聲動(dòng)力聯(lián)合熱療抗腫瘤機(jī)制及其在腫瘤中的應(yīng)用

韓佳軒，趙云

0 引言

聲動(dòng)力療法（sonodynamic therapy,SDT）是在光動(dòng)力療法（photodynamic therapy,PDT）基礎(chǔ)上發(fā)展而來，由Yumita等[1]于1989年提出。SDT具有很強(qiáng)的生物組織穿透能力，能將聲能聚集到更深層的組織中，并激活某些聲敏劑和光敏劑（photosensitizers,PSs），從而起到抗腫瘤的作用。SDT的抗腫瘤作用機(jī)制很多，主要包括超聲空化、活性氧（reactive oxygen species,ROS）引起細(xì)胞損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬等[2]。熱療（hyperthermia,HT）是繼手術(shù)、放療、化療等方法外的又一腫瘤治療手段，其基本原理是利用各種物理能量在人體組織中產(chǎn)生熱效應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞局部溫度升高至有效治療溫度并維持一定時(shí)間，利用正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的溫度耐受性差異，達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞同時(shí)避免破壞正常組織的目的。已有研究證明SDT和HT聯(lián)合應(yīng)用抗癌效果顯著[3]。而SDT和HT各自的抗癌作用和機(jī)制并未被系統(tǒng)性闡述。因此，有必要對(duì)SDT和HT抗腫瘤作用及其機(jī)制進(jìn)行歸納研究，為抗腫瘤治療提供新的思路。同時(shí)，近年在探索新型納米材料的過程中，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)了一些納米復(fù)合材料可以在體內(nèi)同時(shí)進(jìn)行SDT和HT，這使腫瘤治療中SDT和HT的聯(lián)合應(yīng)用成為可能。本文就SDT和HT的抗癌機(jī)制以及SDT聯(lián)合HT在抗腫瘤方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 聲動(dòng)力療法

“聲動(dòng)力治療”一詞通常用于非熱相關(guān)的超聲治療應(yīng)用，包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、聯(lián)合化療、超聲基因治療等。最初由Yumita和Umemura發(fā)現(xiàn)超聲波激活光敏材料可用于癌癥治療[4]。SDT是利用聲敏劑和低強(qiáng)度超聲（US）結(jié)合治療惡性腫瘤的一種新型治療方法，具有準(zhǔn)確性高、組織穿透深度深、患者依從性好、不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)。超聲波可以穿透深部組織并聚焦于腫瘤區(qū)域，從而激活聲敏劑，為靶向非侵入性根治實(shí)體腫瘤提供了可能。SDT的治療機(jī)制包括空化效應(yīng)、ROS的產(chǎn)生和熱療破壞[5]。

1.1 空化效應(yīng)

聲敏劑有助于產(chǎn)生空化效應(yīng)。空化效應(yīng)是一種物理現(xiàn)象，是指液體的微氣核空化泡在一定的超聲輻照作用下發(fā)生沖擊、膨脹、收縮和內(nèi)爆的動(dòng)態(tài)過程[6]?？栈?yīng)的機(jī)制非常復(fù)雜，它們與氣體振蕩密切相關(guān)。在US的輻照下，液體中的氣體通過壓縮和減壓循環(huán)振蕩，產(chǎn)生微束和輻射力。振蕩通過干擾相鄰的細(xì)胞表面和細(xì)胞膜，增加了藥物的穿透和擴(kuò)散。穩(wěn)定空化導(dǎo)致氣泡振蕩，加速周圍液體的流動(dòng)，導(dǎo)致周圍介質(zhì)的混合，慣性空化導(dǎo)致氣泡擴(kuò)大直到接近共振大小，并在崩潰前膨脹到最大尺寸[7]。當(dāng)氣泡因暴露在超聲而迅速坍塌時(shí)，慣性空化導(dǎo)致能量被釋放，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞因高溫和高壓而壞死。空化微氣泡的崩塌會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的沖擊波，導(dǎo)致細(xì)胞的機(jī)械損傷和破壞。

1.2 活性氧的產(chǎn)生

一般認(rèn)為SDT的主要機(jī)制是通過空化或空化激活的聲敏劑來產(chǎn)生ROS。ROS是超聲空化氣泡塌陷的重要產(chǎn)物并且可以導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。除了空化效應(yīng)，熱解效應(yīng)和聲致發(fā)光等也會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，產(chǎn)生的ROS能有效破壞細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，損傷DNA，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化，進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)聲敏劑和超聲波同時(shí)處理癌細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞表面的微絨毛結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞膜上出現(xiàn)空泡，細(xì)胞萎縮，細(xì)胞骨架改變[8]。聲動(dòng)力治療后，腫瘤細(xì)胞凋亡/壞死率明顯升高，主要通過半胱天冬酶（caspase）依賴性凋亡通路起作用[9]。同時(shí)，進(jìn)行SDT處理后細(xì)胞內(nèi)線粒體功能喪失并出現(xiàn)了明顯的脂質(zhì)過氧化和抗氧化酶下調(diào)的特征[10]。

1.3 熱療破壞

US介導(dǎo)的另一種治療機(jī)制是組織熱效應(yīng)，即通過提高組織溫度破壞腫瘤組織。US機(jī)械能的吸收和轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)了超聲波在組織傳播過程中產(chǎn)生熱能，導(dǎo)致細(xì)胞壞死。SDT一般使用US作為激發(fā)源，通過空化、聲致發(fā)光、熱解等方式產(chǎn)生ROS，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。同時(shí)，SDT的機(jī)械損傷和熱損傷能進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞壞死[11]。

2 熱療法

熱療是對(duì)病變部位進(jìn)行加熱處理以獲得治療效果的療法。大量基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用證明，當(dāng)腫瘤組織被持續(xù)加熱一定時(shí)間后，腫瘤細(xì)胞生長受阻、解體以致死亡。腫瘤熱療法的形成基于兩個(gè)腫瘤組織特征：一是腫瘤組織內(nèi)的血管少，血流量小，一般僅為正常組織的2%～15%，因此其散熱性極差，通過適當(dāng)方法進(jìn)行局部加熱，很容易使腫瘤組織的溫度比周圍正常組織高5%～15%；二是腫瘤組織的耐溫性明顯低于正常組織，腫瘤組織在42℃的溫度下就會(huì)發(fā)生不可逆損傷，而正常組織卻可耐溫到45℃[12]。

目前在熱療中，多采用局部加熱的方案，熱源通常來自微波、射頻電磁波及超聲波等。HT能夠觸發(fā)促進(jìn)細(xì)胞存活和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等多種信號(hào)通路。因此，了解HT誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制具有重要意義。HT通過誘導(dǎo)caspases依賴性細(xì)胞凋亡途徑從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞的死亡，而caspases依賴性的細(xì)胞凋亡主要通過下列兩條途徑引發(fā)。

2.1 內(nèi)源-線粒體起始途徑

caspase-2在熱應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要作用。最近報(bào)道表明，在進(jìn)行HT處理后，caspase-2與其適配蛋白R(shí)AIDD立即形成復(fù)合物，進(jìn)而激活caspase-2并剪切Bid，隨后tBid改變線粒體外膜通透性、刺激細(xì)胞色素C（cyt,C）的釋放以及Apaf-1-caspase-9凋亡復(fù)合體的形成[13-14]，進(jìn)一步導(dǎo)致caspase-9酶原發(fā)生自剪切而活化，激活下游的caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。

也有研究表明，熱刺激本身會(huì)誘發(fā)Bcl-2蛋白家族成員Bax/Bak發(fā)生構(gòu)象變化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]，在HT處理后，BH3亞家族成員Bim會(huì)激活Bax/Bak，參與caspase-2-Bid途徑發(fā)揮相同的功能[16]。

2.2 外源-死亡受體起始途徑

除了內(nèi)源途徑外，HT還通過激活細(xì)胞表面死亡受體來參與細(xì)胞凋亡的外源途徑。死亡受體可以傳遞由特異性配體，如Fas配體、腫瘤壞死因子誘導(dǎo)凋亡配體（TRAIL）和腫瘤壞死因子（TNF-α）誘發(fā)的凋亡信號(hào)。

死亡受體如Fas在其配體FasL的刺激下發(fā)生構(gòu)象變化，暴露Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域，通過細(xì)胞凋亡接頭分子（Fas-associated death domain protein,FADD）招募caspase-8酶原到細(xì)胞膜上，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（death-inducing signaling complex,DISC）。caspase-8酶原在復(fù)合物中活化后進(jìn)一步活化caspase-3酶原，產(chǎn)生有活性的caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而活化的caspases-8也可以切割促凋亡Bcl-2家族成員Bid，激活內(nèi)源凋亡途徑[17]。而死亡配體TRAIL與其死亡受體TRAIL-R1（DR4）和TRAIL-K2（DR5）結(jié)合，TNF-α與其受體TNFR1和TNFR2結(jié)合后，也能引發(fā)類似的凋亡信號(hào)傳遞過程[18]。

已經(jīng)有研究人員發(fā)現(xiàn)，44℃ HT作用U937細(xì)胞（人組織淋巴瘤細(xì)胞）20 min可提高Fas的表達(dá)，同時(shí)激活caspase-8和caspase-3[19]；42℃輕度HT作用Jurkat細(xì)胞30 min可以激活caspase-8[20]，表明熱應(yīng)激確實(shí)影響了Fas受體下游的信號(hào)通路。

此外，也有報(bào)告稱HT通過在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)而觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而引起細(xì)胞死亡[21]。

3 聲動(dòng)力療法聯(lián)合熱療法的新進(jìn)展

近年來，聯(lián)合治療已成為有效殺滅腫瘤細(xì)胞的重要策略，可顯著提高治療效果，降低不良反應(yīng)。SDT在腫瘤治療中顯示出了巨大的潛力，具有安全性高、穿刺深度深、成本低等優(yōu)點(diǎn)，是一種較好的非侵入性治療各種深部腫瘤的方法。而且可以精準(zhǔn)聚焦腫瘤區(qū)域，靶向激活聲敏劑，選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，最大限度地減少對(duì)鄰近正常臟器和組織的損害，使其在治療深部惡性腫瘤方面具有良好的治療效果。

HT也是一種有著廣泛前景的腫瘤治療方法，單獨(dú)使用時(shí)抗腫瘤作用較弱，但聯(lián)合使用可以提高聲動(dòng)力療法治療腫瘤的療效[22]，已經(jīng)有研究表明HT在SDT誘導(dǎo)線粒體功能障礙的凋亡途徑中起促進(jìn)作用[21]，從而增強(qiáng)腫瘤抑制作用。熱應(yīng)激可引起細(xì)胞內(nèi)ROS的爆炸，并可直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

當(dāng)SDT聯(lián)合HT時(shí)，在特定溫度和時(shí)間的作用下，HT在體內(nèi)外均能增強(qiáng)促凋亡蛋白的表達(dá)，激活caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制抗凋亡蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)SDT誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[23]。以上研究結(jié)果為SDT-HT聯(lián)合療法提供了重要的理論依據(jù)，并進(jìn)一步證明SDT-HT聯(lián)合療法具有潛在的臨床應(yīng)用前景。下面將介紹SDT-HT聯(lián)合療法研究領(lǐng)域的最新進(jìn)展。

3.1 聲動(dòng)力結(jié)合聚焦超聲誘導(dǎo)熱療法

SDT和超聲誘導(dǎo)熱療（SHT）相結(jié)合可以為治療腫瘤提供一種有效的方法，這對(duì)于深部腫瘤組織的非侵入性治療尤其有利。Chen等開發(fā)了一種新型的納米載體——介孔二氧化硅（MSN）[24]，它附著在還原的氧化石墨烯納米片（nrGO，作為SHT增強(qiáng)劑）上，表面覆蓋著玫瑰紅（RB，一種聲敏劑）聚乙二醇偶聯(lián)的氧化鐵納米顆粒（離子），形成了nrGO@MSN-ion-PEG-RB，它具有SDT/SHT結(jié)合效應(yīng)和磁導(dǎo)航功能，可以增強(qiáng)腫瘤組織中目標(biāo)部位的局部積聚，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤組織的精確治療效果。nrGO@MSN-ion-PEG-RB可降低空化閾值，增強(qiáng)聲動(dòng)力效應(yīng)，提高聚焦超聲（focused ultrasound,FUS）輻照下超聲誘導(dǎo)的熱效應(yīng)，相比對(duì)照組，SDT聯(lián)合SHT經(jīng)FUS照射可有效殺滅遠(yuǎn)離皮膚的深部腫瘤細(xì)胞。隨著對(duì)癌癥治療方法的不斷探索，研究人員發(fā)現(xiàn)，適度的熱效應(yīng)可以通過提高光敏反應(yīng)率和緩解腫瘤缺氧來提高PDT的療效[25]。由此可推測(cè)，融合誘導(dǎo)的中度熱效應(yīng)與SDT同時(shí)進(jìn)行，可實(shí)現(xiàn)腫瘤治療的協(xié)同強(qiáng)化。基于這一假設(shè)，Wan等制備了含有Mn2+、Ce6和人血清白蛋白（HSA）的納米組件，以評(píng)估FUS誘導(dǎo)的中溫（42℃）對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增強(qiáng)的SDT效應(yīng)[26]。體外細(xì)胞和體內(nèi)治療結(jié)果都證明了這些納米組件對(duì)FUS照射的協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)。研究表明，在納米組件+FUS（42℃）治療組中，既完全抑制了皮下腫瘤，又大大提高了對(duì)原位小鼠模型的抗腫瘤效果。這種二合一的治療策略為FUS誘導(dǎo)的癌癥治療提供了新的視角，顯示了巨大的臨床應(yīng)用潛力。

3.2 聲動(dòng)力療法結(jié)合磁熱療法

磁熱療法（magnetic hyperthermal therapy,MHT）是一種利用磁性納米粒子（如Fe3O4），通過交變磁場(chǎng)（alternating magnetic field,AMF）將磁能轉(zhuǎn)化為熱能的技術(shù)[27]。與被廣泛研究的利用光產(chǎn)生熱量殺死腫瘤的光熱療（photothermal therapy,PTT）不同，MHT可以處理各種組織的深部腫瘤，因?yàn)锳MF具有出色的組織穿透能力[28]。然而，單用MHT并不能獲得滿意的治療效果，因此在腫瘤治療中常與其他治療手段聯(lián)合使用。由于MHT與SDT具有相似的高組織穿透特性，因此MHT聯(lián)合SDT被認(rèn)為是協(xié)同治療癌癥的新策略。

最近，Zhang等以空心Fe3O4為磁熱劑，血卟啉（HP）為聲敏劑構(gòu)建了多功能納米體系，實(shí)現(xiàn)了MHT和SDT對(duì)腫瘤的協(xié)同治療效果[29]。這種情況下，F(xiàn)e3O4不僅作為MHT的磁高溫劑，而且作為一種內(nèi)在的類似過氧化氫酶的納米酶，催化H2O2原位生成O2，以克服腫瘤缺氧，并為SDT介導(dǎo)的ROS生成提供氧氣來源。產(chǎn)生的ROS可以抑制熱休克蛋白（heat shock proteins,HSPs）的表達(dá)，降低細(xì)胞的熱耐受性，從而大大提高M(jìn)HT的治療效果。實(shí)驗(yàn)證明，這種相互增強(qiáng)的納米體系同時(shí)克服了MHT和SDT的缺陷，并顯示出協(xié)同抑制PC-3腫瘤增殖的效用。

3.3 聲動(dòng)力療法結(jié)合微波熱療法

微波熱療法（microwave thermotherapy），使用溫度區(qū)間在41℃和45℃之間，由于其可操作性強(qiáng)、產(chǎn)熱快，引起了越來越多的關(guān)注。微波輻射對(duì)組織的穿透深度較深，對(duì)組織局部熱的敏感度較低，提高了殺滅腫瘤細(xì)胞的效率。因此，它已成為與免疫治療、化療、放射治療或手術(shù)治療相結(jié)合的新一代聯(lián)合治療癌癥的最有前途的技術(shù)之一。SDT聯(lián)合微波熱療，可以增強(qiáng)免疫治療抗腫瘤作用，因?yàn)楦嗟牧馨图?xì)胞被招募到腫瘤部位，分泌更多的細(xì)胞因子。

Qi等報(bào)道了一種具有pH和熱雙重敏感度的牛乳鐵蛋白納米粒子（HLPN），當(dāng)應(yīng)用在微波熱療時(shí)，該納米粒子同時(shí)具有抗腫瘤和免疫細(xì)胞激活的作用[30]。牛乳鐵蛋白被納米粒子送到腫瘤部位后，在溶酶體的酸性環(huán)境和微波輻射引起的熱條件下立即從納米粒子中釋放出來，最終通過損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）的釋放導(dǎo)致腫瘤凋亡。體內(nèi)和體外研究表明，熱療可明顯誘導(dǎo)腫瘤免疫原性細(xì)胞死亡（ICD），并增強(qiáng)DAMPs的釋放。HLPN加熱療組對(duì)抗腫瘤的效果最好。實(shí)驗(yàn)觀察到腫瘤部位淋巴細(xì)胞浸潤增加，淋巴細(xì)胞增殖增強(qiáng)，細(xì)胞因子分泌增多，提示HLPN加微波熱療策略可引起較強(qiáng)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

值得注意的是，此實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的pH和熱雙敏納米粒子在癌癥治療中有很好的應(yīng)用，微波熱療結(jié)合免疫治療的策略為臨床腫瘤治療提供了解決方案。雖然目前還沒有關(guān)于聲動(dòng)力療法結(jié)合微波熱療的相關(guān)報(bào)道，但這也為我們提供了新思路，值得進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)與展望

近年來，聯(lián)合應(yīng)用熱療、藥物治療、光熱療法（PTT）與化療、PTT與PDT的聯(lián)合治療已成為有效殺滅腫瘤細(xì)胞的重要策略，可顯著提高治療效果，降低不良反應(yīng)。隨著納米復(fù)合材料與PSs的逐漸發(fā)展，SDT、PDT與熱療的結(jié)合也隨之產(chǎn)生，將納米技術(shù)與其相結(jié)合，不僅能聯(lián)合熱療共同對(duì)腫瘤進(jìn)行作用，還能顯著增溶難溶性聲敏劑，提高聲敏劑的聲動(dòng)力活性，改善其組織分布，降低對(duì)機(jī)體的毒副作用。此外，部分納米載體在轉(zhuǎn)運(yùn)藥物的同時(shí)，還具有潛在的生物活性，且易于修飾，有利于實(shí)現(xiàn)制劑的多功能化，推動(dòng)疾病的多模式診斷和治療[31]。SDT-HT聯(lián)合療法，已被證明通過調(diào)節(jié)不同的信號(hào)通路，極大地改善了治療效果。因此探索納米材料輔助的SDT-HT聯(lián)合療法在臨床轉(zhuǎn)化方面有很大的潛力。同時(shí)也有許多挑戰(zhàn)有待解決，目前來看，納米技術(shù)在疾病聲動(dòng)力療法中的應(yīng)用還處于起步階段，有關(guān)制劑類型的報(bào)道較少，且缺乏大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。相信不久的將來，我們可以通過建立系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)理論方法，擴(kuò)充納米制劑的種類，引入新興納米材料等手段克服重重困難，加快推進(jìn)納米技術(shù)在癌癥聲動(dòng)力療法中的研究，為未來進(jìn)行納米材料輔助聲動(dòng)力聯(lián)合熱療治療癌癥的臨床轉(zhuǎn)化打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。