HPLC-MS/MS法測定羅非魚中4種四環(huán)素類抗生素殘留量及不確定度評定

高云慨，陳小妹，陳春泉，肖 璇，鄭金明，尹青春

（海南省食品檢驗(yàn)檢測中心，國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（熱帶果蔬質(zhì)量與安全），海南?？?570100）

四環(huán)素類抗生素是由放線菌屬產(chǎn)生或半合成具有并四苯衍生物結(jié)構(gòu)特征的廣譜抑菌劑，對多數(shù)病原細(xì)菌具有較強(qiáng)抑制作用。在水產(chǎn)品養(yǎng)殖中，四環(huán)素、土霉素、金霉素和多西環(huán)素作為飼料添加劑和治療藥品被廣泛用于防治腸道感染和促生長[1]。隨著該類藥物的頻繁使用，由食物鏈富集導(dǎo)致的水產(chǎn)品藥物殘留越來越嚴(yán)重，超量的藥物殘留會對人體產(chǎn)生一定毒副作用，危害人類健康。因此，許多國家對水產(chǎn)品養(yǎng)殖中使用的抗生素進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)控。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，水產(chǎn)品肌肉組織中四環(huán)素類抗生素單個或組合殘留限量為200 μg·kg-1[2]。

不確定度分析是國際上推薦的用于定量評估測量的有效手段[3]，其大小決定了定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確性[4-5]。當(dāng)檢測結(jié)果在限值附近時，該評估對測量結(jié)果準(zhǔn)確性及可靠性具有重要作用[6]。目前國內(nèi)對水產(chǎn)品抗生素殘留的測定方法主要有HPLC和LC-MS/MS法[7-11]，但存在前處理復(fù)雜、用時長等問題。目前關(guān)于水產(chǎn)品中四環(huán)素、土霉素、金霉素和多西霉素殘留測定不確定度評定的相關(guān)信息鮮有報道。本研究參照《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[12]、《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》（CNAS—GL006：2019）有關(guān)規(guī)定[13]，對國標(biāo)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素殘留量的測定》（GB 31656.11—2021）[14]前處理過程進(jìn)行改進(jìn)，以羅非魚為基質(zhì)對4種四環(huán)素類抗生素殘留量的測量不確定度進(jìn)行分析評定，考察該檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時掌握該方法關(guān)鍵檢測環(huán)節(jié)，為其他水產(chǎn)品的測定及不確定度評定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

土霉素標(biāo)準(zhǔn)品：純度93.8%，CAS號64-75-5；金霉素標(biāo)準(zhǔn)品：純度81.5%，CAS號64-72-2；四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品：純度96.3%，CAS號2058-46-0；多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品：純度92.4%，CAS號24390-14-5，以上標(biāo)準(zhǔn)品為混標(biāo)，購自天津阿爾塔科技有限公司。乙酸乙酯（CH3COOC2H5）、乙腈（CH3CN）、甲醇（CH3OH）、正己烷（C6H6）、甲酸（HCOOH），以上試劑均為色譜純，購自上海安譜公司。

1.1.2 儀器

AB Sciex Triple Quad? 4500質(zhì)譜儀（AB 4500，美國SCTEX）；電子分析天平（XS204S，瑞士梅特勒）；超聲波清洗機(jī)（SK 7200，上?？茖?dǎo)超聲儀器）；氮吹儀（XcelVap-XCV 5400，美國Horizon）；固相萃取儀（W-SPE 24，美國LabTech）；PRime HLB固相萃取柱（6 CC/200 mg，美國Waters）；低溫冷凍離心機(jī)（5804R，德國Eppendorf）；手動移液器（德國Brand）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

稱取2.0 g羅非魚均質(zhì)樣品至50 mL干凈離心管中，加入10 mL乙腈（含1%甲酸），漩渦混勻后超聲10 min，于10 000 r·min-1下離心5 min；精確移取全部上清液至PRime HLB固相萃取柱，收集全部濾液于氮吹儀中40 ℃下吹至近干，最后用甲酸（0.1%）-乙腈定容至1 mL，搖勻后0.22 μm過膜，供質(zhì)譜分析。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備：按要求向標(biāo)準(zhǔn)品瓶中準(zhǔn)確加入1 mL甲醇溶液，旋渦混勻，制成含土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素的混標(biāo)儲備液，其濃度分別為 100.1 μg·mL-1、100.5 μg·mL-1、100.0 μg·mL-1和 100.3 μg·mL-1。

標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備：向10 mL容量瓶中準(zhǔn)確加入100 μL制備好的混標(biāo)儲備液，甲醇定容后超聲混勻，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，其濃度分別為1.001 μg·mL-1、1.005 μg·mL-1、1.000 μg·mL-1和 1.003 μg·mL-1。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：選擇6份陰性空白基質(zhì)，經(jīng)提取和凈化后依次加入 5 μL、10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、250 μL 制備好的混標(biāo)工作液，余下操作同1.2.2，得標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。

1.2.3 儀器條件

（1）色譜條件。Eclipse Plus-C18反相色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Agilent）；柱溫設(shè)置為40 ℃；流動相A為0.2%甲酸水溶液、B為純甲醇；流速為0.2 mL·min-1，洗脫程序見表 1。

表1 色譜梯度洗脫程序

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧電離源（ESI）；掃描模式為正離子模式；采集選用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；噴霧電壓4 500 V，關(guān)鍵質(zhì)譜條件參數(shù)見表2。

表2 4種抗生素化合物離子對和碰撞能量參數(shù)

1.2.4 不確定度數(shù)學(xué)模型的建立

羅非魚樣品抗生素含量計算公式：

式中：X為羅非魚樣品各組分殘留量，μg·kg-1；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取得到抗生素的濃度，ng·mL-1；V為羅非魚樣品提取液定容體積，mL；F為羅非魚樣品提取液稀釋倍數(shù)；m為羅非魚樣品取樣量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚樣品前處理過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(q)

2.1.1 樣品稱量過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)

樣品使用Mettler Toledo XS 204 萬分之一電子天平進(jìn)行稱量，經(jīng)檢定得該最大允許誤差為±0.05 mg，結(jié)合《數(shù)字指示秤檢定規(guī)程》（JJG 539—2016）[15]規(guī)定，按均勻分布，取則不確定度為稱量樣為2.0 g，計算得樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(m)=u(m)/m=1.44×10-5。

2.1.2 羅非魚樣品提取液定容引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(t)

樣品按1.2.1法處理后用定容至1 mL，根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[16]規(guī)定，20 ℃時，1 mL容量瓶容量允差為±0.01 mL，按均勻分布，取則容量允差的標(biāo)準(zhǔn)不確定度操作過程溫度為25 ℃，經(jīng)查甲醇膨脹系數(shù)為1.1×10-3℃-1，得出體積變化產(chǎn)生的不確定度為1 mL×1.1×10-3℃-1×5 ℃=0.005 5 mL，按均勻分布計算，則計算得該容量瓶定容引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

則羅非魚樣品前處理過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(p)

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品純度不確定度urel(pc)

以土霉素為例，土霉素標(biāo)準(zhǔn)品純度93.8%，其純度標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.2%。按均勻分布計算，取則

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(pr)

（1）1 mL容量瓶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(pr1)。容量瓶和移液器的使用是標(biāo)準(zhǔn)品稀釋過程引入不確定度的主要因素，根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）規(guī)定，20 ℃時，1 mL容量瓶容量允許誤差為±0.01 mL，按均勻分布計算，取則經(jīng)查乙腈膨脹系數(shù)為1.37×10-3℃-1，操作過程溫度為25 ℃，則體積變化產(chǎn)生的不確定度為 1×1.37×10-3×5=0.006 9 mL，按均勻分布計算，

（2）10 mL容量瓶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(pr2)。20 ℃時，10 mL的容量瓶容量允許誤差為±0.02 mL，按均勻分布計算，取則

經(jīng)查甲醇的膨脹系數(shù)為1.1×10-3℃-1，操作過程溫度為25 ℃，則體積變化產(chǎn)生的不確定度為10×1.1×10-3×5=0.055 mL，按均勻分布，則

（3）移液器引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(pr3)。根據(jù)《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）[17]及檢定證書，20 ℃時，100～1 000 μL移液器在吸取1 mL溶液時最大容量允差為1 000×1.0%，按均勻分布，取則經(jīng)查甲醇膨脹系數(shù)為1.1×10-3℃-1，操作過程溫度為25 ℃，則體積變化產(chǎn)生的不確定度為 1 000×1.1×10-3×5=3.175 μL，按均勻分布計算，則

同理，計算其他量程移液器的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。移液器移取不同體積溶液產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表3。

綜上所述，計算不同藥品的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。以土霉素為例，根據(jù)實(shí)際稀釋過程來選擇移液器，由表3計算可得標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，則

表3 移液器使用引入的不確定度

4種化合物配制過程中容量瓶及移液器使用情況均相同，同法計算，各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果見表4。

表4 不同藥品的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(p)

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(n)

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線按照方法要求對6個點(diǎn)進(jìn)行測定，經(jīng)最小二乘法線性擬合得到各化合物濃度與對應(yīng)峰面積及相應(yīng)線性方程，結(jié)果見表5。

表5 4種抗生素化合物標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度計算公式為

式中：S為擬合曲線標(biāo)準(zhǔn)偏差，b為線性回歸方程斜率；c為提取液各次測定得到的濃度；n為標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液測定總數(shù)（n=6）；p為提取液重復(fù)測定次數(shù)（p=6）；x為化合物各標(biāo)曲點(diǎn)濃度。

表6 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度相關(guān)值

2.4 合成相對不確定度評定

各化合物不確定度分量互不相關(guān)，綜合上述，羅非魚中土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素含量測定結(jié)果的合成相對不確定度結(jié)果見表7。

表7 4種抗生素化合物的合成相對不確定度

2.5 測量不確定度報告

羅非魚樣品中土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素含量檢測結(jié)果分別為 83.57 μg·kg-1、82.72 μg·kg-1、77.37 μg·kg-1、92.44 μg·kg-1，參照《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）和《化學(xué)分析測量不確定度評定》（JJF 1135—2005）[18]，在P=95%置信概率下，選擇包含因子k=2，以土霉素為例，則擴(kuò)展不確定度測定結(jié)果最終結(jié)果表示為Xt=（83.57±16.31）μg·kg-1（k=2）。同法計算，四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素的最終結(jié)果分別表示為Xs=（82.72±15.24）μg·kg-1(k=2）、Xj=（77.37±24.90）μg·kg-1（k=2）和Xd=（92.44±19.25）μg·kg-1（k=2）。

3 結(jié)論與討論

本研究相較于最新國標(biāo)方法，對前處理過程進(jìn)行兩方面的改進(jìn)，分別為采用乙腈（含1%甲酸）作為提取溶液代替乙二胺四乙酸二鈉、醋酸鉛的3次重復(fù)提取過程；采用PRime HLB固相萃取柱代替Oasis HLB萃取柱，凈化過程不需要活化、淋洗及洗脫。該方法的測量不確定度報告顯示的擴(kuò)展不確定度為15.24～24.90，許鶯婷等[19]測定魚粉中諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星殘留量，擴(kuò)展不確定度為3.42～38.84。結(jié)果表明，改進(jìn)后的方法操作簡單、分析時間短、準(zhǔn)確性高。

根據(jù)該方法的數(shù)學(xué)模型，對實(shí)驗(yàn)過程中樣品前處理、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合3個方面進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度最大，其次是樣品前處理過程。為減少標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中產(chǎn)生的誤差，建議使用較高純度標(biāo)準(zhǔn)品、定期校準(zhǔn)容量瓶及移液器。另外，通過增加平行樣及平行測定次數(shù)，從而提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。