cè)試鼠結(jié)束測(cè)試后均用75%的酒精給實(shí)驗(yàn)箱清潔去味以排除干擾。session-1分別在兩邊腔室的角落放1只同種系、同性別、同周齡的陌生小鼠(陌生鼠1號(hào))及1支50 mL試管，陌生鼠1號(hào)限定在帶20個(gè)氣孔的透明亞克力小盒子(10 cm×5 cm×5 cm)中,將測(cè)試小鼠從中間腔室放入，自由探索10 min；session-2將session-1的50 mL試管換成陌生鼠2號(hào)，陌生鼠2號(hào)的固定方式同session-1中的陌生鼠1號(hào)，之后將測(cè)試小鼠從中間腔室放入，自由探索5 min；session-3將session-2中的陌生鼠2號(hào)取出，實(shí)驗(yàn)箱清潔去味后換成陌生鼠3號(hào)，陌生鼠1號(hào)保持不變，5 min后，將測(cè)試小鼠從中間腔室放入，自由探索5 min。所有行為均由ANY-maze軟件追蹤并記錄，分析實(shí)驗(yàn)中測(cè)試小鼠進(jìn)入兩側(cè)腔室的時(shí)間及次數(shù)，嗅探陌生鼠1，2，3號(hào)及試管的時(shí)間及次數(shù)。

1.6 樣本采集與檢測(cè)

1.6.1 血漿5-HT含量檢測(cè)

行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后1-1.5 h內(nèi)取樣，用5%(m∶V)的水合氯醛將小鼠麻醉后，使用一次性真空采血管，心臟采血1 mL左右，將取得的血液樣本進(jìn)行離心，分裝血漿置于-80℃冰箱中保存待用。小鼠血漿5-HT含量檢測(cè)參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6.2 血漿DA含量檢測(cè)

血漿樣本取得方式同1.6.1節(jié)，血漿DA含量檢測(cè)參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6.3 c-fos免疫熒光染色

c-fos免疫熒光染色參照文獻(xiàn)[16,17]方法進(jìn)行，具體如下：行為學(xué)測(cè)試結(jié)束60 min后對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，用磷酸鹽緩沖液(PBS)經(jīng)心臟灌流清除血液，然后用含4%多聚甲醛(PFA)的PBS灌注固定，取出腦組織，將腦組織浸泡于4% PFA中固定24 h，再置于-4℃冰箱中過(guò)夜，之后先后放置15%、30%蔗糖水中浸泡48 h脫水。切除嗅球及小腦部分后用切片機(jī)將小鼠大腦切成20 μm厚的冠狀切片，選取15-20張切片在PBS溶液中沖洗后，將組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)液(pH值9.0)的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，切片放入3%雙氧水溶液以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。在BSA封閉溶液中封閉30 min，然后加入抗c-fos抗體孵育過(guò)夜。在含有0.3% Triton X-100的PBS溶液中沖洗3次，并在室溫下滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗(HRP標(biāo)記)覆蓋組織室溫孵育50 min。再次沖洗切片，將切片固定于載玻片上脫水、顯色、染色。顯微鏡鏡檢，采集分析圖像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 瑪卡對(duì)C57/BL6小鼠行為學(xué)的影響

2.1.1 瑪卡對(duì)C57/BL6小鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)的影響

如圖1(a)(b)及圖1(c)所示，與空白對(duì)照組相比，瑪卡對(duì)小鼠進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)與時(shí)間以及進(jìn)入閉合臂的次數(shù)無(wú)顯著影響(P>0.05)；如圖1(d)及圖1(e)所示，瑪卡中劑量組與高劑量組顯著減少了小鼠進(jìn)入閉合臂的時(shí)間(P<0.01)，但對(duì)小鼠進(jìn)入開(kāi)放臂的指數(shù)無(wú)明顯作用(P>0.05)。結(jié)果顯示，瑪卡能顯著減少C57/BL6小鼠進(jìn)入閉合臂的時(shí)間，但對(duì)小鼠進(jìn)入開(kāi)放臂的時(shí)間與指數(shù)無(wú)影響。

2.1.2 瑪卡對(duì)C57/BL6小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響

如圖2所示，與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)的適應(yīng)階段，瑪卡中劑量組在曠場(chǎng)移動(dòng)的總距離顯著減少(P<0.01)。在非社會(huì)性階段，瑪卡組的小鼠進(jìn)入中心的時(shí)長(zhǎng)與空白對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；在社會(huì)性階段，瑪卡中劑量組與高劑量組進(jìn)入中心的時(shí)長(zhǎng)明顯減少(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果表明，瑪卡減少了C57/BL6小鼠在曠場(chǎng)移動(dòng)的總距離及社會(huì)性階段進(jìn)入中心的時(shí)長(zhǎng)。

2.1.3 瑪卡對(duì)C57/BL6小鼠三腔社交實(shí)驗(yàn)的影響

如圖3(a)所示，持續(xù)灌胃14 d后，與空白對(duì)照組比較，在社會(huì)性階段，瑪卡低劑量組顯著減少了與陌生鼠1互動(dòng)的時(shí)間(P<0.05)；圖3(b)顯示在社會(huì)偏好階段，與空白對(duì)照組比較，瑪卡低、中、高劑量組與陌生鼠2互動(dòng)時(shí)間無(wú)顯著變化(P>0.05)；圖3(c)顯示在社會(huì)記憶階段，與空白對(duì)照組比較，瑪卡中劑量組與陌生鼠1互動(dòng)時(shí)間減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。圖3(d)中與空白對(duì)照組比較，瑪卡低劑量組的社會(huì)性指數(shù)顯著降低(P<0.05)；圖3(e)(f)顯示瑪卡中劑量組的社會(huì)新穎性指數(shù)增高，社會(huì)記憶指數(shù)下降，但與空白對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；圖3(d)(e)(f)中瑪卡高劑量組社會(huì)性指數(shù)、社會(huì)新穎性指數(shù)及社會(huì)記憶指數(shù)與空白對(duì)照組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明，瑪卡對(duì)C57/BL6小鼠的社會(huì)性/社會(huì)新穎性及社會(huì)記憶均無(wú)顯著影響。

(a)Number of times to enter the open arm

BC:Blank control group;LD:Low dose group;MD:Medium dose group;HD:High dose group.Compared with the blank control group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖2 瑪卡持續(xù)灌胃14 d后對(duì)C57/BL6小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響Fig.2 Effect of Maca on open field experiment of C57/BL6 mice after continuous gavage for 14 d

2.2 瑪卡對(duì)ICR小鼠行為學(xué)的影響

2.2.1 瑪卡對(duì)ICR小鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)的影響

如圖4(a)(b)所示，與空白對(duì)照組比較，瑪卡低、中、高劑量組小鼠在開(kāi)放臂中的時(shí)間與空白對(duì)照組比較均顯著增多(P<0.01)；低劑量組小鼠進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù)明顯增多(P<0.05)。圖4(c)(d)顯示，與空白對(duì)照組比較，瑪卡中劑量組在閉合臂中的時(shí)間顯著降低(P<0.01)，瑪卡低劑量組與高劑量組有降低趨勢(shì)但無(wú)明顯差異(P>0.05)；各劑量組小鼠進(jìn)入閉合臂的次數(shù)有明顯的下降(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。如圖4(e)所示，總體上瑪卡中劑量組進(jìn)入開(kāi)放臂指數(shù)顯著增高(P<0.05)。

(a) Interaction time with strange mouse No.1 at social stage

2.2.2 瑪卡對(duì)ICR小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響

圖5顯示，瑪卡灌胃14 d后，在適應(yīng)性階段，與空白對(duì)照組比較，瑪卡中劑量組與高劑量組在曠場(chǎng)中移動(dòng)的總距離明顯減少(P<0.05或P<0.01)；非社會(huì)性階段，與空白對(duì)照組比較，瑪卡低、中、高劑量組進(jìn)入曠場(chǎng)中心的時(shí)間有所增加，但無(wú)明顯差異(P>0.05)；社會(huì)性階段，與空白對(duì)照組比較，瑪卡低、中、高劑量組進(jìn)入曠場(chǎng)中心的時(shí)間均有增高趨勢(shì)，以中劑量組增高最為明顯，但均無(wú)明顯差異(P>0.05)。

2.2.3 瑪卡對(duì)ICR小鼠三腔社交實(shí)驗(yàn)的影響

結(jié)果如圖6(a)所示，與空白對(duì)照組比較，在社會(huì)性階段，瑪卡低、中、高劑量組與陌生鼠1互動(dòng)的時(shí)間明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；圖6(b)顯示在社會(huì)偏好階段，瑪卡低、中劑量組與陌生鼠2互動(dòng)時(shí)間顯著增加(P<0.05或P<0.01)；在社會(huì)記憶階段，如圖6(c)所示，瑪卡低、中劑量組與陌生鼠1互動(dòng)時(shí)間顯著增加(P<0.05或P<0.001)。結(jié)合圖6(d)(e)(f)顯示，與空白對(duì)照組比較，瑪卡低劑量組的社會(huì)性指數(shù)、社會(huì)新穎性指數(shù)與社會(huì)記憶指數(shù)均明顯增加(P<0.05)；瑪卡中劑量組的社會(huì)性指數(shù)與社會(huì)新穎性指數(shù)顯著增加(P<0.05)，社會(huì)記憶指數(shù)與空白對(duì)照組比較有一定的增加但無(wú)明顯差異(P>0.05)；瑪卡高劑量組社會(huì)新穎性指數(shù)顯著增加(P<0.05)，社會(huì)性指數(shù)與社會(huì)記憶指數(shù)與空白對(duì)照組比較有增加趨勢(shì)但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

(a) Time to enter the open arm

BC:Blank control group;LD:Low dose group;MD:Medium dose group;HD:High dose group.Compared with the blank control group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖5 瑪卡持續(xù)灌胃14 d后對(duì)ICR小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響Fig.5 Effect of Maca on open field experiment of ICR mice after continuous gavage for 14 d

2.3 瑪卡對(duì)ICR小鼠血漿5-HT及DA含量的影響

如表1所示，與空白對(duì)照組相比，瑪卡低劑量組及中劑量組小鼠血漿5-HT含量顯著增加(P<0.01或P<0.001)，瑪卡高劑量組血漿5-HT含量與空白對(duì)照組對(duì)比有所增加，但未表現(xiàn)出顯著性差異；瑪卡低劑量組、中劑量組及高劑量組小鼠血漿DA含量均顯著增加(P<0.05)。

2.4 瑪卡對(duì)ICR小鼠社會(huì)行為相關(guān)腦區(qū)c-fos陽(yáng)性細(xì)胞的影響

從表2可以看出，與空白對(duì)照組相比，瑪卡低劑量組與瑪卡高劑量組小鼠腦內(nèi)腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)的c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.05或P<0.01)，瑪卡中劑量組也表現(xiàn)出增加的趨勢(shì)；瑪卡低劑量組、中劑量組及高劑量組腹側(cè)蒼白球(VP)、伏隔核(NAcc)和內(nèi)側(cè)視前區(qū)(mPOA)的c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，與空白對(duì)照組相比均顯著增加(P<0.01或P<0.001)；瑪卡高劑量組杏仁核(amygdala)c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增多(P<0.05)。結(jié)果表明，瑪卡可增加ICR小鼠VTA、VP、NAcc、mPOA及amygdala的c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。

(a) Interaction time with strange mouse No.1 at social stage

表1 瑪卡對(duì)ICR小鼠血漿5-HT及DA含量的影響Table 1 Effect of Maca on 5-HT and DA contents in plasma for ICR mice

表2 瑪卡灌胃后ICR小鼠各腦區(qū)c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量Table 2 Number of c-fos positive cells in each brain region of ICR mice after Maca gavage

3 討論

自閉癥又稱孤獨(dú)癥譜系障礙(Autism Spectrum Disorder，ASD)，是一種多見(jiàn)于嬰幼兒時(shí)期發(fā)病的、嚴(yán)重的廣泛性發(fā)育障礙。由于自閉癥發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性以及不確定性，使得自閉癥的治療困難重重，藥物治療是自閉癥治療的重要方式?，斂▽儆谝M(jìn)的天然藥物，蘊(yùn)含多種化學(xué)成分，瑪卡根干燥后含獨(dú)有的新型物質(zhì)——瑪咖酰胺和瑪咖烯，對(duì)平衡人體荷爾蒙分泌有顯著的效果[18,19]。瑪卡中所含芐基芥子油苷和芐基異硫氰酸可以增強(qiáng)記憶力[18,19]。同時(shí)瑪卡具有抗疲勞、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、提高生育力、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、增強(qiáng)記憶、抗抑郁及神經(jīng)保護(hù)等功效[20]。在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，研究發(fā)現(xiàn)瑪卡性味辛、甘、溫、無(wú)毒，歸腎、肝、脾經(jīng)，具有溫腎壯陽(yáng)，強(qiáng)筋壯骨，散寒、止痛、調(diào)血脈等功效[20]。中醫(yī)理論認(rèn)為自閉癥病因病機(jī)為先天不足，腎精虧虛，心竅不通，神失所養(yǎng)，肝失條達(dá)，升發(fā)不利，其病位在腦，同心、肝、腎三臟有密切關(guān)系[21]。這些臟腑的失調(diào)都和自閉癥發(fā)病相關(guān)，表明中醫(yī)對(duì)自閉癥有深刻認(rèn)識(shí)[21]。由此可見(jiàn)，自閉癥從心、肝、腎進(jìn)行論治可能有效，瑪卡可能是自閉癥治療的潛在藥物。

在自閉癥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中以及自閉癥動(dòng)物的建模中，選擇的小鼠種系多為C57/BL6及ICR小鼠[10,22]，因此，將這兩種種系小鼠作為本研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)是評(píng)估測(cè)試動(dòng)物焦慮樣行為的重要實(shí)驗(yàn)[23]，廣泛應(yīng)用于大鼠、小鼠的焦慮行為學(xué)研究，其原理是基于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)新環(huán)境的探索行為和對(duì)高懸開(kāi)放臂的恐懼，形成一種矛盾沖突的狀態(tài)，進(jìn)而反映出動(dòng)物的焦慮情緒[24]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù)與時(shí)間增加，而進(jìn)入閉合臂的次數(shù)與時(shí)間大幅度減少，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)新環(huán)境的探索欲望增加及恐懼減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，瑪卡能顯著增加ICR小鼠進(jìn)入開(kāi)放臂的時(shí)間，縮短其進(jìn)入閉合臂的時(shí)間，而中劑量組進(jìn)入開(kāi)放臂的指數(shù)在總體上出現(xiàn)了明顯的增加。對(duì)于C57/BL6小鼠，瑪卡雖然減少了小鼠進(jìn)入閉合臂的時(shí)間，但是并未顯著增加小鼠進(jìn)入開(kāi)放臂的時(shí)長(zhǎng)與指數(shù)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，瑪卡能顯著降低ICR小鼠的焦慮樣情緒，但對(duì)C57/BL6小鼠的焦慮樣行為無(wú)明顯改善。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的適應(yīng)性階段實(shí)驗(yàn)也是評(píng)估實(shí)驗(yàn)動(dòng)物焦慮狀態(tài)的一種經(jīng)典行為學(xué)方式[25]，實(shí)驗(yàn)中的總移動(dòng)距離反映了小鼠的自主活動(dòng)能力。從結(jié)果來(lái)看，瑪卡顯著地減少了ICR小鼠在曠場(chǎng)中活動(dòng)的距離，并未提高ICR小鼠的自主活動(dòng)能力，小鼠運(yùn)動(dòng)距離的減少可能與小鼠的重復(fù)行為減少有關(guān)，而小鼠的重復(fù)行為往往是焦慮的表現(xiàn)。而焦慮常常是自閉癥的伴隨癥狀及共病之一[26]。

在社交行為方面，本研究中曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的社會(huì)性階段實(shí)驗(yàn)可用來(lái)評(píng)價(jià)小鼠的社會(huì)性，在此階段實(shí)驗(yàn)中，ICR小鼠增加了進(jìn)入曠場(chǎng)中心與陌生鼠互動(dòng)的時(shí)間，說(shuō)明瑪卡在一定程度上提升了ICR小鼠的社交能力。三腔社交實(shí)驗(yàn)也被廣泛用來(lái)評(píng)估小鼠的社交行為[13]，本研究中，在社會(huì)性實(shí)驗(yàn)階段，小鼠更傾向于進(jìn)入有陌生小鼠的腔室并頻繁互動(dòng)，社會(huì)性指數(shù)均為正向，說(shuō)明小鼠具有一定的社交能力；在社會(huì)偏好階段，小鼠花更多的時(shí)間與一個(gè)陌生鼠相處而非一個(gè)熟悉的同類，表明了實(shí)驗(yàn)小鼠存在社交新鮮感的偏好。從研究結(jié)果可以看到，瑪卡給藥后，ICR小鼠與陌生鼠的互動(dòng)時(shí)間顯著增加，社會(huì)性指數(shù)上升；與ICR小鼠空白對(duì)照組的社交新穎性指數(shù)為負(fù)數(shù)相比，瑪卡組小鼠社會(huì)新穎性指數(shù)均為正，由此可見(jiàn)瑪卡顯著地提高了ICR小鼠的社交能力和社交新鮮感偏好；而C57/BL6小鼠在服用瑪卡后，社會(huì)性指數(shù)下降，社會(huì)新穎性并無(wú)明顯改善。除此之外，本實(shí)驗(yàn)在原有三腔社交實(shí)驗(yàn)上進(jìn)行了改良，增加了社會(huì)記憶這一實(shí)驗(yàn)階段用來(lái)評(píng)估小鼠的社會(huì)記憶，若實(shí)驗(yàn)小鼠在本階段中更傾向于與原本熟悉的同類相處，則說(shuō)明存在一定的社會(huì)記憶，從結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，瑪卡在ICR小鼠社會(huì)記憶的提升方面起著積極的作用。本研究結(jié)果證明在改善社會(huì)行為方面，瑪卡對(duì)C57/BL6小鼠并未顯示出明顯的效果；而瑪卡對(duì)ICR小鼠社會(huì)行為有顯著的改善作用，以中劑量組最為明顯。而瑪卡對(duì)兩種不同的實(shí)驗(yàn)小鼠在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中所產(chǎn)生的藥效差異，可能是由小鼠的種屬差異造成的，這有待將來(lái)進(jìn)一步研究。

人類的社會(huì)行為受到大腦中的某些特定區(qū)域調(diào)控，這些區(qū)域統(tǒng)稱為“社會(huì)大腦”，亦指在從事各種社會(huì)認(rèn)知任務(wù)時(shí)，健康成年人的神經(jīng)成像研究中顯示出的、持續(xù)被激活的大腦區(qū)域，這些部位通過(guò)彼此之間的復(fù)雜聯(lián)系共同負(fù)責(zé)調(diào)控人的社會(huì)行為，且社會(huì)大腦的損害與社會(huì)認(rèn)知障礙有關(guān)。使用藥物干預(yù)或杏仁核(Amygdala)損傷的研究表明，杏仁核參與非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物[27]和嚙齒動(dòng)物[28]的社會(huì)行為和社會(huì)攻擊。杏仁核在自閉癥的發(fā)展中起著不可忽視的作用[29,30]，杏仁核功能障礙可能導(dǎo)致ASD的核心社會(huì)功能損害[31]。本研究中，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后瑪卡組的小鼠腦袋內(nèi)杏仁核c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增多，而相應(yīng)的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了在瑪卡治療后，小鼠的焦慮狀態(tài)得到改善，并增加了社交行為，這很可能與激活了杏仁核對(duì)相關(guān)行為的正向調(diào)控有關(guān)。

腹側(cè)蒼白球(VP)是與抑郁癥有關(guān)的動(dòng)機(jī)和獎(jiǎng)賞回路接口處的一個(gè)重要匯聚點(diǎn)[32,33]。VP接收來(lái)自中腦邊緣獎(jiǎng)賞通路主要組成部分伏隔核(NAcc)的密集輸入，并將此信息傳遞給下游靶區(qū)，如腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)和外側(cè)韁核(LHb)[34]。內(nèi)側(cè)視前區(qū)(mPOA)不僅是大腦中負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)社會(huì)交互行為的其中一個(gè)功能區(qū)域，也是神經(jīng)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)行為的一個(gè)重要節(jié)點(diǎn)[35]，mPOA包含許多含有類固醇受體的神經(jīng)元，接收來(lái)自多種感覺(jué)方式的社會(huì)信息，并在整個(gè)大腦中有廣泛的投射，包括VTA[36-39]。類固醇敏感的mPOA神經(jīng)元編碼與行為學(xué)相關(guān)的刺激，并參與中腦獎(jiǎng)賞回路，以促進(jìn)對(duì)物種生存至關(guān)重要的親社會(huì)行為[40]。與對(duì)杏仁核的研究結(jié)果一致，小鼠腦內(nèi)的VP、NAcc、mPOA及VTA c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多。研究結(jié)果表明，瑪卡可作用于調(diào)節(jié)社會(huì)行為的部分相關(guān)腦區(qū)，激活“社會(huì)大腦”系統(tǒng)，對(duì)小鼠的社會(huì)行為有正向的調(diào)節(jié)作用。

多巴胺(DA)系統(tǒng)是運(yùn)動(dòng)活動(dòng)、動(dòng)機(jī)、注意力和獎(jiǎng)賞處理的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[41-43]，起源于黑質(zhì)和腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)的DA能投射終止于紋狀體，其失調(diào)與許多神經(jīng)精神疾病有關(guān)。研究表明，自閉癥的特征可能是由DA信號(hào)異常引起或加重的[44]。5-HT是一種存在于大多數(shù)動(dòng)物門中的神經(jīng)調(diào)節(jié)劑，無(wú)論是在脊椎動(dòng)物還是無(wú)脊椎動(dòng)物中，5-HT系統(tǒng)都能調(diào)節(jié)認(rèn)知和行為功能，參與不同水平的應(yīng)激反應(yīng)和情緒障礙[45]。研究發(fā)現(xiàn)，杏仁核功能由富含5-HT的纖維進(jìn)行支配[46]，中縫背核的5-HT可通過(guò)對(duì)興奮性神經(jīng)元的直接抑制作用，或?qū)Ζ?氨基丁酸(GABA)能神經(jīng)元的激活作用來(lái)調(diào)節(jié)外側(cè)杏仁核(LA)突觸前平衡[47]。杏仁核興奮/抑制平衡的破壞最近被認(rèn)為是ASD中孤獨(dú)癥表型的一個(gè)原因[48]。此外，VP內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元接收來(lái)自NAcc的GABA能輸入[49]，在VP內(nèi)進(jìn)行局部連接，并向前額葉皮質(zhì)和基底外側(cè)杏仁核進(jìn)行外源性投射。本研究發(fā)現(xiàn)，在服用瑪卡后，小鼠血漿中5-HT及DA的含量較空白對(duì)照組顯著提高，且伴隨著社會(huì)腦區(qū)c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的增多，由此推測(cè)瑪卡對(duì)社會(huì)行為的改善可能是通過(guò)調(diào)節(jié)5-HT及DA水平而調(diào)控相關(guān)的腦區(qū)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

4 結(jié)論

本研究證實(shí)了瑪卡對(duì)ICR小鼠的自閉癥樣行為有顯著的改善作用，該作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)相應(yīng)的神經(jīng)遞質(zhì)水平進(jìn)而調(diào)控相關(guān)的腦區(qū)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，為自閉癥的防治提供了新的藥物研究證據(jù)及機(jī)制作用研究方向。