Ac-SDKP對(duì)矽肺小鼠模型RANKL信號(hào)的調(diào)節(jié)作用*

靳馥宇，王曉菁，李雅倩，李 田，楊欣雨，徐 洪△

(1.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 唐山 063000；2.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063000)

矽肺病是我國最嚴(yán)重的職業(yè)病之一，是長期吸入游離二氧化硅所致的肺部疾病。目前，有研究認(rèn)為，巨噬細(xì)胞吞噬二氧化硅引起肺部炎性反應(yīng)，最終導(dǎo)致肺纖維化和結(jié)節(jié)性病變的形成[1]。有研究顯示，在塵肺病患者和矽肺馬中均發(fā)現(xiàn)了骨密度下降和骨質(zhì)疏松癥[2-4]。因此，推測(cè)矽肺病和骨質(zhì)疏松癥可能具有共同的信號(hào)傳導(dǎo)通路，核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)信號(hào)是破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵信號(hào)通路[5]，RANKL通過信號(hào)受體RANK傳遞信號(hào)。通過激活破骨細(xì)胞生成的活化T細(xì)胞核因子1(NFATc1)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成，表達(dá)破骨細(xì)胞基因[6]?？咕剖崴嵝粤姿崦?TRAP)是破骨細(xì)胞分化的重要標(biāo)記物之一，且其在慢性阻塞性肺疾病和哮喘患者的肺組織中均檢測(cè)出TRAP的陽性表達(dá)[7-8]，證實(shí)肺部疾病與破骨細(xì)胞活化可能具有相同的信號(hào)傳導(dǎo)通路。N-乙?；?絲氨酰-天冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)是一種體內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)調(diào)節(jié)肽，本課題組前期研究證明其具有抑制矽肺大鼠肺纖維化的作用。因此，本研究擬通過體內(nèi)研究觀察RANKL信號(hào)在矽肺小鼠模型中是否被激活，且Ac-SDKP能否通過調(diào)節(jié)RANKL信號(hào)發(fā)揮拮抗矽肺小鼠的作用及其效果。

1 材料與方法

1.1材料 二氧化硅(SiO2)粉塵購于美國Sigma公司；Ac-SDKP購于瑞士Bachem AG公司；破骨細(xì)胞染色試劑盒購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；彈力蛋白染色試劑盒購于中國珠海貝索生物技術(shù)有限公司；熒光二抗購于美國Novex公司；DAPI購于美國Cell Signaling Technology公司；CD68購于美國Abcam公司；基質(zhì)金屬蛋白酶-12(MMP-12)購于中國浙江華安生物科技有限公司；RANKL購于中國臺(tái)灣Arigo公司；OC-STAMP購于美國FabGennix公司；AP-1購于中國臺(tái)灣Arigo生物公司；NFATc1購于美國Affinity公司；NF-κB購于中國臺(tái)灣Arigo 生物公司；免疫印跡二抗購于美國KPL公司；ECL發(fā)光試劑購于中國北京莊盟生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)性矽肺模型的建立 選取4周齡SPF級(jí)雄性C57/BL6小鼠(18只)，平均體重(20±5)g，購于北京維通利華動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXY(京)2016-0008]，飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障實(shí)驗(yàn)室[SYXK(冀)2020-0007]，晝夜交替，自由飲水。經(jīng)華北理工大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(LX2019035)。

采用一次性氣管灌注SiO2粉塵溶液制備矽肺小鼠模型，每組6只小鼠，實(shí)驗(yàn)分組為：(1)對(duì)照組，氣管灌注50 μL 的0.9%氯化鈉溶液飼養(yǎng)4周；(2)模型組，氣管灌注50 μL的 SiO2(50 mg/mL)粉塵溶液飼養(yǎng)4周 ；(3)Ac-SDKP治療組，氣管灌注50 μL的SiO2(50 mg/mL)粉塵溶液，頸后皮下埋入微量緩釋膠囊[含800 μg/(kg·d)]Ac-SDKP飼養(yǎng)4周。造模結(jié)束后，小鼠用戊巴比妥麻醉，取出小鼠肺組織，左肺經(jīng)4%多聚甲醛固定，其余肺組織置于-80 ℃冰箱凍存，固定結(jié)束的肺組織經(jīng)石蠟包埋后切片，做染色處理。

1.2.2TRAP染色 切片脫蠟至水，TRAP染色液覆蓋組織，37 ℃孵育過夜，甲基綠復(fù)染，自來水沖去多余液體，自然風(fēng)干，放入二甲苯中，中性樹膠封片。選取肺組織中6個(gè)視野，采用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行陽性細(xì)胞數(shù)的定量分析。

1.2.3免疫組織化學(xué)染色 切片脫蠟至水，抗原修復(fù)后，孵育一抗MMP-12(1∶200)，4 ℃孵育過夜，次日免疫組化二抗37 ℃孵育30 min，蘇木精染核，細(xì)胞棕染定義為陽性。

1.2.4免疫熒光染色 切片脫蠟至水，抗原修復(fù)后，孵育一抗RANKL/CD68(稀釋比均為1∶100)，4 ℃孵育過夜，次日用二抗驢抗兔TRITC和驢抗鼠FITC 37 ℃孵育90 min，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核，鏡下觀察陽性染色。待掃圖后，將切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(HE染色)。

1.2.5彈力蛋白染色 切片脫蠟至水，操作步驟按說明書進(jìn)行，對(duì)切片進(jìn)行彈力蛋白染色和VG染色，使用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行分色處理，使用Image-Pro Plus軟件觀察并分析彈力纖維和膠原纖維的染色面積。

1.2.6免疫印跡 采用蛋白提取試劑盒提取組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，以每泳道15 μg進(jìn)行電泳及電轉(zhuǎn)。一抗RANKL、OC-STAMP、AP-1、NFATc1、NF-κB和MMP-12，稀釋比為1∶1 000，4 ℃過夜；二抗(1∶5 000)37 ℃孵育40 min，ECL發(fā)光試劑盒顯色。采用Image-Pro-plus 6.0圖像處理軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，將吸光度值與α-TUB的吸光度值標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用Graphpad8.0進(jìn)行繪圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為吸光度比值。

2 結(jié) 果

2.1Ac-SDKP對(duì)矽肺小鼠彈力蛋白的影響 彈力蛋白染色結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織彈性纖維表達(dá)下調(diào)，膠原含量表達(dá)上調(diào)，Ac-SDKP治療組中彈性纖維表達(dá)上調(diào)，膠原含量表達(dá)下調(diào)，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 Ac-SDKP對(duì)小鼠肺組織彈力纖維和膠原沉積的調(diào)節(jié)作用(20×)

表1 Ac-SDKP對(duì)矽肺小鼠肺組織彈力纖維和膠原纖維的影響

2.2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 與對(duì)照組比較，矽肺模型組小鼠肺組織中MMP-12表達(dá)增多，Ac-SDKP處理后，小鼠肺組織中MMP-12表達(dá)減少。見圖2。

圖2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(40×)

2.3Ac-SDKP對(duì)矽肺小鼠肺組織中RANKL信號(hào)的影響 免疫熒光結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織中RANKL和CD68陽性共表達(dá)面積增多，且主要定位于矽結(jié)節(jié)中的巨噬細(xì)胞中，而Ac-SDKP治療組中RANKL和CD68陽性共表達(dá)面積減少。見圖3。

圖3 免疫熒光結(jié)果(免疫熒光染色，40×)

2.4TRAP染色結(jié)果TRAP染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，模型組小鼠肺組織TRAP陽性細(xì)胞染色數(shù)目顯著上調(diào)，而Ac-SDKP治療組中TRAP陽性細(xì)胞染色數(shù)目顯著下調(diào)。見圖4、表2。

圖4 小鼠肺組織TRAP染色(40×)

表2 Ac-SDKP對(duì)矽肺小鼠肺組織TRAP染色的影響

2.5免疫印跡結(jié)果 與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織中RANKL信號(hào)和MMP-12蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，而與模型組比較，Ac-SDKP治療組小鼠RANKL信號(hào)和MMP-12蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 AC-SDKP對(duì)矽肺小鼠RANKL、OC-STAMP、AP-1、NFATc1、NF-κB和MMP-12蛋白水平的作用

3 討 論

巨噬細(xì)胞的融合和多核化在多種慢性炎癥疾病中體現(xiàn)為多核巨噬細(xì)胞形成和破骨細(xì)胞形成，且其來源相同，也遵循著類似的信號(hào)傳導(dǎo)途徑[5]，RANK/RANKL信號(hào)是破骨細(xì)胞形成的重要信號(hào)傳導(dǎo)通路，成骨細(xì)胞分泌的RANKL與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞膜上的受體RANK相結(jié)合，通過其下游轉(zhuǎn)錄因子的一系列變化，介導(dǎo)破骨細(xì)胞的生成[9]。破骨細(xì)胞形成的主要標(biāo)志為多核巨噬細(xì)胞的形成且其呈現(xiàn)TRAP陽性著色[10-11]。目前尚少見關(guān)于RANK/RANKL信號(hào)的活化在小鼠矽肺模型中的作用，本研究旨在研究矽肺小鼠肺組織中RANKL信號(hào)是否被激活的情況。

有文獻(xiàn)報(bào)道，在過敏性氣道炎癥小鼠模型中，阻斷RANKL信號(hào)的傳遞，可以有效地拮抗小鼠過敏性氣道炎癥的進(jìn)展[12]。此外，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎-間質(zhì)性肺疾病[13]和肺癌骨轉(zhuǎn)移[14]模型中，均發(fā)現(xiàn)RANKL信號(hào)表達(dá)上調(diào)，提示在肺損傷模型中存在著RANKL信號(hào)的激活。也有研究顯示，在小鼠肺組織中檢出了RANKL mRNA的表達(dá)[15]。

本研究結(jié)果也顯示，模型組矽結(jié)節(jié)內(nèi)多核巨細(xì)胞和結(jié)節(jié)周邊的單核巨噬細(xì)胞中均有TRAP陽性染色。免疫熒光結(jié)果顯示，RANKL主要定位于矽結(jié)節(jié)內(nèi)CD68標(biāo)記的巨噬細(xì)胞中。另外，在模型組中，發(fā)現(xiàn)了RANKL信號(hào)通路的蛋白水平表達(dá)均上調(diào)，提示SiO2能夠介導(dǎo)小鼠矽肺模型肺組織中RANKL信號(hào)的激活。

為了進(jìn)一步研究RANKL信號(hào)在矽肺小鼠模型中的功能和作用，因此檢測(cè)了MMP-12的表達(dá)水平。MMP-12是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的成員之一，是由巨噬細(xì)胞分泌的一種內(nèi)切蛋白酶，能夠降解彈性蛋白以及其他細(xì)胞外基質(zhì)成分。有研究顯示，在肺氣腫模型中，抑制MMP-12的活性，可以有效地保護(hù)肺組織彈性纖維網(wǎng)[16]，且在慢性阻塞性肺疾病大鼠模型中，MMP-12表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致彈性纖維網(wǎng)破壞，肺泡壁變薄[17]。在急性肺損傷的小鼠模型中，肺組織內(nèi)MMP-12蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)[18]。在博來霉素所致小鼠肺纖維化模型中，小鼠肺內(nèi)MMP-12 mRNA的表達(dá)和膠原蛋白含量均上調(diào)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，MMP-12在小鼠矽肺模型中蛋白表達(dá)水平上調(diào)，彈力蛋白水平降低，同時(shí)伴有膠原纖維面積增多。提示SiO2能夠介導(dǎo)RANKL信號(hào)的活化，并且使巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)類似破骨細(xì)胞的多核化表型及相關(guān)酶的表達(dá)。

Ac-SDKP是存在于所有哺乳動(dòng)物體中，是一種通過丙基寡肽酶對(duì)胸腺素β4的N端序列作用所產(chǎn)生的具有免疫調(diào)節(jié)作用的促血管生成肽[20]。在多種纖維化模型中均起到拮抗器官纖維化的作用，如心臟纖維化和腎臟纖維化[21- 22]。本研究結(jié)果也顯示，Ac-SDKP減少矽肺小鼠肺組織中TRAP陽性表達(dá)的多核巨噬細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞數(shù)量；免疫熒光結(jié)果也顯示，Ac-SDKP處理后，小鼠肺組織 CD68/RANKL共表達(dá)面積減少。

綜上所述，即Ac-SDKP能夠通過抑制肺組織中巨噬細(xì)胞RANKL信號(hào)的活化，以拮抗小鼠矽肺纖維化進(jìn)程。