新型鵝細(xì)小病毒病研究進(jìn)展

包濤濤，汪忠榮，吳通奎，楊先富，彭彩麗，楊政益

(黔東南州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 凱里 556000)

鵝細(xì)小病毒(Gooseparvovirus，GPV)屬于細(xì)小病毒科依賴病毒屬成員，為水禽鵝瘟(又稱小鵝瘟、鵝腸炎、鵝肝炎及鵝傳染性心肌炎)病原[1]，主要侵害3～20日齡雛鵝及番鴨，通常不感染其他品種鴨，致病率和致死率較高[2]。GPV最早由中國著名微生物學(xué)家方定一[3]于1956年在江蘇揚州首先發(fā)現(xiàn)，經(jīng)多年研究，我國成功研制出小鵝瘟種鵝弱毒疫苗、雛鵝弱毒疫苗及高免血清，使該病得到了較好的控制[4]。但自2015年以來，我國華東地區(qū)陸續(xù)暴發(fā)櫻桃谷鴨及半番鴨以生長遲緩，短頸，短喙，舌外露，胸骨及翅、腿易發(fā)生骨折等最終定義臨床癥狀為“短喙-侏儒綜合征”(Short beak and dwarfism syndrome，SBDS)的疾病[5-9]，陳浩[5]和李傳峰[9]鑒定出引起該病的主要病原為新型鵝細(xì)小病毒(Novelgooseparvovirus，NGPV)。與典型GPV相比，NGPV所引起的致死率較低，通常低于3%，但僵鴨淘汰率則高達(dá)80%，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟損失[10]。本文就新型鵝細(xì)小病毒病的病原特征、流行病學(xué)、臨床癥狀、病理剖檢及診斷方法做一概述，以期為該病的防治提供參考依據(jù)。

1 病原學(xué)

1.1 病原介紹

水禽細(xì)小病毒屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒亞科依賴病毒屬，單鏈DNA結(jié)構(gòu)，主要包含鵝細(xì)小病毒(Gooseparvovirus，GPV)及番鴨細(xì)小病毒(MuscovyDuckParvovirus，MDPV)，前者主要感染雛鵝和雛番鴨，而后者僅能感染雛番鴨[11]。此外，兩者在病毒的大小、形態(tài)及基因組的結(jié)構(gòu)十分相似，發(fā)病癥狀也極其相似。電鏡觀察結(jié)果顯示GPV與MDPV的病毒粒子形態(tài)包含空心及實心兩種，無囊膜結(jié)構(gòu)，正二十面體對稱，直徑20～24nm，由32個管狀排列殼粒共同組成衣殼[10]。

1.2 基因組

GPV、NGPV及MDPV三者基因組序列基本相似，大小約5.1kb，5′端折疊形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，發(fā)夾形似“箭”狀，在其兩端存在著相同末端重復(fù)序列，長度約440bp，該結(jié)構(gòu)與ITR對病毒復(fù)制起著至關(guān)重要的作用[10]。發(fā)夾分別由約180nt及45nt的“莖”和“泡”組成，“箭”形狀上還包含限制性內(nèi)切酶Sph I的酶切位點，為ITR對稱中心，ITR還包含數(shù)個4～10bp的重復(fù)序列。此外，它們的基因組主要包含兩個開放式閱讀框(Open reading frame，ORF)，兩側(cè)ORF之間間隔18bp，左側(cè)ORF主要參與非結(jié)構(gòu)蛋白NS1及NS2編碼(NS1與NS2共用一個終止子且NS1﹥NS2)，右側(cè)ORF主要參與結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2及VP3編碼(VP1、VP2與VP3共用一個終止子且VP1﹥VP2﹥VP3)[12]，編碼GPV的NS及VP基因全長分別為1884bp和2199bp[13]。非結(jié)構(gòu)蛋白主要參與病毒的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄，結(jié)構(gòu)蛋白則是病毒的衣殼組成成分。研究者對2015年以來分離出的7株典型NGPV進(jìn)行全基因組核苷酸同源性比對，其同源性介于99.2%～99.7%；與2012年分離的GPV經(jīng)典株LH相比，其同源性介于93.4%～95.2%；而與2015年分離的MDPV毒株P(guān)1進(jìn)行比對，其同源性介于81.3%～83.4%[10]。為研究GPV與NGPV兩者之間的關(guān)系，LI等[14]研究發(fā)現(xiàn)，兩者之間核苷酸同源性介于92.2%～97.1%，且NGPV為GPV的一個分支，與經(jīng)典GPV毒株的基因序列相比，NGPV在反向末端重復(fù)序列處有5個核苷酸突變，也有部分NGPV毒株存在2處堿基缺失，其復(fù)制及衣殼蛋白分別發(fā)生在8及12個同步氨基酸的變化，這些很有可能與病毒的基因調(diào)控、體液免疫及宿主的轉(zhuǎn)移有著密切重要的關(guān)系。

2 流行病學(xué)

通常GPV僅感染雛鵝及雛番鴨，而對其他鴨并不易感，隨著動物日齡的增加，動物的易感性逐漸減弱。GPV傳播方式較多，直接接觸、間接接觸及垂直傳播均被認(rèn)為是其常見的傳播方式，病毒主要侵害4～20日齡雛鵝，7日齡以內(nèi)的雛鵝病死率可達(dá)100%，10日齡以上的病死率一般低于60%。2015年，我國華東地區(qū)的櫻桃谷鴨出現(xiàn)一種以SBDS為主要癥狀的疾病，患病鴨體重明顯低于健康鴨，從而導(dǎo)致出欄合格率下降，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。陳浩[5]最先公開報道從患病櫻桃谷肉鴨體內(nèi)分離出病原，并通過試驗證實櫻桃谷肉鴨所感染的是一種新型GPV即NGPV，緊接著國內(nèi)又有不少研究報道，鵝細(xì)小病毒感染范圍已經(jīng)擴大，已不再是單純感染雛鵝及番鴨，而且典型臨床癥狀也發(fā)生了變化。李傳峰[9]從華東地區(qū)以SBDS為主要臨床癥狀的患病鴨組織中檢測出了與GPV類似的特異性核酸，經(jīng)過系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建及免疫組化檢測分析，證實檢測病原與GPV存在著病毒特異性抗原；李亞非[15]采用PCR技術(shù)從有SBDS癥狀鴨體內(nèi)擴增出GPV VP3基因，發(fā)現(xiàn)其與現(xiàn)有報道櫻桃谷鴨感染的NGPV核苷酸同源性最高。隨后，國內(nèi)不同地區(qū)關(guān)于病鴨感染NGPV的報道也逐漸增多，該病似乎在各地鴨群中正逐步形成流行趨勢。

3 臨床癥狀及病理變化

臨床癥狀上[10]，由NGPV感染鴨所引起的典型臨床癥狀一般表現(xiàn)為短喙、鴨舌腫大、舌外露、脛骨變短、發(fā)育遲緩、腹瀉及翅、腿易折等。GPV與MDPV感染動物所引起的典型癥狀一般可分為最急性、急性及亞急性3種類型。最急性型：多發(fā)于6日齡以內(nèi)的番鴨，病程短，患鴨不出現(xiàn)任何前期癥狀便可急性死亡；急性型7～14日齡番鴨較為易發(fā)，病程一般2～4d，前期表現(xiàn)為精神萎靡、腹瀉、呼吸困難、腿腳無力及厭食等；亞急性型多發(fā)于14日齡以上的番鴨，病程5～7d，其臨床癥狀與急性型臨床癥狀較為類似。

病理變化上，感染NGPV的病鴨鴨舌出現(xiàn)間質(zhì)性炎癥，舌部結(jié)締組織水腫、疏松，胸腺略帶出血，肝臟及脾臟輕微萎縮，肺臟充血、出血，腎小管出血、水腫，胰腺針尖大小樣出血及炎性細(xì)胞浸潤。而感染GPV與MDPV的動物所表現(xiàn)的典型病理變化主要為滲出性腸炎，胰臟蒼白壞死，腸黏膜充血、出血，膽囊腫大，心肌束間有紅細(xì)胞滲出，肝細(xì)胞局部有顆粒及脂肪變性，神經(jīng)細(xì)胞輕度變性及膠質(zhì)細(xì)胞輕度增生等。

4 診斷方法

GPV常用的檢測方法主要包含病毒中和試驗、瓊脂擴散試驗、瓊脂擴散抑制試驗、對流免疫電泳、免疫酶斑點法、酶聯(lián)免疫吸附試驗、間接免疫熒光實驗、膠體金免疫層析技術(shù)、普通PCR及實時熒光定量PCR技術(shù)、核酸探針技術(shù)及環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)等[16]。臨床診斷上可結(jié)合實際情況有針對性地選擇對應(yīng)的診斷方法開展實驗室檢測。為克服瓊脂擴散試驗技術(shù)敏感性差的弊端，秦愛建等[17]使用GPV酶標(biāo)單克隆抗體建立了一種可用于GPV檢測的免疫酶瓊脂擴散試驗技術(shù)。邱平等[18]使用FITC標(biāo)記的小鵝瘟單抗，建立了一種在2 h內(nèi)便可檢測出GPV的直接免疫熒光試驗技術(shù)。郭卉等[19]也利用試驗制備的單克隆抗體，建立了一種可用于GPV檢測的間接免疫熒光檢測技術(shù)。

目前，關(guān)于GPV VP基因的報道文獻(xiàn)很多，VP3作為GPV VP基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白序列保守穩(wěn)定，所以，研究者常以VP3作為GPV的分子生物學(xué)診斷依據(jù)。國內(nèi)早已有學(xué)者根據(jù)GPV及MDPV VP3基因設(shè)計一對GPV特異引物，建立了一種針對2種病毒PCR快速鑒別診斷方法，可以特異性地區(qū)分GPV與MDPV[19]。此外，張穎等[20]及呂亞楠等[21]也針對GPV的VP3基因序列各自設(shè)計了一對引物，成功建立了一種用于快速檢測GPV的分子生物學(xué)方法，可應(yīng)用于開展臨床實驗的快速檢測。

高莎莎等[22]根據(jù)NGPV的保守序列設(shè)計不同的引物，分別建立半套式PCR、套式PCR和熒光定量PCR檢測方法，可用于NGPV的診斷檢測。YANG等[23]建立了一種可快速用于NGPV檢測的LAMP方法，該方法最低檢出量為100copies，具有較高靈敏度，是普通PCR的100倍。鄭肖強等[24]制備NGPV的一種地高辛標(biāo)記探針，該探針與鴨的其他病毒反應(yīng)結(jié)果均為陰性，最低檢出量為25pg。LI等[8]建立一種可檢測經(jīng)典GPV及NGPV的雙重半巢式PCR方法，經(jīng)臨床檢測，結(jié)果顯示在所有具有短喙侏儒綜合癥狀的鴨病料中可以檢出NGPV陽性，而其余的病料中則并未檢測出經(jīng)典GPV，這與GPV在臨床上只感染鵝及番鴨的結(jié)果也是相符的。

5 小結(jié)

鴨“短喙-侏儒綜合征”是一種近年來在養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)生的重要新型病毒性疾病，患病鴨體重明顯低于健康鴨，導(dǎo)致養(yǎng)鴨場出欄合格率顯著下降，對養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。我國動物疫病防控使命極其艱巨，目前，我國已研制出可控制GPV所致疾病的弱毒疫苗及高免血清等生物制品，同時，也有報道稱目前典型GPV疫苗在一定程度上可以預(yù)防NGPV的發(fā)生，但根據(jù)最新研究報道發(fā)現(xiàn)，該病毒仍在變異中，傳統(tǒng)小鵝瘟疫苗和抗體很有可能面臨失效的風(fēng)險。故針對現(xiàn)發(fā)且廣泛流行的NGPV疾病，一方面需要加快疫苗及快速診斷試劑的研發(fā)，另一方面要加強養(yǎng)殖場飼養(yǎng)管理，做好環(huán)境衛(wèi)生消毒及生物安全等疫病防控工作，多方面協(xié)同運作共同防控新發(fā)疾病。