非洲豬瘟研究進(jìn)展

吳萌萌，張棟良，孫彩虹，李 罡，董 釗，王 新

(西安市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西 西安 710061)

1 病原

ASFV為非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)非洲豬瘟病毒屬(Asfarvirus)的線性雙鏈DNA蟲媒病毒。病毒粒子結(jié)構(gòu)呈20面體，直徑在170～190 nm之間，自外向內(nèi)由外膜 (External envelope)、衣殼 (Capsid)、內(nèi)膜 (Inner envelope)、核心殼(Core shell)和病毒擬核基因組(Nucleoid)五部分組成。病毒基因組長(zhǎng)度在170～193 kb，由一個(gè)中心保守區(qū)和兩個(gè)可變端組成，目前研究發(fā)現(xiàn)其開放閱讀框(Open reading frames，ORFs)有151～167 個(gè)?；谝職さ鞍譖72編碼基因B646L的部分序列分析，非洲豬瘟病毒已鑒定出24種基因型。

ASFV抵抗力強(qiáng)，在污染物或肉制品中可長(zhǎng)時(shí)間保持感染性。在低溫條件下保持穩(wěn)定，經(jīng)過反復(fù)凍融或超聲仍具有感染性，但對(duì)高溫抵抗力不強(qiáng)，在60 ℃條件下，30 min可徹底滅活病毒。在蛋白含量充足或合適條件下，ASFV可在pH4～13的環(huán)境中保持活性，例如感染豬肉腐化和腌制熟化并不能有效滅活病毒。常規(guī)消毒劑如氫氧化鈉、次氯酸鹽、醛類制劑等均可滅活A(yù)SFV。

2 流行病學(xué)

世界衛(wèi)生組織(OIE)將非洲豬瘟列為法定報(bào)告的動(dòng)物疫病。1921年肯尼亞首次報(bào)道非洲豬瘟疫情, 1957年葡萄牙發(fā)生非洲豬瘟疫情，ASFV開始在歐洲傳播，并于20世紀(jì)90年代中期被根除(撒丁島除外)。2007年ASFV再次進(jìn)入歐洲格魯吉亞，此后，向北和向西蔓延，影響高加索地區(qū)(2007年)、俄羅斯聯(lián)邦(2007年)、烏克蘭(2012年)和白俄羅斯波羅的海國(guó)家(2014)、波蘭(2014)、摩爾多瓦(2016)、捷克共和國(guó)和羅馬尼亞(2017)。中國(guó)于2018年8月份報(bào)告首例非洲豬瘟疫情，并將其列為一類動(dòng)物疫病。據(jù)報(bào)道，目前捷克共和國(guó)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了非洲豬瘟疫情的控制和根除，同樣在比利時(shí)，非洲豬瘟的感染似乎也已得到控制，根除工作即將完成。

由于缺乏有效的疫苗和控制措施，ASFV的感染與傳播對(duì)全球的養(yǎng)殖行業(yè)構(gòu)成巨大威脅，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。ASFV 潛伏期一般為5～19 d，最長(zhǎng)可達(dá)21 d。主要宿主有脊椎動(dòng)物(家豬、野豬及非洲疣豬)和部分鈍緣蜱。這些蜱種既可以作為ASFV的儲(chǔ)存宿主,又可以作為病毒傳播媒介。與經(jīng)典豬瘟對(duì)于仔豬更易感不同，所有年齡段的豬均易感染非洲豬瘟。在林棲循環(huán)、蜱豬循環(huán)、家豬循環(huán)和野豬-棲息地循環(huán)4個(gè)非洲豬瘟的流行方式中，對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)影響最大的始終是家豬循環(huán)，感染豬及其血液、組織臟器、豬肉及豬肉制品以及分泌物(唾液、鼻腔分泌物、眼淚、尿液、糞便、精液)等豬源產(chǎn)品是非洲豬瘟傳播的主要傳染源，此外，全球范圍內(nèi)多起疫情調(diào)查顯示通過感染的豬肉及其制品和內(nèi)臟產(chǎn)生的餐廚剩余物能造成ASFV 遠(yuǎn)距離的傳播。除了野豬自身的傳播，其他動(dòng)物例如鳥類、流浪犬和野生動(dòng)物的捕食以及人類的游玩等可能會(huì)接觸到野豬的活動(dòng)機(jī)械性攜帶擴(kuò)散病毒，從而造成疫情的發(fā)生和流行。

ASFV 傳播途徑分為直接傳播和間接接觸傳播兩種。感染豬和易感豬之間的口鼻接觸是 最常見、最有效的直接傳播途徑，其次還可以通過易感豬接觸感染豬排出的體液、分泌物、排泄物等進(jìn)而發(fā)生傳播。間接接觸傳播是病毒發(fā)生遠(yuǎn)距離、跳躍式傳播，最主要途徑則是易感豬接觸病毒污染的豬肉、飼料、糞便、泔水、衣服、鞋靴、車輛、墊料、各種器具等進(jìn)而發(fā)生感染和傳播。

3 臨床癥狀和病理變化

3.1 臨床癥狀

根據(jù)臨床癥狀和病程長(zhǎng)短分為最急性型、急性型、亞急性型和慢性型。最急性型表現(xiàn)為無(wú)明顯臨床癥狀突然死亡。急性型表現(xiàn)為高熱，體溫可升至42．0 ℃；精神沉郁；呼吸困難；厭食；嘔吐；腹瀉，糞便帶血；便秘；耳、四肢、腹背部皮膚有紅色至紫色出血塊；流產(chǎn)；眼、鼻有黏性或膿性分泌物；可視粘膜潮紅發(fā)紺，死亡率可達(dá)100%。亞急性型與急性型相比，臨床癥狀較輕，病死率也大幅下降。慢性型臨床上以皮膚變紅、發(fā)熱、食欲不振、中度到重度的關(guān)節(jié)腫脹、不愿站立等較為緩和的癥狀為主要特征。隱性帶毒型的豬只不表現(xiàn)出臨床癥狀,外觀無(wú)變化。

3.2 剖檢變化

最急性型病例可能無(wú)明顯剖檢變化。內(nèi)臟器官出血為急性型與亞急性型的主要剖檢特征，其中脾臟顏色呈現(xiàn)暗紅色或黑色，并出現(xiàn)明顯腫大和出血現(xiàn)象，整體變脆易碎；淋巴結(jié)出現(xiàn)腫大和出血現(xiàn)象；心臟、腎臟和肺臟等器官表面呈現(xiàn)多個(gè)出血點(diǎn)；整個(gè)胸腔、腹腔和心包等位置存在大量澄清、黃色或血色的液體。慢性型主要引起纖維素性胸膜肺炎、肺干酪樣壞死、纖維素性心包炎。

4 實(shí)驗(yàn)室診斷

目前，OIE推薦的ASFV檢測(cè)方法主要有病毒分離、熒光抗體檢測(cè)抗原(FAT)以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。

定量PCR (qPCR)和常規(guī)PCR都是快速、靈敏的檢測(cè)ASFV的方法。熒光定量PCR 方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，是非洲豬瘟病原檢測(cè)的主要手段，以其敏感、特異、快速、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)在實(shí)踐中廣泛應(yīng)用。Grau等開發(fā)了多重實(shí)時(shí)PCR (mRT-qPCR)，用于同時(shí)檢測(cè)ASFV、經(jīng)典豬瘟病毒和口蹄疫病毒。Fernández-Pinero J 等建立了UPL-PCR方法，對(duì)ASFV的早期檢測(cè)具有更高的診斷敏感性。液滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(ddPCR)方法是新一代PCR技術(shù)，在ASFV的檢測(cè)中能夠在不使用標(biāo)準(zhǔn)樣品的情況下對(duì)核酸定量，提高檢測(cè)靈敏度。

吳海濤等利用原核系統(tǒng)表達(dá)ASFV的P72 蛋白作為抗原，制備膠體金標(biāo)記的ASFV 單克隆抗體，建立了非洲豬瘟病毒的膠體金免疫層析方法。王丹等建立了實(shí)時(shí)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)和可視化LAMP檢測(cè)非洲豬瘟病毒(ASFV)的方法。另外有研究報(bào)道通過結(jié)合ASFV lamp檢測(cè)技術(shù)和HSV顏色模型轉(zhuǎn)換可以加快ASFV感染的篩選過程。

聚類規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列/CRISPR-associated (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR /Cas)具有準(zhǔn)確識(shí)別特定序列的能力，在ASFV的診斷中也得到應(yīng)用。Bai J等報(bào)道了一種基于CRISPR/Cas12a的非洲豬瘟現(xiàn)場(chǎng)快速核酸檢測(cè)方法。Lu S等報(bào)道了一種基于cas12和金納米橫向流動(dòng)相結(jié)合的便攜式紙?jiān)\斷法，能夠快速、準(zhǔn)確檢測(cè)ASFV，具有較高的特異性和敏感性。Wang X 等建立了結(jié)合CRISPR/Cas12a技術(shù)與免疫層析帶便攜檢測(cè)ASFV的方法。

最近研究發(fā)現(xiàn)了基于重組酶的擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(RPA/RAA)也可用于ASFV的檢測(cè)。此外，Wozniakowski等最近開發(fā)了一種聚合酶交聯(lián)螺旋反應(yīng)(PCLSR)用于ASFV的檢測(cè)，且不與其他豬病原體發(fā)生交叉反應(yīng)。

5 與感染宿主細(xì)胞的相互作用

ASFV感染巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞以及樹突細(xì)胞。ASFV主要通過網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞或者巨胞飲內(nèi)化進(jìn)入其自然感染細(xì)胞，進(jìn)而影響宿主的多項(xiàng)細(xì)胞生物學(xué)行為。ASFV蛋白A238L、A224L、j4R、UBCv等干擾NF-Κb、c-Jun的活性，進(jìn)而影響中宿主細(xì)胞TNF-α、iNOS和COX-2 等基因的轉(zhuǎn)錄過程 。ASFV及其蛋白DP71L、A224L等能夠影響磷酸化以及去磷酸化過程進(jìn)而參與宿主細(xì)胞蛋白合成過程。ASFV可能激發(fā)細(xì)胞早期的凋亡，對(duì)病毒感染不利，但其A179L、A224L、DP71R、EP153R等蛋白能夠抑制感染早期的細(xì)胞凋亡。ASFV的感染激發(fā)caspase-12活化為特征的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum)應(yīng)激和未折疊蛋白應(yīng)答(UPR)，影響蛋白合成、蛋白表達(dá)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等活動(dòng)，并能夠保留有利于病毒感染復(fù)制的因素，逃避抑制病毒復(fù)制的因素。

ASFV能夠抑制宿主細(xì)胞的抗原遞呈功能，逃逸后續(xù)的免疫應(yīng)答。其衣殼蛋白p72(B646L)、p54(E183L)和p30(CP204L)、膜蛋白p12(O61R)、CD2v(EP402R)等保護(hù)性抗原參與ASFV結(jié)合和內(nèi)化入侵宿主細(xì)胞、病毒膜運(yùn)輸和遷移等過程。A238L、A224L、DP71L、A179L、EP153R、I329L、CD2v等影響細(xì)胞凋亡、宿主基因表達(dá)和抑制淋巴細(xì)胞增殖等進(jìn)而參與病毒的免疫逃逸過程。

研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)ASFV的多基因家族(multiple gene family,MGF)基因片段如MGF360、MGF505/530相似基因、(MGF360 15R)、MGF506 6/7R和其免疫逃逸基因DP96R(UK)等均能通過降低宿主細(xì)胞內(nèi)干擾素(type I interferon, IFN) 的水平進(jìn)而影響宿主細(xì)胞的抗病毒感染等過程。

6 防控

當(dāng)前，非洲豬瘟在世界上多個(gè)國(guó)家和地區(qū)發(fā)生和傳播，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。目前研究顯示ASFV的基因組和蛋白的復(fù)雜性較強(qiáng)，疫苗開發(fā)難度較大，還未研發(fā)出安全有效的疫苗和治療藥物，非洲豬瘟的防控主要依賴于快速的現(xiàn)場(chǎng)識(shí)別、感染的動(dòng)物的無(wú)害化處理以及實(shí)施嚴(yán)格的生物安全措施。

傳統(tǒng)的滅活疫苗和乙亞胺(BEI)滅活的非洲豬瘟疫苗都不能產(chǎn)生保護(hù)作用。各類減毒活疫苗、亞單位疫苗、DNA載體疫苗、病毒載體疫苗都取得了不同程度的研究成果。特別是p72的原子結(jié)構(gòu)，可以指導(dǎo)抗原表位聚焦免疫原的合理設(shè)計(jì)，從而影響ASFV感染疫苗干預(yù)新策略的開發(fā)。Dunn L等發(fā)現(xiàn)利用sncRNA系統(tǒng)的ASFV感染中宿主sncRNA豐度發(fā)生了相對(duì)溫和的變化，這一發(fā)現(xiàn)可用于研究更有效的ASFV疫苗 。

除了疫苗之外，目前報(bào)道抗ASFV的藥物分為兩類:一類為直接作用于病毒的抑制劑(直接作用抗病毒藥物)，另一類為針對(duì)參與ASFV復(fù)制的細(xì)胞因子的抑制劑(宿主靶向抗病毒藥物) 。自1963年第一個(gè)抗病毒藥物多氧尿苷類藥物獲得批準(zhǔn)以來(lái)，在抗病毒藥物的發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域取得了很大的成就。目前發(fā)現(xiàn)能夠通過抑制病毒復(fù)制的藥物有：核苷類似物、干擾素IFN-gamma、IFN-alpha、利福平、氟喹諾酮類藥物等抗生素、植物源化合物: 染料木黃酮和芫花素、芹黃素、小干擾RNA、針對(duì)病毒磷酸蛋白p30基因(CP204 L)的71-78密碼子的CRISPR/Cas9系統(tǒng)等有特定靶點(diǎn)藥物以及沒食子酸月桂酯多酚類植物抗毒素、白藜蘆醇和氧化白藜蘆醇、海洋微藻提取物等無(wú)特定靶點(diǎn)的藥物。此外，ASFV蛋白酶有望成為黃酮類化合物抑制ASFV致病性的靶點(diǎn)。利用特異性小干擾RNA(specific small interfering RNAs)感染基因表達(dá)和復(fù)制，將CRISPR-Cas9介導(dǎo)的ASFV p30基因靶向有效抑制ASFV的復(fù)制，也可能是預(yù)防及控制病毒感染的新方向。

生物安全成為非洲豬瘟疫情防控的重要有效手段。一是要建立安全的種群管理制度，養(yǎng)殖場(chǎng)要堅(jiān)持自繁自養(yǎng)原則，嚴(yán)禁從疫區(qū)引種。二是要做好消毒滅源工作，對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)的內(nèi)部以及外部的環(huán)境、外來(lái)的車輛、人員進(jìn)行嚴(yán)格的消毒，并做好豬舍及周圍的防蟲滅鼠滅蚊蠅工作，可選用常規(guī)消毒劑如氫氧化鈉、次氯酸鹽、醛類制劑等消毒劑。三是非洲豬瘟病毒通過飼料途徑傳播風(fēng)險(xiǎn)較低,但不排除飼料產(chǎn)品受到病毒污染導(dǎo)致帶毒傳播可能性。在生豬的喂養(yǎng)上要全面禁止未經(jīng)處理的餐廚剩余物進(jìn)入到生豬的飼料中。