牛隱孢子蟲檢測技術(shù)研究進展

張國帥 韓金城 許應(yīng)天

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 1 330002）

0 引言

隱孢子蟲呈世界性流行和分布，是引起哺乳動物腹瀉的重要致病原蟲［1］。目前，已鑒定的隱孢子蟲有30多種［2］。我國隱孢子蟲傳播范圍較廣，糞—口途徑傳播是其主要的傳播方式。據(jù)報道，我國繼1986年陳義民等［3］在甘肅省蘭州市犢牛中首次發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲后，王妍等［4］在陜西省、吉林省、上海市等地也相繼發(fā)現(xiàn)了隱孢子蟲。

隱孢子蟲在牛群中的感染情況相當普遍，其基因亞型較多，包括芮氏隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、微小隱孢子蟲和牛隱孢子蟲等。斷奶后，犢牛對隱孢子蟲尤為敏感。我國犢牛主要感染的隱孢子蟲亞型為牛隱孢子蟲和微小隱孢子蟲［5］。隱孢子蟲嚴重危害養(yǎng)牛業(yè)，是造成犢牛死亡的主要原因之一，并且目前沒有有效的針對隱孢子蟲病的治療方法，更多的是要及時進行防控，切斷傳染源。因此，對隱孢子蟲及其基因型檢測技術(shù)進行研究具有重要意義。

1 病原形態(tài)學(xué)檢測

目前，病原形態(tài)學(xué)觀察依然是最常用的隱孢子蟲檢測方法。Henriksen等［6］于1981年采用改良抗酸染色法檢測隱孢子蟲卵囊，在顯微鏡下可明顯區(qū)分粉紅色的隱孢子蟲與其他顆粒物及雜質(zhì)。該方法是牛隱孢子蟲檢測方法中應(yīng)用最為廣泛的一種，具有簡單、快捷、成本低、對儀器要求不高等特點，但是敏感性較低，并且無法鑒定亞型和基因型，僅適用于初步鑒定。

2 免疫學(xué)檢測

現(xiàn)階段常見的免疫學(xué)檢測隱孢子蟲的方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）等。該試驗不需要濃縮糞便樣品就能夠快速檢測大批量糞便樣品，卵囊檢測限為103～104個/mL。免疫學(xué)檢測與病原形態(tài)學(xué)檢測相比有著更高的敏感度和準確性，并且消除了病原形態(tài)學(xué)檢測存在的主觀性。但免疫學(xué)檢測也無法確定隱孢子蟲的基因亞型，只能用于初步檢測。

3 分子生物學(xué)檢測

目前，應(yīng)用于牛隱孢子蟲及其蟲種鑒定研究的分子生物學(xué)技術(shù)有聚合酶鏈式反應(yīng)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增、基因芯片、DNA測序技術(shù)等［7］。

3.1 聚合酶鏈式反應(yīng)

1991年，Laxer等［8］首次將聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）應(yīng)用于隱孢子蟲的鑒定。自采用常規(guī)PCR技術(shù)鑒定隱孢子蟲以來，延伸出了采用巢氏PCR、定量PCR、PCR-RFLP等檢測隱孢子蟲的技術(shù)。現(xiàn)階段，小亞基核糖體rRNA（18S rRNA）、卵囊壁蛋白（COWP）、熱休克蛋白（HSP70）、肌動蛋白（G-actin）等編碼基因常作為分子標記的基因位點。其中，隱孢子蟲18S rRNA基因保守性高，容易設(shè)計PCR引物。因此，大多數(shù)學(xué)者采用18S rRNA作為基因位點，能夠鑒別幾乎所有的隱孢子蟲亞型。

3.1.1 常規(guī)PCR。Laxer等［8］首次使用PCR技術(shù)檢測隱孢子蟲。宰德富等［9］從牛和人糞便中的微小隱孢子蟲提取出DNA，然后克隆出一個2.3 kb的微小隱孢子蟲DNA片段，選擇其中一條452 bp片段為靶序列，并且設(shè)計了一對含有26個堿基的引物和兩個含有20個堿基的探針［9］，證實了該引物為特征性片段。馬良等［10］利用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）原理建立一種敏感且特異的方法（常規(guī)PCR）檢測人和動物糞便標本中的微小隱孢子蟲，證明常規(guī)PCR方法的敏感性明顯高于傳統(tǒng)病原分離鑒定和血清學(xué)鑒定。常規(guī)PCR鑒定具有成本低、敏感性高、適合大數(shù)量檢測的優(yōu)點，但擴增產(chǎn)物需要純化測序，浪費時間，且易出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果。

3.1.2 巢式PCR。巢式PCR是鑒定牛隱孢子蟲亞型最常用的聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)之一。Balatbat等［11］在1996年首次使用巢式PCR（Nested-PCR）檢測隱孢子蟲，用兩段引物成功擴增出一條400 bp的特異性片段，在抗酸染色法檢測為陰性的28例樣本中檢測出4例陽性樣本，發(fā)現(xiàn)巢式PCR技術(shù)比病原形態(tài)學(xué)觀察敏感性更高、特異性更強、穩(wěn)定性也更好。王權(quán)等［12］應(yīng)用巢式PCR對牛糞便中的隱孢子蟲進行檢測，每克糞便最少檢測出5個卵囊，其敏感性比常規(guī)PCR高100倍。嚴若峰等［13］使用巢式PCR、普通PCR及病原形態(tài)學(xué)觀察對比檢測隱孢子蟲，119份樣品中有5例普通PCR檢測為陰性，而巢式PCR檢測為陽性，在隱孢子蟲卵囊含量較低的樣本中普通PCR很難檢出，而巢式PCR較普通PCR更為敏感，提高了低含量樣本中成功檢測的可能性。張龍現(xiàn)等［14］完善了巢式PCR檢測體系，成功擴增出820 bp特異性反應(yīng)條帶，卵囊最低檢測值≤2.86個/mL，敏感性大大提高。雖然巢式PCR的敏感性很高，但極易被污染，尤其是應(yīng)用于牛隱孢子蟲的檢測時。這是因為糞便雜質(zhì)較多，會導(dǎo)致DNA擴增受到限制。因此，檢測人員應(yīng)該嚴格把控DNA的提取，防止樣本雜質(zhì)過多影響試驗結(jié)果。

3.1.3 定量PCR。Homen等［15］建立了用于檢測牛微小隱孢子蟲的定量（Real-time）PCR方法，以肌動蛋白為基因位點對209份樣品進行檢測，并與巢式PCR進行對比，發(fā)現(xiàn)Real-time PCR比巢式PCR檢測率高16.7%，但此方法只能用于檢測微小隱孢子蟲，其他亞型無法特異性擴增。Burnet等［16］針對牛感染隱孢子蟲亞型建立了新型Real-time PCR，基于18S rRNA基因位點設(shè)計通用型的TaqMan測定法，可以特異性檢測出牛源隱孢子蟲，解決了以往一次只能檢測一種隱孢子蟲亞型的問題，節(jié)約了檢測時間，便于大批量檢測。與巢式PCR相比，定量PCR反應(yīng)敏感度高、耗時短，可以實時監(jiān)測DNA的擴增操作。但試驗證明，在樣本中PCR抑制劑較多、卵囊相對較少的情況下，巢式PCR檢測方法比較理想。

3.1.4 反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）。反轉(zhuǎn)錄PCR檢測是針對隱孢子蟲的mRNA進行檢測的，因此，mRNA的提取為該檢測技術(shù)的重點，其中卵囊破裂的強度被認為是影響mRNA提取質(zhì)量的關(guān)鍵因素。Garces等［17］將磁珠法和異硫氰酸胍/酚/氯仿法進行對比，發(fā)現(xiàn)磁珠法能夠更好地打破卵囊壁并能保證mRNA的完整性，且靈敏度是異硫氰酸胍/酚/氯仿法的2.6倍以上。Jenkins等［18］采用定量實時冰凍病毒RT-PCR、半定量冷凍病毒RT-PCR、巢式PCR檢測卵囊，結(jié)果表明：定量實時冰凍病毒RT-PCR和半定量冷凍病毒RT-PCR可用于檢測卵囊含量較低的樣品（低于5個），敏感度較高；RT-PCR相較于巢式PCR不需要進行兩次PCR檢測樣品，節(jié)約了檢測時間。同時，由于RT-PCR在單個試管內(nèi)即可完成檢測，這使得樣品被污染的可能性顯著降低。由于失活的隱孢子蟲不能產(chǎn)生mRNA，所以該技術(shù)不能對失活的隱孢子蟲進行檢測。但也正因如此，可利用RT-PCR的這一特點對隱孢子蟲的活性進行檢測，這對隱孢子蟲的亞型分析及跟蹤隱孢子蟲病的暴發(fā)有重要意義。

3.1.5 多重PCR。彭昊等［19］采用多重PCR成功檢測出微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲，此方法最低可檢測到1 g糞便中500個卵囊。Santin等［20］采用多重PCR方法鑒別賴氏隱孢子蟲、微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、牛隱孢子蟲，但該方法檢測到的微小隱孢子蟲反應(yīng)條帶為400 bp，安氏隱孢子蟲反應(yīng)條帶為350 bp，條帶差異僅為50 bp。雖然多重PCR能夠特異性地檢測樣品且具有較高的敏感性，但在電泳鑒定時對所用Maker、瓊脂糖及結(jié)果辨識區(qū)分能力上要求較高。多重PCR與單一PCR不同，單一PCR只能檢測一種基因，而多重PCR可同時檢測多種基因型或者同一基因的不同基因亞型，極大地節(jié)約了成本及檢測時間。

3.1.6 聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）。Xiao等［21］在1991年首次采用PCRRFLP檢測隱孢子蟲亞型，先應(yīng)用巢式PCR技術(shù)擴增隱孢子蟲18S rRNA基因，隨后采用SspⅠ和VspⅠ對擴增出的特異性片段進行酶切，成功鑒定了微小隱孢子蟲、貝式隱孢子蟲、鼠隱孢子蟲和蛇隱孢子蟲。王鶴磊［22］采用PCR-RFLP技術(shù)，將巢式PCR第二輪擴增產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶MboⅡ和SspⅠ進行酶切，并將Maker設(shè)置在500 bp，通過SspⅠ鑒別出安氏隱孢子蟲，隨后利用MboⅡ酶切，鑒別了芮氏隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、微小隱孢子蟲和牛隱孢子蟲。PCR-RFLP技術(shù)改變了只能通過DNA測序才能鑒定牛源隱孢子蟲亞型的情況，并且具有快捷、敏感性高、便于大量操作等優(yōu)點，為牛隱孢子蟲檢測提供了新方案。

3.2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)

Karanis等［23］在2007年首次應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）檢測隱孢子蟲，針對隱孢子蟲的GP60基因設(shè)計了特異性引物，并將擴增的189 bp產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測特異性，與常規(guī)PCR對比敏感度，發(fā)現(xiàn)LAMP檢測限度為每個檢測管1個卵囊，而PCR檢測限度為每個檢測管1×105個卵囊。LAMP的建立節(jié)約了核酸擴增的時間，并且能夠檢測到卵囊含量低的樣本。袁忠英等［24］在2009年首次應(yīng)用LAMP技術(shù)檢測牛隱孢子蟲，通過隱孢子蟲18S rRNA序列設(shè)計4條引物進行擴增，并使用SYBR GreenⅠ顯色檢測，隱孢子蟲卵囊特異性顯示為陽性。史亞東［25］對LAMP檢測體系進行了優(yōu)化，減少了預(yù)變性和酶失活的步驟。優(yōu)化后的LAMP節(jié)約了試驗時間，可以實時顯示檢測結(jié)果，并且避免了開蓋造成污染的可能。但是，LAMP對特異性的引物要求較高，否則易出現(xiàn)非特異性擴增，因此設(shè)計高特異性的引物是這個試驗成功的關(guān)鍵。

3.3 基因芯片技術(shù)

利用基因芯片技術(shù)可以檢測牛隱孢子蟲卵囊，也可檢測牛隱孢子蟲蟲種。Wang等［26］采用基因芯片與PCR對比，熒光標記片段，采用提前設(shè)計的基因型、亞基因型和不同種屬的隱孢子蟲的寡核苷酸探針進行雜交，發(fā)現(xiàn)基因芯片可以排除PCR中出現(xiàn)的假陽性，提高檢測的準確度?；蛐酒啾萈CR可以獲得更多的信息量，并且其特異性和靈敏度都很高［27］。基因芯片技術(shù)是一種檢測牛隱孢子蟲及其蟲種的前沿技術(shù)，但是該方法應(yīng)用成本較高，暫不適合實際應(yīng)用。

3.4 DNA測序技術(shù)

Laxer等［8］首次應(yīng)用PCR檢測隱孢子蟲，并與DNA測序技術(shù)相結(jié)合鑒定基因型。DNA測序提供了一個準確的參考基因組序列庫，廣泛應(yīng)用于牛隱孢子蟲檢測。這種技術(shù)能夠評估隱孢子蟲物種之間的基因組變異。但是，DNA測序技術(shù)的耗材相對較為昂貴，并且耗時較長，因此不適宜大批量檢測。

4 其他新興檢測技術(shù)

4.1 納米技術(shù)

納米技術(shù)克服了熒光標記不穩(wěn)定的缺點。Singh等［28］使用半導(dǎo)體作為熒光標記檢測微小隱孢子蟲卵囊，發(fā)現(xiàn)量子點在長達5 min的連續(xù)紫外光激發(fā)下更具光穩(wěn)定性。與有機熒光團相比，量子點對水樣中其他熒光物質(zhì)的干擾減少了50%。

4.2 基于芯片技術(shù)的生物傳感器

Chang等［29］改進了表面等離子體諧振生物傳感器，首次將生物素化的單克隆抗體與隱孢子蟲卵囊結(jié)合形成結(jié)合物，通過離心分離的方法，使含結(jié)合物的緩沖液通過金屬膜。這讓目標物更加容易傳導(dǎo)至傳感器金屬表面，便于檢測人員實時獲得檢測結(jié)果，且敏感度較高。但是，由于緩沖液的折射率不一致，所以檢測結(jié)果會受到影響。Thiruppathiraja等［30］開發(fā)了一種基于夾心酶聯(lián)免疫傳感的檢測水樣中隱孢子蟲的電化學(xué)生物傳感器。夾心試驗的結(jié)構(gòu)由金納米顆粒、一抗、卵囊和與金納米顆粒結(jié)合的二抗組成，卵囊檢測下限為3個/mL，具有極高的敏感度。該技術(shù)提高了分析性能，可實現(xiàn)實時檢測及高通量、快速分析，能夠減少資源浪費。但是，金納米價格較為昂貴，無法大范圍應(yīng)用于臨床試驗。

5 展望

目前，隱孢子蟲對養(yǎng)牛業(yè)的危害越來越大，牛隱孢子蟲檢測技術(shù)也在不斷創(chuàng)新。但截至目前，沒有一種檢測技術(shù)是完美的。傳統(tǒng)的病原形態(tài)學(xué)檢測技術(shù)依賴于實驗室顯微鏡，檢測主觀性較強，敏感度低且無法確定亞型。分子生物學(xué)檢測是目前判斷牛隱孢子蟲及其亞型最常用的檢測技術(shù)，敏感度較高，較為經(jīng)濟且適合大批量操作。最先進的納米技術(shù)更加敏感、耐用，具有很高的識別性，但是存在造價昂貴、操作時間過長等缺點。很多學(xué)者努力將PCR技術(shù)與新發(fā)展的芯片技術(shù)相結(jié)合，期待會有好的效果。經(jīng)過幾十年的努力，隱孢子蟲的檢測技術(shù)從最早的病原病態(tài)學(xué)檢測技術(shù)，發(fā)展到分子生物學(xué)技術(shù)，以及目前的新興技術(shù)，逐步向著更敏感、快速、特異性的方向發(fā)展。優(yōu)秀的檢測技術(shù)對于牛隱孢子蟲病的防治非常重要。筆者對牛隱孢子蟲檢測技術(shù)進行了匯總，希望能為今后牛隱孢子蟲的進一步研究提供理論依據(jù)，減少隱孢子蟲病對養(yǎng)牛業(yè)造成的危害。