呂衛(wèi)兵,牛 彬,沙玉柱,魏 紅,史 浩,胡 江,王繼卿,李少斌,羅玉柱,劉 秀
(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730070)
藏綿羊主要分布在青藏高原地區(qū),是青藏高原最古老、特有的原始綿羊品種,為當(dāng)?shù)啬撩裉峁┝巳?、毛、皮等生活物品,是?dāng)?shù)夭豢苫蛉钡慕?jīng)濟(jì)動(dòng)物[1]。瘤胃是反芻動(dòng)物消化系統(tǒng)中最重要的消化器官,可以實(shí)現(xiàn)飼草的高效消化與吸收;也是反芻動(dòng)物免疫系統(tǒng)的重要組成部分,其中瘤胃上皮屏障在抵御疾病的過程中發(fā)揮著重要作用[2]。瘤胃內(nèi)含有大量的微生物,瘤胃微生物在飼草發(fā)酵和宿主能量供應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用[3],可以通過分解纖維素和半纖維素等宿主不能直接利用的物質(zhì),從而為宿主提供能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[4];除此之外,腸道微生物可以促進(jìn)初始B細(xì)胞的分化、激活B細(xì)胞的多種TLR(Toll like receptor)配體,增加B細(xì)胞存活、抗原呈遞和抗體產(chǎn)生,進(jìn)而調(diào)控宿主的免疫系統(tǒng)[5];腸道微生物還可以直接通過其代謝物(短鏈脂肪酸、膽汁酸和色氨酸等)參與宿主免疫代謝過程[6-7]。由于青藏高原獨(dú)特的自然環(huán)境和氣候條件,牧場(chǎng)的天然牧草在5月初開始發(fā)芽,10月初開始枯萎,枯草期牧草的粗蛋白(CP)、粗脂肪(EE)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量顯著下降[8]。而藏綿羊在漫長(zhǎng)的枯草期(10月至翌年4月)通過啃食枯草維持機(jī)體的基礎(chǔ)代謝并維持種群繁衍[9-10],這與瘤胃微生物的協(xié)同進(jìn)化作用有密不可分的聯(lián)系。
熱休克蛋白(Heat shock proteins,HSP)是一類對(duì)于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要的分子伴侶,在細(xì)胞應(yīng)對(duì)各種環(huán)境脅迫的過程中起著重要的保護(hù)作用[11]。熱休克蛋白70(HSP70)是目前研究最為廣泛的HSPs家族,它作為一種細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)蛋白,當(dāng)機(jī)體或細(xì)胞遭受應(yīng)激時(shí),可以通過一系列的表達(dá)調(diào)控機(jī)制使表達(dá)量顯著增加,并在一定的范圍內(nèi)通過維持機(jī)體或細(xì)胞的生理功能穩(wěn)態(tài)來抵御或減緩應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷[12],除此之外HSP70還在抗細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[13]。其中,HSPA1A和HSPA8是HSP70家族最重要的組成部分[14],且共同參與細(xì)胞凋亡過程,促進(jìn)HSP70抗凋亡性質(zhì)的發(fā)揮[15];HSPA1A可通過抑制細(xì)胞凋亡因子(如FAS和BAX),促進(jìn)抗細(xì)胞凋亡因子(如BCL2),發(fā)揮其抗細(xì)胞凋亡的特性[16-17];HSPA8作為促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊的伴侶蛋白,不僅有助于細(xì)胞各種功能活動(dòng)[18],還具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞干性和免疫調(diào)節(jié)功能[19-20]。青藏高原除了高寒、缺氧、紫外線強(qiáng)等環(huán)境特點(diǎn)外,冬季晝夜溫差大、短暫強(qiáng)降溫以及長(zhǎng)期寒冷環(huán)境刺激是造成藏綿羊生理機(jī)能失衡、導(dǎo)致免疫力和生產(chǎn)性能等下降的重要因素[21]。有研究報(bào)道,放牧藏綿羊瘤胃古菌種群(優(yōu)勢(shì)菌群)多樣性隨著牧草中結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量的升高而增大[22]。也有研究發(fā)現(xiàn),藏綿羊瘤胃微生物與其代謝產(chǎn)物存在相關(guān)性,并通過影響瘤胃上皮相關(guān)基因活性調(diào)控其適應(yīng)性[23]。因此,本研究對(duì)不同時(shí)期放牧藏綿羊瘤胃組織熱休克蛋白70家族基因(HSPA1A、HSPA8)的表達(dá)特征及其瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,探究不同時(shí)期宿主基因與微生物菌群在青藏高原特殊環(huán)境條件下的互作機(jī)制,為藏綿羊放牧管理、品種選育以及疾病預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。
試驗(yàn)樣本選取于甘肅省甘南藏族自治州合作市佐蓋曼瑪鄉(xiāng)(海拔3 300 m)牧戶藏綿羊群體中,羊群采用傳統(tǒng)自然放牧模式,且不進(jìn)行任何補(bǔ)飼。分別在4月、6月、10月和12月進(jìn)行樣品采集,每個(gè)時(shí)期選擇年齡相近(12±1月齡),體質(zhì)量相近(35.12 kg±1.43 kg)以及健康狀況良好的藏綿羊母羊6只,在羊只歸牧后的次日早晨利用羊用胃管式瘤胃采樣器采集瘤胃液(n=24),取適量分裝于凍存管中,編號(hào)后儲(chǔ)存于液氮中,以供后續(xù)16S rRNA分析。在采集每只羊的瘤胃液之前均需用蒸餾水將采集裝置的管道和容器沖洗干凈,防止樣品之間的交叉污染。隨后,從每個(gè)時(shí)期的6只藏綿羊母羊中隨機(jī)選取3只進(jìn)行頸部動(dòng)脈放血屠宰(n=12),立即解剖并選取瘤胃腹囊部位剪取適量組織,用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水和PBS緩沖液沖洗干凈,用吸水紙吸干多余的水分,分裝于1.5 mL離心管中,編號(hào)后迅速儲(chǔ)存于液氮罐中,帶回實(shí)驗(yàn)室后在-80 ℃保存,用于后續(xù)的RNA提取。
每份瘤胃組織樣品分別取100 mg,用Trizol提取瘤胃組織總RNA,然后將提取的RNA用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性,再通過蛋白核酸測(cè)定儀檢測(cè)RNA的純度和濃度,全部樣品的吸收比(A260/A280)為1.8~2.1。最后通過gDNAwiper酶的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。
以β-actin為內(nèi)參基因,用Premier 5.0對(duì)HSPA1A和HSPA8基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì),引物信息見表1。
表1 引物信息Table 1 Primer information
以β-actin為內(nèi)參基因,利用熒光定量PCR儀器(ABI Q6)進(jìn)行熒光定量。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;循環(huán)反應(yīng):95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán);每次循環(huán)的最后一步收集SYBR green熒光信號(hào),溶解曲線(95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s)。反應(yīng)體系:20 μL體系,含有2XChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix,cDNA模板和上下游引物。以β-actin作為內(nèi)參基因進(jìn)行 校正。
利用細(xì)菌DNA提取試劑盒MN NucleoSpin 96 Soi(Omega,中國(guó)上海)對(duì)24個(gè)瘤胃液樣本(每個(gè)時(shí)期6個(gè)樣本量,共4個(gè)時(shí)期)進(jìn)行瘤胃液微生物組DNA的提取。編碼細(xì)菌核糖體RNA的核酸序列保守區(qū)主要是16S區(qū),使用通用引物(正向引物338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和反向引物806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)16S rRNA基因高變區(qū)的V3~V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,采用兩步建庫(kù)法對(duì)瘤胃微生物進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序,將擴(kuò)增產(chǎn)物在Illumina MiSeq 2500(Illumina,San Diego,CA,USA)平臺(tái)進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序分析。對(duì) Reads 拼接過濾、質(zhì)控評(píng)估后,基于Silva(細(xì)菌)分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋,獲得各樣品在屬水平上的微生物群落信息。
HSPA1A和HSPA8的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT的計(jì)算方法進(jìn)行計(jì)算,最終試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示;使用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,采用單因素方差分析,顯著性水平為0.05。將瘤胃微生物的屬水平豐度排名前20的物種與基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析,采用Spearman 的方法進(jìn)行計(jì)算,Spearman 相關(guān)系數(shù)閾值為0.1,顯著性P值為0.05。
如圖1所示,不同時(shí)期藏綿羊瘤胃HSPA1A和HSPA8基因相對(duì)表達(dá)量存在顯著性差異。其中HSPA1A在6月的表達(dá)量顯著高于4月(P<0.05),極顯著高于10、12月(P<0.01),且6月的表達(dá)量分別是10月、12月的4.21倍和11.86倍;HSPA8在6月的表達(dá)量極顯著高于12月(P<0.01),且6月的表達(dá)量分別是10月、12月的2.93倍和9.19倍。
圖中不同小寫字母表示同一基因在不同時(shí)期的表達(dá)量存在顯著性差異(P<0.05)。下同
2.2.1 瘤胃微生物組成及多樣性分析 本研究對(duì)不同時(shí)期的24個(gè)樣品進(jìn)行16S rRNA測(cè)序,共獲得1 919 292對(duì) Reads,雙端Reads質(zhì)控、拼接后共產(chǎn)生1 835 963 條Clean Reads,每個(gè)樣品至少產(chǎn)生73 683條Clean Reads,平均產(chǎn)生76 498條Clean Reads。稀釋性曲線(圖 2-A)可知,在 20 000 reads處曲線趨于平緩,即樣本中的物種并不會(huì)隨測(cè)序數(shù)量的增加而顯著增多,測(cè)序覆蓋比較全面,測(cè)序數(shù)據(jù)可靠性高,可進(jìn)行后續(xù)的分析。根據(jù)Venn圖(圖 2-B)可見,不同時(shí)期藏綿羊瘤胃微生物共有978個(gè)OTUs,4月、6月、10月和12月特有OTU分別為14、4、3和1個(gè)。通過PCoA分析發(fā)現(xiàn)(圖 2-C),不同分組的樣品聚類明顯,不同分組微生物之間存在明顯差異。
圖2 稀釋性曲線 (A)、OTU分布 (B)和PCoA分析(C)Fig.2 Dilution curve(A),OTU distribution(B) and PCoA analysis(C)
由表2可知,瘤胃微生物測(cè)序共獲得1 223個(gè)OTU,并且測(cè)序覆蓋率達(dá)到99.6%以上,其中,4月有952個(gè),6月有819個(gè),10月有1030個(gè),12月有948個(gè)。由Shannon指數(shù)可知,4月和10月顯著高于其他時(shí)期(P<0.05),即4月和10月的物種多樣性顯著高于其他時(shí)期;ACE和Chao1指數(shù)均在10月顯著高于其他時(shí)期(P< 0.05),即10月的物種豐富度顯著高于其他時(shí)期。
表2 2 Alpha多樣性分析Table 2 Alpha diversity analysis
2.2.2 不同時(shí)期瘤胃微生物組成變化及差異性分析 在不同分類學(xué)水平,門水平共檢測(cè)出17個(gè)物種,屬水平共檢測(cè)出149個(gè)物種。在門水平(圖3-A),Bacteroidetes和Firmicutes在每個(gè)時(shí)期所占相對(duì)豐度的比例均最高,兩者之和占總豐度的83.3%以上,其中,Bacteroidetes占53.4%以上,F(xiàn)irmicutes占27.4%以上,為優(yōu)勢(shì)菌門。Patescibacteria的豐度比例在不同時(shí)期均高于1%,且在不同時(shí)期間存在顯著差異(P<0.05)。根據(jù)ANOVA(圖3-C)進(jìn)一步分析可知,門水平共有14個(gè)組間差異物種;豐度最高的Bacteroidetes在12月顯著高于6月和10月(P<0.05);Firmicutes豐度在6月顯著高于4月和12月(P< 0.05)。屬水平物種組成如圖3-B所示,其中,Prevotella_1、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Christensenellaceae _R-7_group、Ruminococcaceae_NK4A214_group、Prevotellaceae_UCG-001、Ruminococcaceae_UCG-014、Ruminococcus_1和uncultured_bacterium_f_F082在每個(gè)時(shí)期相對(duì)豐度均大于1%;其中Prevotella_1(18.2%以上)、Rikenellaceae_RC9_gut_group(9.2%以上)在每個(gè)時(shí)期豐度比例均最高,為優(yōu)勢(shì)菌屬。149個(gè)屬中共鑒定出108個(gè)差異物種(P<0.05),根據(jù)ANOVA(圖3-D)進(jìn)一步分析可知,Rikenellaceae_RC9_gut_group在12月顯著高于其他時(shí)期(P<0.05),Succiniclasticum和Butyrivibrio_2在6月顯著高于其他時(shí)期(P<0.05)。
* P<0.05,** P<0.01,*** P<0.001。下同
將不同時(shí)期HSPA1A和HSPA8的表達(dá)量與對(duì)應(yīng)時(shí)期的瘤胃微生物(屬水平豐度排名前20的物種)進(jìn)行相關(guān)性分析,由相關(guān)性熱圖(圖4)可知,HSPA1A、HSPA8與瘤胃微生物存在一定的相關(guān)性(P<0.05)。其中HSPA1A與Ruminococcaceae_NK4A214_group、Butyrivibrio_2、uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae、Prevotella_1、Succiniclasticum存在顯著正相關(guān),與Prevotellaceae_UCG-003、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Christensenellaceae_R-7_group、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group、Prevotellaceae_UCG-001存在顯著負(fù)相關(guān);HSPA8與uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae、Succiniclasticum、Ruminococcaceae_UCG-005、Prevotella_1、Ruminococcaceae_NK4A214_group存在顯著正相關(guān),與Rikenellaceae_RC9_gut_group、Christensenellaceae_R-7_group、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group、Prevotellaceae_UCG-001存在顯著負(fù)相關(guān)。
*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
當(dāng)動(dòng)物遭受應(yīng)激時(shí),細(xì)胞會(huì)顯著提高熱休克蛋白的水平來抵抗應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷[23]。一般來說,冷應(yīng)激對(duì)動(dòng)物免疫系統(tǒng)功能的影響主要是抑制性的。有研究發(fā)現(xiàn)HSP70表達(dá)量的增加,表明機(jī)體已遭受應(yīng)激性損傷,從而提高機(jī)體的自我保護(hù)機(jī)能,以便增強(qiáng)對(duì)外界不良刺激的抵抗力[24]。HSPA1A是應(yīng)激誘導(dǎo)性HSP70家族中最具有代表性的伴侶蛋白,此類蛋白在正常生理狀態(tài)下不表達(dá)或低表達(dá)[25]。本研究中HSPA1A和HSPA8在不同時(shí)期瘤胃中的表達(dá)量存在顯著差異,其中6月表達(dá)量顯著高于10月和12月。青藏高原牧場(chǎng)中青草期(6月至8月)牧草營(yíng)養(yǎng)含量(粗蛋白)高于返青期和枯草期,且生物量在8月達(dá)到巔峰[26];永結(jié)[27]研究發(fā)現(xiàn),藏綿羊免疫力在青草期達(dá)到峰值,可以有效抵御外來抗原的入侵,但在枯草期和返青期免疫力低下,發(fā)病率增加。這與本研究結(jié)果一致,即藏綿羊瘤胃的免疫力在6月增強(qiáng),而牧草的營(yíng)養(yǎng)含量的升高在一定范圍會(huì)提高藏綿羊瘤胃免疫力。
高原反芻動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)攝入模式隨季節(jié)變化而變化,牧草的營(yíng)養(yǎng)成分以及環(huán)境變化對(duì)宿主腸道微生物組成有顯著影響[28],在影響瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的眾多因素中,飲食是最重要的[29]。本研究中不同時(shí)期瘤胃微生物菌群豐度與多樣性存在顯著差異,這與不同時(shí)期牧草營(yíng)養(yǎng)成分的變化有關(guān)。Bacteroidetes的成員可以將飼料中蛋白質(zhì)和碳水化合物有效分解為SCFAs,為宿主提供能量[30],還可以促進(jìn)瘤胃的生長(zhǎng)和瘤胃體積的增加[31];Rikenellaceae_RC9_gut_group參與降解植物來源的多糖[32],其相對(duì)豐度隨著飼草纖維含量的增加而增加[33],本研究中,Bacteroidetes、Rikenellaceae_RC9_gut_group在12月顯著高于6月和10月,其主要功能是降解枯草期牧草中的多糖,更徹底地分解牧草,為機(jī)體提供更多的能量。Firmicutes可以促進(jìn)VFAs可以轉(zhuǎn)化為葡萄糖,并促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收,防止瘤胃酸中毒[31],Succiniclasticum可將琥珀酸鹽轉(zhuǎn)化為丙酸;Butyrivibrio_2屬于纖維分解菌,在瘤胃中對(duì)降解纖維素物質(zhì)產(chǎn)生VFAs起著關(guān)鍵作用[34-35];本研究中,F(xiàn)irmicutes、Succiniclasticum和Butyrivibrio_2在6月顯著高于4月和12月,其主要功能是在青草期防止瘤胃酸中毒而轉(zhuǎn)運(yùn)更多的VFAs,也進(jìn)一步為宿主提供更多的能量。Kim等[36]研究發(fā)現(xiàn)低海拔家畜瘤胃微生物中Bacteroidetes(31%)顯著低于Firmicutes(56%);而本研究所有時(shí)期的Bacteroidetes(53.5%)豐度顯著高于Firmicutes(27.4%),即青藏高原藏綿羊瘤胃中Bacteroidetes在牧草分解和能量供應(yīng)過程中發(fā)揮著更加重要的作用。Prevotella_1的豐度與飲食營(yíng)養(yǎng)的變化有關(guān)(如蛋白質(zhì)和淀粉的減少可導(dǎo)致Prevotella_1豐度的降低)[37],也與丙酸的產(chǎn)生有關(guān)[38];Christensenellaceae_R-7_group主要分解纖維物質(zhì)[39]。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),不同時(shí)期藏綿羊瘤胃微生物與HSPA1A和HSPA8存在一定的相關(guān)性,其中HSPA1A和HSPA8與Prevotella_1、Succiniclasticum存在顯著正相關(guān),與Rikenellaceae_RC9_gut_group、Christensenellaceae_R-7_group存在顯著負(fù)相關(guān);即瘤胃微生物在一定程度上可以對(duì)宿主的免疫功能產(chǎn)生影響,且HSPA1A和HSPA8的表達(dá)與牧草營(yíng)養(yǎng)成分含量呈正比,與纖維素含量呈反比。
不同時(shí)期放牧藏綿羊瘤胃上皮HSPA1A和HSPA8表達(dá)量以及瘤胃微生物菌群豐度和多樣性均存在一定差異,青草期(6月份)熱休克蛋白表達(dá)量顯著升高,從而導(dǎo)致其免疫力6月份顯著升高;而微生物菌群結(jié)構(gòu)隨著不同時(shí)期環(huán)境的變化,其微生物多樣和豐度發(fā)生顯著變化,主要體現(xiàn)在一些與纖維物質(zhì)降解、能量相關(guān)的差異微生物的變化,其目的是徹底分解牧草以達(dá)到對(duì)牧草的充分利用,為宿主提高更多的能量。進(jìn)一步相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),不同時(shí)期差異微生物與宿主上皮基因之間存在一定的相關(guān)性,表明瘤胃微生物在一定程度上可以對(duì)宿主的免疫功能產(chǎn)生影響。