關(guān)于獸醫(yī)冠狀病毒臨床和分子方面的研究進展

常小勝

(定西市通渭縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，甘肅 定西 743300)

冠狀病毒是在不同的動物物種和人類中引起疾病的一大類病毒。動物冠狀病毒可在多種宿主中引起呼吸道，腸道和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，而人冠狀病毒通常會引起輕度至嚴重的呼吸道疾病，導(dǎo)致肺炎甚至死亡。2002年和2012年的嚴重急性呼吸綜合征病毒和中東呼吸綜合征病毒的流行是冠狀病毒成為人畜共患病潛在來源的第一個預(yù)警信號。但是，2020年新型冠狀病毒SARS-CoV-2大流行引起了全球?qū)σ吧图茵B(yǎng)動物的關(guān)注，因為它們是冠狀病毒重組和傳播的主要來源。動物中的冠狀病毒感染通常是動物感染，可能會長期影響某些物種。此外，異常的復(fù)制機制和重組事件的可能性是可能導(dǎo)致跨物種傳播并增強冠狀病毒人畜共患病潛力的兩個主要因素。因此，了解動物冠狀病毒感染對于理解其生態(tài)學和進化的不同方面至關(guān)重要。

這篇綜述旨在描述冠狀病毒的分子、形態(tài)、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄機制，以及冠狀病毒在獸類中感染的主要臨床特征。

1 冠狀病毒

1.1 冠狀病毒的分類

冠狀病毒科屬于巢病毒目，根據(jù)其特定的復(fù)制機制和基因組進行分類，它包含14個RNA病毒家族。國際病毒分類學委員會(International Committee for Taxonomy ofViruses，ICTV)最近將新冠病毒重新分類，將其分為兩個亞科，稱為冠狀病毒(Orthocoronavirinae)亞科和Leto(Letovirina)亞科。Leto亞科感染兩棲動物，僅包含屬α冠狀病毒屬，而冠狀病毒亞科根據(jù)其基因組結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分為四個病毒屬：α冠狀病毒屬、β冠狀病毒屬、γ冠狀病毒屬和δ冠狀病毒屬。這四個病毒屬包括獸醫(yī)學中最相關(guān)的病毒種類。

1.2 冠狀病毒結(jié)構(gòu)

冠狀病毒有包膜，一般為球形，直徑在120～160 nm之間，其包膜具有與冠狀病毒修剪物相對應(yīng)的凸出物S蛋白，因此在電子顯微鏡下呈典型的冠狀形態(tài)。在β冠狀病毒屬中，還存在由血凝素-酯酶(Hemagglutinin-esterase，HE)輔助蛋白形成的第二層較小的凸出層。冠狀病毒的核衣殼呈螺旋狀對稱，由N個與單鏈相關(guān)的蛋白組成，其正義RNA基因組((+)ssRNA)RNA基因組中最大的(約26-32 Kbp)。

1.3 新冠病毒的基因組和蛋白質(zhì)組成

(+)ssRNA基因組具有5'端帽子和3'端多聚腺苷尾，并且兩個末端都有非翻譯區(qū)(Untranslated regions，UTRs)，在病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中起著重要的作用。根據(jù)不同的物種，有7～14個開放閱讀框(Openreading frames，ORF)編碼不同的病毒蛋白。ORF1a，1b，S，E，M和N在不同物種之間是保守的。ORF1a和ORF1b是大的ORF，占據(jù)病毒基因組的5'近端三分之二，并參與非結(jié)構(gòu)蛋白的合成。其余三分之一的3'端病毒基因組包含ORF，它們編碼結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白。

新冠病毒家族中存在的結(jié)構(gòu)蛋白是S，E，M和N蛋白，這四種蛋白對于病毒顆粒的組裝和傳染性至關(guān)重要。冠狀病毒獨特的針狀體是S蛋白的同源三聚體，負責附著在細胞受體上負責與細胞受體的連接，S蛋白由兩個功能域組成：S1和S2；蛋白E參與裝配、釋放和發(fā)病機制；蛋白M是病毒粒子中最豐富的蛋白質(zhì)，通過與核衣殼結(jié)合促進病毒粒子的空間拓撲結(jié)構(gòu)；最后，蛋白質(zhì)N有兩個域，它們與RNA基因組相互作用，并作為干擾素拮抗劑發(fā)揮重要作用，允許病毒復(fù)制。

1.4 冠狀病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制機制:亞基因組RNA合成

冠狀病毒的蛋白質(zhì)合成涉及一種所有冠狀病毒共有的特定轉(zhuǎn)錄機制，即涉及巢狀亞基因組mRNA的轉(zhuǎn)錄。復(fù)制酶-轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物必須由ORF1a和ORF1b中編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白合成。該復(fù)合體負責病毒亞基因組mRNA的轉(zhuǎn)錄和基因組復(fù)制。一旦基因組在細胞質(zhì)中釋放，細胞核糖體就會啟動ORF1a和ORF1b的翻譯。冠狀病毒的亞基因組mRNA的嵌套集是通過不尋常的不連續(xù)轉(zhuǎn)錄過程生成的，這種獨特的不連續(xù)轉(zhuǎn)錄過程也是所有冠狀病毒重組的可能，從而導(dǎo)致了新的病毒株。此外，所有合成的結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白以及病毒基因組均在病毒工廠組裝，病毒包膜取自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體膜，通過胞吐作用最終釋放出成熟的病毒顆粒。

2 獸醫(yī)學中的相關(guān)冠狀病毒

2.1 犬冠狀病毒

犬冠狀病毒包括α和β冠狀病毒屬。犬腸冠狀病毒(Canine enteric coronavirus，CCoV)屬于α冠狀病毒屬，常引起幼犬的胃腸道臨床體征，而犬呼吸道冠狀病毒(Canine respiratory coronavirus，CRCoV)屬于β冠狀病毒屬，與呼吸系統(tǒng)疾病有關(guān)，尤其是在狗舍中。

CCoV感染的特點是發(fā)病率高但死亡率低。CCoV感染的臨床體征包括輕度至中度胃腸炎、食欲不振、嘔吐、腹瀉和脫水等。某些與出血性腹瀉有關(guān)的強毒CCoV毒株能夠在幾天內(nèi)殺死受感染的幼犬。CCoV-IIa亞型的高毒力菌株稱為泛嗜性CCoV，它在內(nèi)部器官(主要是淋巴組織)中擴散，導(dǎo)致明顯的淋巴細胞減少，也被認為是造成感染最嚴重過程的原因。用于檢測糞便樣品中CCoV的分子分析是基于反轉(zhuǎn)錄，然后是針對M基因的qPCR(RT-qPCR)或巢式PCR(nPCR)分析。

CRCoV于2003年在英國被發(fā)現(xiàn)，幾項流行病學和血清學研究表明，CRCoV是全世界犬舍中犬傳染性呼吸道疾病(canine infectiousrespiratory disease，CIRD)的病原體之一。對CRCoV感染的實驗研究表明，有輕度呼吸道疾病的跡象，包括鼻涕、打噴嚏和咳嗽。此外，上皮呼吸道和巨噬細胞的感染會影響先天免疫系統(tǒng)。用于檢測CRCoV的診斷檢測方法是針對S基因的RT-PCR和針對N基因的qPCR的血清學和分子檢測。

2.2 貓冠狀病毒

貓冠狀病毒(Feline coronavirus，F(xiàn)CoV)屬于α冠狀病毒屬，常引起家貓和貓科其他成員的腸道疾病。FCoV感染的貓中約有5%～10%患上貓腹膜炎，該疾病的特征是在肺、肝、淋巴組織和其他體腔中出現(xiàn)嚴重的全身性炎癥、漿膜炎和肉芽腫性病變。FCoV擴散的自然機制是糞-口途徑，被感染的動物可能會傳播FCoV數(shù)周甚至數(shù)月，而病毒的大量釋放與貓腹膜炎的發(fā)展有關(guān)。此外，母體免疫力可能會改變自然感染的小貓的病程。FCoV通常通過間接法測定，例如免疫熒光測定(Immunofluorescence assay，IFA)，分子檢測如RT-qPCR或環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增(loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)PCR也用于診斷和鑒定。

2.3 鼠冠狀病毒

鼠冠狀病毒有兩種，小鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus，MHV)和大鼠冠狀病毒(Rat coronavirus，RCV)，它們都屬于β冠狀病毒屬。

MHV于1947年在美國首次分離，基于其嗜組織性，可以將菌株分為肝炎菌株和腸溶性菌株。肝炎菌株可以擴散到肝臟和脾臟，引起肝炎，也能夠通過神經(jīng)嗅覺途徑到達大腦并產(chǎn)生暴發(fā)性腦病。而腸溶菌菌株在腸組織中復(fù)制，并擴散到肝臟，腹部淋巴結(jié)，偶爾擴散到中樞神經(jīng)系統(tǒng)。MHV感染的嚴重性受病毒基因型，毒株和宿主免疫反應(yīng)的影響。此外，MHV具有高度傳染性，并通過呼吸道和糞便傳播。

RCV于1970年在實驗室大鼠群體的呼吸道疾病暴發(fā)中首次分離出來，分為Parker大鼠冠狀病毒(Parker rat coronavirus，RCV-P)和唾液酸腺炎病毒(Sialodacryoadenitis virus，SDAV)。RCV-P和SDAV可以通過直接接觸被感染的大鼠，氣溶膠或毒氣來傳播，具有高度傳染性。RCV-P主要在呼吸道和肺中復(fù)制，導(dǎo)致壞死性病變，并且像SDAV一樣會導(dǎo)致淚腺和唾液腺病變。RCV可以通過免疫組化和血清學檢測(例如IFA和ELISA)進行檢測。

2.4 牛冠狀病毒

牛冠狀病毒(Bovine coronavirus，BCoV)屬于β冠狀病毒屬，于1973年首次報道，與美國小牛腹瀉暴發(fā)有關(guān)。BCoV與呼吸道和腸道疾病有關(guān)，BCoV引起的呼吸道疾病伴有發(fā)燒、咳嗽和鼻炎。而腸道表現(xiàn)是新生牛犢的腹瀉和成年牛的冬季痢疾(Winterdysentery，WD)，其特征是奶牛急性腹瀉、抑郁、發(fā)燒和產(chǎn)奶量減少。BCoV可以通過糞便和呼吸道傳播途徑，受BCoV污染的蚊子也是間接傳播給牲畜的途徑。在犢牛中，初乳對孕婦的被動免疫可調(diào)節(jié)BCoV感染的發(fā)生。BCoV可以通過血清學檢測(如ELISA和免疫組織化學檢測)來檢測。

2.5 馬冠狀病

馬冠狀病毒(Equine coronavirus，ECoV)屬于β冠狀病毒屬，于1999年在美國首次從腹瀉的小馬駒糞便中分離出來。ECoV的傳播途徑是糞-口傳播，ECoV感染的常見臨床體征是發(fā)燒、抑郁和厭食，在某些情況下，成年馬會出現(xiàn)心絞痛和腹瀉。在感染嚴重的情況下，會出現(xiàn)高氨血癥相關(guān)性腦病。通過糞便和鼻拭子樣本的qPCR可以診斷出ECoV，而很少從呼吸道樣本中檢測到。ECoV也可以通過RT-LAMP PCR診斷。

2.6 豬冠狀病毒

豬可以被六種冠狀病毒感染。其中四個屬于α冠狀病毒屬(可傳播的胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、豬呼吸道冠狀病毒(Porcine respiratory coronavirus，PRCV)、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrheavirus，PEDV)和豬急性腹瀉綜合征-冠狀病毒(Swine acute diarrhea syndrome-coronavirus，SADSCoV))，而其余的則歸類于β冠狀病毒屬(豬血凝性腦脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus，PHEV))和δ冠狀病毒屬。

TGEV是1946年在美國發(fā)現(xiàn)的第一個豬冠狀病毒，其臨床體征包括急性腹瀉、嘔吐、厭食和體重減輕。TGEV主要影響來自幼稚種群的2周齡新生仔豬。然而，感染是自限性的。在流行階段之后，可能因為不全面管理在農(nóng)場中發(fā)現(xiàn)地方病。TGEV可以通過糞-口途徑傳播，也可以通過母乳傳播，甚至可以通過牛奶進行垂直傳播。

PRCV通過氣溶膠直接接觸傳播，并影響呼吸道、氣管、扁桃體和肺。它通常表現(xiàn)為無癥狀感染或輕度呼吸道疾病，常見的臨床體征是發(fā)燒、厭食、呼吸困難。PRCV和TGEV在S、M和N結(jié)構(gòu)蛋白中共享生物和抗原表位。

PEDV是通過糞-口途徑傳播的，與運輸飼料和技術(shù)人員的糞便和嘔吐物污染有關(guān)。感染PEDV的血清陰性母豬的新生仔豬死亡率達到100%，與引起大量脫水的嚴重腹瀉和嘔吐有關(guān)。

SADS-CoV是最新發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒，于2016年在中國出現(xiàn)，可以通過糞-口途徑傳播，具有所有腸道豬冠狀病毒的典型臨床體征。感染后死亡率在五日齡以下的仔豬中為90%至100%，八日齡以上的仔豬中僅為5%。SADS-CoV可能是人畜共患病，通過豬中傳播對人類健康構(gòu)成威脅。

與PHEV相關(guān)的臨床體征是非特異性的，其特征是體溫升高、食欲不振、和睡等。此外，受感染的豬表現(xiàn)出癲癇發(fā)作、虛弱和昏厥等勢，還可能表現(xiàn)出眼淚和眼球震顫。

2.7 禽冠狀病毒

禽冠狀病毒多為傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)，屬于γ冠狀病毒屬。IBV最初在呼吸組織中復(fù)制，產(chǎn)生急性上呼吸道疾病，呼吸道病變通常會增加對繼發(fā)性病毒和細菌感染的敏感性，這可能導(dǎo)致肺炎、氣囊炎和腹膜炎。IBV還可以感染輸卵管中的上皮細胞、腎臟和胃腸道，或具有多器官嗜性，IBV是通過氣溶膠或與毒氣直接接觸傳播的，該病的潛伏期很短，在24 h內(nèi)出現(xiàn)臨床體征。IBV發(fā)病率通常為100%，死亡率取決于宿主。ELISA結(jié)合Western Blot檢測N蛋白的血清學檢測已用于IBV檢測。

3 跨物種傳播和新傳染病的出現(xiàn)

冠狀病毒具有廣泛的宿主，從各種各樣的動物到人類，在哺乳動物中主要有α和β冠狀病毒，鳥類和一些海洋哺乳動物中有γ冠狀病毒，野生鳥類和豬中有δ冠狀病毒。這些病毒的多樣性和混雜的宿主范圍是擴大其范圍的組成部分，并且可以作為宿主傳播給人類。迄今為止，已在人類中鑒定出七種冠狀病毒，且具有人畜共患起源，主要與蝙蝠有關(guān)。

冠狀病毒也可以通過中間物種傳播。例如，人類甲型冠狀病毒HCoV-229E的進化起源與河馬類蝙蝠冠狀病毒有關(guān)，但駱駝科動物在可能充當了中間宿主。人β冠狀病毒SARS-CoV和MERS-CoV起源于蝙蝠，通過果子貍和單峰駱駝傳播。關(guān)于SARS-CoV-2，基因組測序表明其與穿山甲相關(guān)的冠狀病毒有91.02%的同源性。因此，保護冠狀病毒的基因和遺傳多樣性以及物種之間的平衡至關(guān)重要。

4 總結(jié)與展望

不同宿主攜帶的冠狀病毒數(shù)量異常，病毒受體的可塑性高，特殊的復(fù)制機制以及動物生活環(huán)境的不斷改變，都是有利于種間傳播的成分。2020年SARS-CoV-2大流行中證明了動物冠狀病毒跨物種傳播的潛在威脅。預(yù)防人畜共患病的感染需要保持天然水庫與人口之間的屏障。獸醫(yī)必須考慮到冠狀病毒感染、家畜甚至實驗動物的診斷方法中的臨床體征和分子特征，以預(yù)防動物疾病并因此促進公共衛(wèi)生。