結(jié)核分枝桿菌Rv2107基因編碼蛋白PE22的原核表達(dá)及生物信息學(xué)分析*

李玉潔，楊雨婷，楊國(guó)平,2△

(大理大學(xué):1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)微生物學(xué)及免疫學(xué)教研室；2.云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000)

結(jié)核病(TB)是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染引起的慢性傳染病，也是單一感染性病原體導(dǎo)致的最大死因[1]。WHO在《2021年全球結(jié)核病報(bào)告》中估計(jì)，2020年全球新增TB病例987萬(wàn)例，因TB死亡病例達(dá)128萬(wàn)例，TB仍對(duì)人類(lèi)生命健康造成嚴(yán)重威脅。因此，尋找MTB特異性抗原以用于早期免疫學(xué)診斷對(duì)于TB的防治意義重大[1]。PE/PPE蛋白是MTB獨(dú)有的蛋白家族，參與MTB與宿主細(xì)胞間的相互作用，其編碼基因約占MTB整個(gè)基因組的10%，對(duì)MTB的毒力、抗原變異及免疫逃逸作用至關(guān)重要[2]。Rv2107基因編碼的PE22蛋白為PE蛋白家族成員之一，能夠抑制巨噬細(xì)胞的凋亡，從而增強(qiáng)恥垢分枝桿菌在巨噬細(xì)胞中的存活[3]，且PE22/PPE36蛋白復(fù)合物可能共同分泌并定位于細(xì)胞表面，作為血紅素受體發(fā)揮作用，競(jìng)爭(zhēng)性地獲取宿主細(xì)胞鐵離子，最終有利于MTB的生長(zhǎng)和致病[4]。上述研究表明，PE22可能作為MTB的毒力因子參與機(jī)體MTB感染過(guò)程中的抗原變異和免疫逃逸過(guò)程，但其生物學(xué)功能尚未得到證實(shí)。為此，本研究對(duì)Rv2107基因編碼的PE22蛋白進(jìn)行原核表達(dá)與生物信息學(xué)分析，為PE22蛋白在MTB感染過(guò)程中發(fā)揮的免疫學(xué)功能及作為疫苗候選抗原的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒 卡介苗(BCG)菌株和pET-32a表達(dá)質(zhì)粒均由大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)微生物學(xué)及免疫學(xué)教研室保存并提供。

1.1.2主要試劑及儀器 大腸埃希桿菌(E.coli) DH5α菌株、E.coliBL21(DE3)菌株、DNA2000 Marker、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒與Pro-light辣根過(guò)氧化物酶(HRP)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑均購(gòu)于北京天根生化科技有限公司；pMD18-T載體購(gòu)于北京Takara公司；T4 DNA連接酶購(gòu)于上海Themo Fisher公司；限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ購(gòu)于上海Fermentas公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、鎳離子金屬鰲合親和層析介質(zhì)(Ni-NTA)、蛋白 Marker與小鼠抗組氨酸(his)標(biāo)簽抗體均購(gòu)于北京Solarbio公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠免疫蛋白G(IgG)購(gòu)于北京中杉公司。HZQ-X500大型恒溫振蕩器購(gòu)于上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ABI 2720 PCR儀、Nanodrop 2000微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)均購(gòu)于上海Themo Fisher公司；5804R冷凍高速離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司；Scientz-ⅡD超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購(gòu)于寧波新芝生物科技股份有限公司；EV-180垂直電泳槽、Gel DocTMEZ全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)于上海Bio-Rad公司；Image Quant LAS 4000 mini化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)于杭州Ge Healthcare Bio Sciences Ab公司。

1.2方法

1.2.1Rv2107基因的PCR擴(kuò)增及重組表達(dá)質(zhì)粒PE22-pET-32a的構(gòu)建 通過(guò)Primer Premier 5.0軟件對(duì)Rv2107的基因序列進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析及上下游引物設(shè)計(jì)，并交由昆明擎科生物公司合成。以BCG基因組(H37Rv中Rv2107基因與BCG完全一致)為模板，Rv2107-F(正向)：5′-GGAATTCATGTCCT TTGTG-3′為上游引物，Rv2107-R(反向)：5′-CCCAAGCTTTTAGAAACC-3′為下游引物，PCR擴(kuò)增Rv2107基因。反應(yīng)體系25 μL：DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，PCR Mix 12.5 μL，加雙蒸餾水(ddH2O)至25 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。Rv2107基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收后連接至pMD18-T載體，熱擊轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)含氨芐青霉素的LB固體選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)后PCR及雙酶切鑒定，對(duì)鑒定正確的重組質(zhì)粒PE22-pMD18-T送昆明擎科公司測(cè)序鑒定。EcoRⅠ、Hind Ⅲ雙酶切測(cè)序正確的重組質(zhì)粒PE22-pMD18-T及表達(dá)載體pET-32a，將于pMD18-T載體上酶切的Rv2107基因經(jīng)T4 DNA連接酶連接至pET-32a載體，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒PE22-pET-32a后熱擊轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)含氨芐青霉素的LB固體選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)后，挑取陽(yáng)性單克隆菌落并PCR鑒定陽(yáng)性菌落。提取重組表達(dá)質(zhì)粒PE22-pET-32a后熱擊轉(zhuǎn)入E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，獲得含PE22-pET-32a的BL-21菌株，并PCR鑒定陽(yáng)性菌落。

1.2.2PE22蛋白的表達(dá)、純化及鑒定 含重組質(zhì)粒PE22-pET-32a的BL-21菌株在200 r/min、37 ℃條件于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日以1∶100比例擴(kuò)大培養(yǎng)至A600 nm值為0.6，異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(終濃度0.5 mmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)6 h后，離心收集菌體并超聲破碎，對(duì)上清及沉淀進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分析，檢測(cè)蛋白表達(dá)形式。將沉淀中以包涵體形式表達(dá)的PE22蛋白以8 mol/L尿素溶液溶解變性，采用Ni-NTA純化，經(jīng)6、4、2、0 mol/L尿素溶液依次復(fù)性后，使用10、20、50 mmol/L咪唑溶液依次洗滌雜蛋白，以500 mmol/L咪唑溶液洗脫獲得目的蛋白。得到的純化PE22蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，300 mA、65 min濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，經(jīng)TBST緩沖液洗滌3次后，以小鼠抗his標(biāo)簽抗體為一抗室溫孵育1 h后4 ℃孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗室溫孵育1 h，Pro-light HRP化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑為顯影劑進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法(Western bolt)鑒定。

1.2.3PE22蛋白的生物信息學(xué)分析 通過(guò)Expasy ProtParam軟件分析PE22蛋白的理化性質(zhì)，TMHMM Server v.2.0和SignalP 5.0 Server軟件預(yù)測(cè)PE22蛋白的跨膜區(qū)和信號(hào)肽，NetPhos-3.1軟件預(yù)測(cè)PE22蛋白的磷酸化位點(diǎn)，Motif Scan軟件預(yù)測(cè)PE22蛋白的翻譯后修飾位點(diǎn)，Cell-PLoc2.0軟件預(yù)測(cè)PE22蛋白的亞細(xì)胞定位，SOPMA軟件預(yù)測(cè)PE22蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，SWISS MODEL軟件預(yù)測(cè)PE22蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，ABCpred和SYFPEITHI軟件預(yù)測(cè)PE22蛋白的抗原表位。

2 結(jié) 果

2.1Rv2107基因的PCR擴(kuò)增及重組表達(dá)質(zhì)粒PE22-pET-32a的構(gòu)建 以BCG基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小約為297 bp的特異性片段，與預(yù)期一致，表明目的基因Rv2107擴(kuò)增成功，見(jiàn)圖1A。連接Rv2107基因至pMD18-T載體獲得重組克隆質(zhì)粒PE22-pMD18-T，并經(jīng)EcoRⅠ、Hind Ⅲ雙酶切后，獲得297 bp大小的清晰條帶，測(cè)序鑒定表明Rv2107的PCR產(chǎn)物與NCBI中NC_000962.3序列完全一致，表明重組克隆質(zhì)粒PE22-pMD18-T構(gòu)建成功，見(jiàn)圖1B。將PE22-pMD18-T重組克隆質(zhì)粒上酶切下的Rv2107基因克隆至pET-32a表達(dá)載體，獲得含PE22-pET-32a的DH5α菌，經(jīng)PCR陽(yáng)性鑒定獲得297 bp大小的特異性片段，見(jiàn)圖1C。

A.Rv2107的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(M為DNA Marker；1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)；B.重組克隆質(zhì)粒PE22-pMD18-T的雙酶切鑒定(M為DNA Marker；1為PCR產(chǎn)物；2為雙酶切產(chǎn)物)；C.含重組表達(dá)質(zhì)粒PE22-pET-32a的DH5α菌的菌落PCR鑒定(M為DNA Marker；1、2為陽(yáng)性菌落的PCR產(chǎn)物)。

2.2PE22蛋白的表達(dá)、純化及鑒定 提取含重組表達(dá)質(zhì)粒PE22-pET-32a的DH5α菌的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE電泳分析得出，PE22蛋白以包涵體形式表達(dá)；誘導(dǎo)表達(dá)的PE22蛋白經(jīng)Ni-NTA純化、500 mmol/L咪唑溶液洗脫后可見(jiàn)大小約為29 000的單一目的條帶，與預(yù)期一致，見(jiàn)圖2A。Western blot顯示，相對(duì)分子質(zhì)量29 000大小位置處可見(jiàn)清晰條帶，見(jiàn)圖2B。

A.PE22蛋白的SDS-PAGE電泳分析(M為Marker；1為誘導(dǎo)沉淀；2為誘導(dǎo)上清；3為空載誘導(dǎo)沉淀；4為空載誘導(dǎo)上清；5為純化PE22蛋白)； B.Western blot鑒定PE22蛋白(M為Marker；1為PE22蛋白)。

2.3PE22蛋白的生物信息學(xué)分析

2.3.1PE22蛋白的一般理化性質(zhì) 通過(guò)Expasy ProtParam軟件對(duì)PE22蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示PE22蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為10 373.77，理論等電點(diǎn)為6.82，分子式為C463H722N126O139S3，由98個(gè)氨基酸組成，其中丙氨酸(Ala)占17.3%，纈氨酸(Val)占10.2%，絲氨酸(Ser)占9.2%，帶正電荷的氨基酸殘基(Asp、Glu)總數(shù)為7，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Arg、Lys)總數(shù)為7。PE22蛋白的脂肪族氨基酸指數(shù)為81.18%，在A280 nm波長(zhǎng)處消光系數(shù)為4470，不穩(wěn)定指數(shù)為23.29，屬于穩(wěn)定蛋白，親水性平均系數(shù)為0.121。通過(guò)ProtScaleon Expasy軟件對(duì)PE22蛋白的親疏水性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示單個(gè)氨基酸的親水系數(shù)最小值為-1.722，最大值為1.733，預(yù)測(cè)PE22蛋白為疏水性蛋白。見(jiàn)圖3。

圖3 PE22蛋白親疏水性預(yù)測(cè)

2.3.2PE22蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、磷酸化位點(diǎn)及翻譯后修飾位點(diǎn) 通過(guò)TMHMM Server v.2.0軟件對(duì)PE22蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示PE22蛋白無(wú)跨膜區(qū)，為非跨膜蛋白。見(jiàn)圖4。

圖4 PE22蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)

通過(guò)SignalP 5.0 Server軟件對(duì)PE22蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示PE22蛋白N端無(wú)信號(hào)肽序列，為非分泌蛋白，可能不發(fā)生跨膜轉(zhuǎn)移，只于合成處發(fā)揮作用。見(jiàn)圖5。

圖5 PE22蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)

通過(guò)Cell-PLoc 2.0軟件對(duì)PE22蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示PE22蛋白定位于細(xì)胞壁,可能為MTB表面細(xì)胞壁蛋白，介導(dǎo)MTB與宿主細(xì)胞間的相互作用；通過(guò)NetPhos-3.1軟件對(duì)PE22蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示PE22蛋白含4個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，4個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。見(jiàn)圖6。

圖6 PE22蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)Motif Scan軟件對(duì)PE22蛋白的翻譯后修飾位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示PE22蛋白含有N-豆蔻酰化位點(diǎn)(10～15、22～27位)、蛋白激酶A磷酸化位點(diǎn)(49～52位)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(36～38、48～50位)，磷酸化有利于蛋白質(zhì)的活性與功能并可催化蛋白質(zhì)間的相互作用，表明PE22蛋白可能通過(guò)調(diào)控宿主細(xì)胞生命活動(dòng)發(fā)揮生物學(xué)功能。

2.3.3PE22蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu) 通過(guò)SOPMA軟件對(duì)PE22蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示PE22蛋白含α-螺旋(Hh)結(jié)構(gòu)70個(gè)，占71.43%，無(wú)規(guī)則卷曲(Cc)結(jié)構(gòu)16個(gè)，占16.33%，β-轉(zhuǎn)角(Tt)結(jié)構(gòu)7個(gè)，占7.14%，延伸鏈(Ee)結(jié)構(gòu)5個(gè)，占5.10%，見(jiàn)圖7，其無(wú)規(guī)則卷曲含量較高，表明PE22蛋白容易與抗體嵌合，從而發(fā)揮抗原作用。

圖7 PE22蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)SWISS MODEL軟件對(duì)PE22蛋白序列進(jìn)行分析，以PE25-PPE41-EspG5三聚體復(fù)合物為模板構(gòu)建PE22蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)同源模型，見(jiàn)圖8。其Hh含量較高，與蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)相符，GMQE(全球性模型質(zhì)量評(píng)估)值0.68，QMEAN(定性模型分析)值0.73。

圖8 PE22蛋白同源建模三級(jí)結(jié)構(gòu)

2.3.4PE22蛋白的抗原表位 通過(guò)ABCpred軟件對(duì)PE22蛋白序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示PE22蛋白含有10個(gè)B細(xì)胞抗原表位(臨界值0.68)。見(jiàn)表1。

表1 PE22蛋白B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)

續(xù)表1 PE22蛋白B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)

通過(guò)SYFPEITHI軟件對(duì)PE22蛋白序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示PE22蛋白含有13個(gè)T細(xì)胞抗原表位(臨界值13)。見(jiàn)表2。

表2 PE22蛋白T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)

通過(guò)SYFPEITHI軟件對(duì)PE22蛋白序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示PE22蛋白含有12個(gè)限制性CTL細(xì)胞表位(臨界值16)。見(jiàn)表3。

表3 PE22蛋白CTL細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)

3 討 論

TB是威脅人類(lèi)生命健康的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，篩選MTB特異性抗原，建立快速、敏感的生物分子診斷檢測(cè)可輔助篩查T(mén)B，有效控制TB的傳播，具有十分廣闊的發(fā)展前景[5]。而生物信息學(xué)以基因組DNA序列信息為源頭模擬蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，從而預(yù)測(cè)特定蛋白的功能，可有效篩選特異性抗原，已廣泛應(yīng)用于多種疾病的診斷與藥物、疫苗的研發(fā)[6-7]。

研究表明，Rv2107基因編碼的PE22蛋白可通過(guò)參與MTB對(duì)宿主細(xì)胞鐵離子的攝取，促進(jìn)機(jī)體MTB的生長(zhǎng)和致病，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，可能具有較強(qiáng)的免疫原性，有望成為T(mén)B疫苗的靶點(diǎn)。因此，進(jìn)一步分析PE22蛋白在Mtb感染過(guò)程中的作用機(jī)制可為T(mén)B的防治提供新的思路[8-9]。本實(shí)驗(yàn)將經(jīng)PCR擴(kuò)增的Rv2107基因克隆至表達(dá)載體pET-32a，并經(jīng)PCR陽(yáng)性鑒定證實(shí)重組質(zhì)粒PE22-pET-32a構(gòu)建成功，且含重組質(zhì)粒PE22-pET-32a的BL21菌株表達(dá)蛋白以包涵體形式存在。而生物信息學(xué)分析顯示，PE22蛋白為疏水性蛋白，這也與原核表達(dá)獲得包涵體形式表達(dá)的PE22蛋白一致。研究表明，E.coli大腸桿菌內(nèi)不溶性蛋白質(zhì)顆粒大量積累、聚集、折疊不完全而形成的包涵體，由于包埋了酶攻擊的位點(diǎn)，可以最大限度地抵抗宿主細(xì)胞蛋白酶的攻擊，有效發(fā)揮抗原作用；研究表明，蛋白的磷酸化修飾可影響包括蛋白酶活性調(diào)節(jié)、蛋白構(gòu)象改變、蛋白相互作用、蛋白穩(wěn)定性及連接其他蛋白分子能力在內(nèi)的細(xì)胞生命活動(dòng)的所有過(guò)程，而PE22蛋白含有的多個(gè)磷酸化位點(diǎn)及翻譯后修飾位點(diǎn)顯示PE22蛋白可能參與調(diào)控宿主細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的磷酸化狀態(tài)，介導(dǎo)細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[10-11]；蛋白跨膜區(qū)、信號(hào)肽及亞細(xì)胞定位分析表明PE22蛋白為細(xì)胞壁相關(guān)蛋白，暴露于細(xì)菌表面，無(wú)跨膜區(qū)與信號(hào)肽，可能通過(guò)促進(jìn)MTB與宿主間的相互作用促進(jìn)機(jī)體MTB的擴(kuò)散。這些研究提示，PE22蛋白可能具有較強(qiáng)的免疫原性，通過(guò)激活機(jī)體免疫反應(yīng)發(fā)揮免疫防御效應(yīng)。此外，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明PE22蛋白含有大量Hh (71.43%)與Cc (16.33%)結(jié)構(gòu)，其中Hh模體為保守序列，在DNA結(jié)合基序中發(fā)揮重要作用，Cc多含有B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位，有利于蛋白質(zhì)與抗體的嵌合[12-13]；抗原表位綜合分析表明，PE22蛋白含有多個(gè)B細(xì)胞、T細(xì)胞抗原表位，其中B細(xì)胞抗原表位可與游離的抗體分子結(jié)合激活機(jī)體體液免疫，T細(xì)胞抗原表位可與機(jī)體T淋巴細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合激活細(xì)胞免疫，這些分析提示PE22蛋白可作為潛在抗原用于免疫診斷或TB疫苗的研究[14]。而由于預(yù)測(cè)軟件的局限性和機(jī)體免疫反應(yīng)的復(fù)雜性，PE22蛋白在MTB感染過(guò)程中發(fā)揮的作用尚不明確，但可以此為參考推測(cè)蛋白的功能并篩選出新的抗原靶位，用于新型結(jié)核疫苗的研制。

綜上所述，重組表達(dá)質(zhì)粒PE22-pET-32a轉(zhuǎn)入BL21菌株后可經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、親和層析法純化得到重組蛋白PE22，為進(jìn)一步研究蛋白的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)。而生物信息學(xué)分析表明PE22蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，可通過(guò)激活機(jī)體免疫反應(yīng)發(fā)揮抗MTB感染作用，并作為優(yōu)勢(shì)抗原用于TB早期診斷或候選疫苗的研究。后續(xù)將通過(guò)研究PE22蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響進(jìn)一步分析PE22在MTB感染過(guò)程中發(fā)揮的作用，以期有助于TB的防治。