生物炭及其碳骨架對(duì)微生物去除水中低濃度硝酸鹽的影響

常智淋，王朝旭,2①，張 峰,2，李紅艷,2，崔建國(guó),2

(1.太原理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030600；2.山西省市政工程研究生教育創(chuàng)新中心，山西 晉中 030600)

隨著城市化進(jìn)程的加快以及人民生活水平的提高，污水量不斷增加，水體污染日益嚴(yán)重。日益突出的水環(huán)境問(wèn)題，使得污水處理的排放標(biāo)準(zhǔn)越來(lái)越高。然而，目前普遍推行的GB 18918—2002《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》中的一級(jí)A標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，出水總氮(TN)質(zhì)量濃度不高于15 mg·L-1，但其仍遠(yuǎn)高于GB 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中V類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(TN質(zhì)量濃度不高于2.0 mg·L-1)。因此，對(duì)于受納水體來(lái)說(shuō)，城鎮(zhèn)污水處理廠尾水仍可能是潛在污染源[1]。NO3--N是城鎮(zhèn)污水處理廠尾水中氮素的主要形式，其質(zhì)量濃度約為10 mg·L-1。同時(shí)，NO3--N的富集也是造成水體富營(yíng)養(yǎng)化的主要原因之一，且NO3--N是反硝化作用的底物，易引起氧化亞氮(N2O)排放，而N2O的全球增溫潛勢(shì)是CO2的298倍[2]，對(duì)全球變暖有重要影響。因此，采取措施進(jìn)一步降低污水處理廠尾水中NO3--N濃度，具有重大現(xiàn)實(shí)意義。

生物炭是一種含碳量豐富、孔隙多、比表面積大、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且難以被微生物降解的物質(zhì)[3]，近年來(lái)引起廣泛關(guān)注。生物炭具有電化學(xué)活性[4]，其電化學(xué)活性主要來(lái)源于兩個(gè)部分：一是生物炭表面存在的氧化還原活性官能團(tuán)(如醌、酚等結(jié)構(gòu))[5]；二是由π電子離域和類石墨片狀結(jié)構(gòu)引起的電導(dǎo)[6]。生物炭包含可溶和不可溶組分[7]。在自然界中，生物炭可溶組分會(huì)溶出，剩下的不可溶組分表面含氧官能團(tuán)也會(huì)發(fā)生變化。研究表明，生物炭氧化還原活性官能團(tuán)以溶解性有機(jī)碳(可溶組分)形式存在[8]，而電導(dǎo)結(jié)構(gòu)存在于碳骨架(不可溶組分)中[9]。與生物炭氧化還原活性不同，生物炭電導(dǎo)結(jié)構(gòu)能夠直接將電子從電子供體傳遞到電子受體，而不需要暫時(shí)儲(chǔ)存電子[5]，此電子傳遞過(guò)程并不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，因此，其電子傳遞速度較快[10]。

反硝化過(guò)程表現(xiàn)為在缺氧條件下，作為電子受體的NO3-在硝酸鹽還原酶(NAR)作用下被還原為NO2-，然后，依次在亞硝酸鹽還原酶(NIR)、一氧化氮還原酶以及氧化亞氮還原酶作用下，最終還原為N2O和N2。因此，生物炭作為一種電化學(xué)活性物質(zhì)，其在反硝化過(guò)程中必定起著重要作用，施用生物炭可能是減少N2O排放的一種潛在方法[11]。CHEN等[8]研究發(fā)現(xiàn)，低溫(300 ℃)條件下制得的生物炭上酚類結(jié)構(gòu)可以作為電子供體，促進(jìn)反硝化過(guò)程中N2O還原；高溫(800 ℃)條件下制得的生物炭上醌類結(jié)構(gòu)可以作為電子受體，抑制反硝化速率和N2O排放；同時(shí)，高溫條件下制得的生物炭上電導(dǎo)結(jié)構(gòu)也可以促進(jìn)反硝化過(guò)程中N2O還原。生物炭可以促進(jìn)微生物之間的胞外電子傳遞，稱之為直接種間電子傳遞[12]。LIU等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在以乙醇為電子供體、以富馬酸鹽為電子受體的培養(yǎng)基中，生物炭可以加速電子從金屬還原地桿菌屬(Geobactermetallireducens)向硫還原地桿菌屬(Geobactersulfurreducens)轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)，此過(guò)程中生物炭的電導(dǎo)結(jié)構(gòu)促進(jìn)了微生物種間電子傳遞。類似地，CAYUELA等[14]研究發(fā)現(xiàn)，生物炭的電導(dǎo)結(jié)構(gòu)增加了反硝化微生物與生物炭表面離域π-電子體系之間相互作用的可能性，從而促進(jìn)電子傳遞。

雖然生物炭對(duì)反硝化作用的電子傳遞過(guò)程有顯著影響，但是生物炭中可溶組分(浸提液)與不可溶組分(碳骨架)對(duì)反硝化作用和N2O排放的相對(duì)貢獻(xiàn)如何，尚不清楚。因此，筆者以稻殼生物炭為例，首先通過(guò)水洗法制備碳骨架(不可溶組分)和浸提液(可溶組分)，并富集篩選厭氧反硝化細(xì)菌，然后開展在生物炭、碳骨架或浸提液存在條件下，反硝化細(xì)菌去除模擬廢水中低濃度(約10 mg·L-1)硝酸鹽的室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)，探究稻殼生物炭、碳骨架和浸提液對(duì)反硝化過(guò)程及N2O排放的影響，并揭示碳骨架(電導(dǎo)結(jié)構(gòu))在反硝化過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 稻殼生物炭可溶和不可溶組分的分離與表征

供試生物炭為稻殼生物炭(BC)，使用前過(guò)1 mm孔徑篩。將生物炭和超純水按質(zhì)量(g)體積(mL)比1∶50比例混合，振蕩24 h(170 r·min-1、25 ℃)后過(guò)0.45 μm孔徑濾膜，收集濾液，冷凍條件(-18 ℃)下保存，此為生物炭可溶組分，稱為浸提液(BCE)。收集濾膜上的生物炭，將其懸浮于超純水中，振蕩6 h(170 r·min-1、25 ℃)，過(guò)濾，重復(fù)這一過(guò)程，直至濾液電導(dǎo)率(EC)小于50 μS·cm-1，然后收集生物炭，烘至恒重(60 ℃)，此為生物炭不可溶組分，稱為碳骨架(WBC)。BC、WBC和BCE理化性質(zhì)測(cè)定方法同文獻(xiàn)[15]，含氧官能團(tuán)類型采用傅里葉變換紅外光譜儀(SpectrumTwo，美國(guó))測(cè)定。

1.2 反硝化細(xì)菌的培養(yǎng)和鑒定

1.2.1反硝化細(xì)菌的富集分離

以山西省太原市某污水處理廠A2/O工藝回流池的活性污泥為菌種來(lái)源。將2 mL活性污泥上清液接種至200 mL反硝化液體培養(yǎng)基〔組成及質(zhì)量濃度(g·L-1)：檸檬酸鈉5.0，KNO32.0，K2HPO41.0，KH2PO41.0，MgSO40.2；微量元素溶液[16]2 mL；pH 7.0～7.5〕進(jìn)行富集培養(yǎng)(170 r·min-1、30 ℃)。3 d后以體積分?jǐn)?shù)φ=1%的接種量將培養(yǎng)基上清液接種至新鮮的反硝化液體培養(yǎng)基中，重復(fù)富集3次。富集后采用平板涂布法分離并初篩厭氧反硝化細(xì)菌[17]。所有培養(yǎng)基在配制過(guò)程中，首先通入高純氮?dú)?φ=99.999%)驅(qū)氧30 min，同時(shí)向培養(yǎng)基中加入還原劑L-半胱氨酸(0.5 g·L-1)，利用其還原性去除氧，使培養(yǎng)基處于無(wú)氧狀態(tài)，然后滅菌20 min備用(121 ℃)[18]。

1.2.2細(xì)菌反硝化能力鑒定

從溴百里酚藍(lán)初篩培養(yǎng)基表面挑取呈藍(lán)色的單菌落[17]，接種至150 mL模擬廢水〔組成及質(zhì)量濃度(g·L-1)：檸檬酸鈉0.18，KNO30.07(NO3--N質(zhì)量濃度為10 mg·L-1)，其余同反硝化液體培養(yǎng)基〕，連續(xù)培養(yǎng)72 h(170 r·min-1、30 ℃)，分別于培養(yǎng)0、4、8、12、24、36、48、60和72 h時(shí)采樣，測(cè)定其NO3--N、NO2--N、NH4+-N和TN濃度。選取NO3--N和TN濃度明顯降低的菌落作為后續(xù)試驗(yàn)所用厭氧反硝化細(xì)菌(DB)。將該菌落接種至反硝化液體培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h(170 r·min-1、30 ℃)后，4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定

將含有DB的反硝化液體培養(yǎng)基離心(轉(zhuǎn)速為10 000 r·min-1，離心半徑為9.83 cm，5 min)收集菌體后，用干冰包裝送至生工生物工程(上海)股份有限公司，進(jìn)行微生物16S擴(kuò)增子高通量測(cè)序。利用引物341F：CCTACGGGNGGCWGCAG和805R：GACTACHVGGGTATCTAATCC對(duì)細(xì)菌16S的V3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增中高保真反應(yīng)體系選用Yeasen的2×Hieff? Robust PCR Master Mix。PCR產(chǎn)物采用Illumina MiSeqTM/HiseqTM測(cè)序系統(tǒng)上機(jī)分析，在97%置信度下將樣品所有16S rRNA基因序列進(jìn)行分類，獲得門水平下的分類。另外，采用PICRUSt軟件將所篩選菌落的16S rRNA基因序列與代謝功能已知的微生物參考基因組KEGG功能譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，預(yù)測(cè)菌落的代謝功能。

1.3 室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)

通過(guò)利用反硝化細(xì)菌去除模擬廢水中低濃度硝酸鹽的室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)，探究稻殼生物炭、碳骨架和浸提液對(duì)反硝化過(guò)程及N2O排放的影響，揭示碳骨架(電導(dǎo)結(jié)構(gòu))在反硝化過(guò)程中的作用。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共設(shè)5個(gè)處理：(1)模擬廢水+生物炭(BC)；(2)模擬廢水+種子液(DB)；(3)模擬廢水+種子液+生物炭(DB+BC)；(4)模擬廢水+種子液+碳骨架(DB+WBC)；(5)模擬廢水+種子液+浸提液(DB+BCE)。

移取5 mL預(yù)先保存的含所篩選菌落DB的反硝化液體培養(yǎng)基接種于1 L LB液體培養(yǎng)基[19]中，培養(yǎng)至吸光度D600=1.0(170 r·min-1、30 ℃)，離心(轉(zhuǎn)速為10 000 r·min-1，離心半徑為9.83 cm，5 min)收集菌體后，用無(wú)菌水洗滌兩次，最后重懸浮于100 mL無(wú)菌水中，此為種子液。首先將5 mL種子液添加至裝有100 mL模擬廢水的培養(yǎng)瓶(300 mL)中(對(duì)于BC處理，用等體積的無(wú)菌水代替種子液；對(duì)于DB+BCE處理，培養(yǎng)瓶中模擬廢水體積為50 mL)，混勻后將1 g BC或WBC加入培養(yǎng)瓶；對(duì)于DB+BCE處理，將50 mL BCE加入培養(yǎng)瓶。除DB+BCE處理培養(yǎng)體系NO3--N質(zhì)量濃度為4.76 mg·L-1外，其他處理均為9.52 mg·L-1。充分混勻后，用連接有兩個(gè)三通閥的瓶蓋密封培養(yǎng)瓶口。為了在培養(yǎng)過(guò)程中保持無(wú)氧狀態(tài)，培養(yǎng)瓶頂部空間用高純氮?dú)?φ=99.999%)充分置換。所有培養(yǎng)瓶置于搖床(170 r·min-1、30 ℃)中避光連續(xù)培養(yǎng)60 h。

每個(gè)處理設(shè)置9個(gè)培養(yǎng)瓶，將9個(gè)培養(yǎng)瓶平均分成3組。第1組培養(yǎng)瓶用于測(cè)定N2O排放速率；向第2組培養(yǎng)瓶頂部空間加入乙炔(φ=20%)，且壓力保持在1.013×105Pa，用于抑制反硝化過(guò)程中N2O 向N2的轉(zhuǎn)化，通過(guò)測(cè)定N2O排放量，識(shí)別N2O+N2排放量。第3組培養(yǎng)瓶用于測(cè)定培養(yǎng)體系的理化性質(zhì)(pH值、EC、NO3--N、NO2--N、NH4+-N和TN)及酶活性(NAR和NIR)。

分別于培養(yǎng)4、8、12、24、36、48和60 h時(shí)測(cè)定第1組培養(yǎng)瓶中N2O排放速率。在每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)，首先用注射器通過(guò)三通閥向瓶中注入20 mL高純氮?dú)?，推?次使瓶?jī)?nèi)氣體充分混勻，然后采集20 mL氣體樣品，立即注入裝有電子捕獲檢測(cè)器的氣相色譜儀，測(cè)定N2O濃度。氣體樣品采集后，用高純氮?dú)獯祾吲囵B(yǎng)瓶頂部空間，以徹底清除前一培養(yǎng)周期產(chǎn)生的N2O，然后開始進(jìn)入下一培養(yǎng)周期。第2組培養(yǎng)瓶在進(jìn)入下一培養(yǎng)周期之前加入乙炔。

氣相色譜儀載氣為高純氮?dú)?輸出壓力為0.4 MPa)，補(bǔ)充氣為φ=10%的CO2(輸出壓力為0.1 MPa)。色譜柱、進(jìn)樣器和檢測(cè)器溫度分別為50、50和300 ℃。N2O排放速率和累積排放量均以100 mL培養(yǎng)液為計(jì)量單位進(jìn)行計(jì)算，其計(jì)算公式為

(1)

Q=∑Ri×t。

(2)

式(1)～(2)中，Ri為ih時(shí)N2O排放速率(以N計(jì))，ng·h-1；Ci為ih時(shí)采集的氣體樣品N2O濃度，ng·L-1；V為培養(yǎng)瓶頂部空間體積，mL；20為從培養(yǎng)瓶頂部空間采集的氣體樣品體積，mL；28/44為N2O中N的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；t為采樣時(shí)間點(diǎn)的間隔，h；Q為60 h的N2O累積排放量(以N計(jì))，ng。

第3組培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)方式與第1、2組相同。分別于培養(yǎng)0、1、2、4、8、12、24、36、48和60 h時(shí)，在培養(yǎng)體系混勻狀態(tài)下采樣10 mL，過(guò)0.45 μm孔徑濾膜，測(cè)定pH值、EC以及NO3--N、NO2--N、NH4+-N和TN濃度。另外，分別于培養(yǎng)24和48 h時(shí)采集培養(yǎng)混合液測(cè)定NAR和NIR活性。NAR和NIR活性測(cè)定采用ZHENG等[20]的方法，分別用反應(yīng)體系中NO2--N增加和減少的量計(jì)算NAR和NIR活性(μmol·mL-1·h-1)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2016處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)形式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)。采用Origin 2017軟件繪圖。采用SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析差異顯著性，顯著性水平設(shè)為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落對(duì)NO3-的降解動(dòng)力學(xué)及群落組成

圖1a顯示，所篩選菌落(DB)能較好地降解NO3--N，0～24 h內(nèi)NO3--N濃度降低緩慢，平均降解速率為0.04 mgL-1h-1；24～48 h內(nèi)NO3--N濃度大幅降低，由9.18降至2.00 mgL-1，平均降解速率為0.30 mgL-1h-1；雖然48～72 h內(nèi)NO3--N濃度不再降低，但NO2--N濃度急劇下降(由峰值7.86降至0.07 mg·L-1)，同時(shí)TN濃度也隨之迅速降低(由11.36降至4.93 mg·L-1)，表明模擬廢水中氮元素在該時(shí)段內(nèi)經(jīng)反硝化作用轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮逸出培養(yǎng)體系。

PICRUSt功能預(yù)測(cè)分析表明，菌落DB能將NO3-還原為NO2-、NO、N2O和N2。該菌落的分類系統(tǒng)組成樹狀圖見圖1b，在門水平上，菌落DB包含92.74%的變形菌門(Proteobacteria)和7.26%的厚壁菌門(Firmicutes)。

b分圖中從左至右依次為分類層級(jí)，支點(diǎn)附近為該分類名稱及其對(duì)應(yīng)的豐度值。

2.2 生物炭(BC)、碳骨架(WBC)和浸提液(BCE)的理化性質(zhì)

與BC相比，WBC和BCE的pH值顯著降低；WBC的EC也顯著降低，但BCE的EC未顯著降低(P<0.05)。與BC相比，WBC的溶解性有機(jī)碳(DOC)和NO3--N含量分別顯著降低81.23%和43.98%(P<0.05)，而NO2--N和NH4+-N含量則分別增加16.00%和78.41%(表1)。

表1 生物炭、碳骨架和浸提液的理化性質(zhì)

BC、WBC和BCE分別為生物炭、碳骨架和浸提液。

2.3 反硝化過(guò)程中N2O和N2的排放特征

BC處理N2O和N2O+N2累積排放量均為零(圖3未展示)，表明模擬廢水的N2O排放完全通過(guò)微生物途徑產(chǎn)生。各處理N2O和N2O+N2排放速率達(dá)峰值的時(shí)間不同，但達(dá)峰值后均逐漸降低。DB處理N2O和N2O+N2排放速率在48 h時(shí)達(dá)峰值，DB+BC和DB+BCE處理在36 h時(shí)達(dá)峰值，而DB+WBC處理在24 h時(shí)達(dá)峰值。DB、DB+BC、DB+WBC和DB+BCE處理N2O排放速率峰值(以N計(jì))分別為3 320.21、356.23、533.01和516.18 ng·h-1，N2O+N2排放速率峰值分別為38 097.45、44 087.79、46 826.27 和26 323.76 ng·h-1(圖3)。DB、DB+BC、DB+WBC和DB+BCE處理60 h的N2O累積排放量(以N計(jì))分別為41 859.33±5 224.13、7 098.70±286.14、10 667.38±912.18和8 518.02±1 675.34 ng，N2O+N2累積排放量(以N計(jì))分別為759 247.19±108 480.93、988 337.23±8 159.49、780 946.49±28 128.30和470 809.83±7 129.47 ng。

DB處理為模擬廢水+種子液；DB+BC處理為模擬廢水+種子液+生物炭；DB+WBC處理為模擬廢水+種子液+碳骨架；DB+BCE處理為模擬廢水+種子液+浸提液。

相對(duì)累積排放量結(jié)果(圖4)表明，與DB處理相比，DB+BC和DB+WBC處理N2O+N2累積排放量分別增加30.17%和2.86%，N2O累積排放量分別減少83.04%和74.52%。另外，由累積排放量計(jì)算得出，DB、DB+BC、DB+WBC和DB+BCE處理N2O/(N2O+N2)比值分別為0.055、0.007、0.014和0.018，表明添加生物炭、碳骨架和浸提液均促進(jìn)N2O 向N2還原，減少了N2O排放，其中，以DB+BC處理為最顯著。與DB+BC處理相比，DB+WBC處理N2O+N2累積排放量減少20.98%，而N2O累積排放量顯著增加50.27%，表明碳骨架的反硝化促進(jìn)作用不及生物炭，但碳骨架的電導(dǎo)結(jié)構(gòu)在反硝化過(guò)程中仍起主要作用。

DB、DB+BC、DB+WBC和DB+BCE處理含義見圖3。

2.4 培養(yǎng)體系理化指標(biāo)和酶活性動(dòng)態(tài)變化

2.4.1pH值和EC

BC處理在培養(yǎng)前期(0～12 h)pH值上升，后期(12～60 h)pH值趨于穩(wěn)定。而DB、DB+BC、DB+WBC和DB+BCE處理pH值在培養(yǎng)后期均不同程度增加，表明發(fā)生了不同程度的反硝化作用。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，DB、DB+BC、DB+WBC和DB+BCE處理pH值分別升高0.24、0.29、0.25和0.20。與DB處理相比，DB+BC、DB+WBC和DB+BCE處理均提高了培養(yǎng)體系的pH值，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，pH值分別增加0.12、0.02和0.12，不同處理培養(yǎng)過(guò)程中pH值總體表現(xiàn)為DB+BC>DB+BCE>DB+WBC>DB(圖5)。

經(jīng)過(guò)60 h培養(yǎng)，BC、DB、DB+BC、DB+WBC和DB+BCE處理EC分別增加0.33、0.41、0.53、0.33和0.34 mS·cm-1。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，與DB處理相比，DB+BC處理EC提高6.74%，而DB+WBC和DB+BCE處理EC則分別降低6.17%和43.00%(圖5)。

BC處理為模擬廢水+生物炭；DB處理為模擬廢水+種子液；DB+BC處理為模擬廢水+種子液+生物炭；DB+WBC處理為模擬廢水+種子液+碳骨架；DB+BCE處理為模擬廢水+種子液+浸提液。

2.4.2無(wú)機(jī)氮

在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，除BC處理外，各處理NO3--N含量均隨培養(yǎng)時(shí)間的推移而逐漸降低，說(shuō)明發(fā)生了不同程度的反硝化作用，而BC處理NO3--N含量始終保持穩(wěn)定，表明各處理NO3-還原主要通過(guò)生物學(xué)過(guò)程。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，DB、DB+BC、DB+WBC和DB+BCE處理NO3--N含量分別比初始值降低98.89%、94.46%、92.58%和97.08%。NO3-還原主要發(fā)生在培養(yǎng)前24 h內(nèi)，該時(shí)段DB、DB+BC、DB+WBC和DB+BCE處理NO3--N含量分別降低88.17%、79.73%、84.33%和82.15%(圖6)。

在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，除BC處理外，各處理NO2--N含量總體呈先上升后下降趨勢(shì)，且均在反硝化速率(N2O+N2排放速率)達(dá)到峰值時(shí)，接近于零。與NO3--N、NO2--N和TN含量相比，各處理NH4+-N含量始終處于較低水平，且0～60 h內(nèi)無(wú)大幅波動(dòng)，主要是因?yàn)榕囵B(yǎng)體系處于厭氧狀態(tài)，無(wú)硝化作用發(fā)生。因此，培養(yǎng)體系產(chǎn)生的N2O均由反硝化作用過(guò)程產(chǎn)生。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，DB、DB+BC、DB+WBC和 DB+BCE處理TN含量分別比初始值降低78.57%、74.79%、76.77%和89.66%。TN含量降低主要發(fā)生在培養(yǎng)12～48 h內(nèi)(圖6)。

BC、DB、DB+BC、DB+WBC和DB+BCE處理含義見圖5。

2.4.3NAR和NIR活性

與培養(yǎng)24 h時(shí)相比，培養(yǎng)48 h時(shí)DB、DB+BC、DB+WBC和DB+BCE處理NAR活性分別增加31.25%、8.67%、4.63%和47.98%。在培養(yǎng)24和48 h時(shí)，DB、DB+BC和DB+WBC處理NAR活性之間均無(wú)顯著差異，但DB+BCE處理NAR活性顯著高于DB處理(P<0.05)。與24 h時(shí)相比，48 h時(shí)DB、DB+BC、DB+WBC和DB+BCE處理NIR活性分別提高32.99%、122.05%、33.03%和30.45%。培養(yǎng)24和48 h時(shí)，各處理NIR活性之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖7)。

DB、DB+BC、DB+WBC和DB+BCE處理含義見圖5。直方柱上方英文小寫字母不同表示24或48 h時(shí)4個(gè)處理間NAR或NIR活性差異顯著(P<0.05)。

3 討論

3.1 生物炭及其碳骨架對(duì)反硝化速率和N2O還原的作用

除生物學(xué)過(guò)程外，非生物學(xué)過(guò)程對(duì)N2O排放也有一定貢獻(xiàn)[21]。研究表明，在土壤中存在化學(xué)反硝化作用(一種無(wú)機(jī)氮被還原為氣態(tài)氮的非生物學(xué)過(guò)程)[22]。BC處理(未添加菌落DB)N2O累積排放量為零，且NO3-含量在培養(yǎng)過(guò)程中并未降低；然而，DB處理能產(chǎn)生N2O，表明筆者研究中不存在化學(xué)反硝化作用。

DB處理反硝化速率(N2O+N2排放速率)峰值(以N計(jì))在48 h時(shí)出現(xiàn)，而DB+BC處理反硝化速率峰值在36 h時(shí)出現(xiàn)，DB+WBC處理反硝化速率峰值甚至在24 h時(shí)出現(xiàn)，且DB+BC和DB+WBC處理峰值(分別為44 087.79和46 826.27 ng·h-1)均高于DB處理(38 097.45 ng·h-1)，表明生物炭及其碳骨架均使培養(yǎng)體系的反硝化速率加快。另一方面，與DB處理相比，添加生物炭和碳骨架分別使培養(yǎng)體系N2O/(N2O+N2)比值降低87.27%和74.55%，表明生物炭及其碳骨架均促進(jìn)N2O向N2還原。主要原因有：(1)生物炭提高了培養(yǎng)體系電子傳遞速率，增強(qiáng)了反硝化作用，并促進(jìn)N2O向N2還原[4,23]。SU等[24]研究也發(fā)現(xiàn)，施用生物炭后，土壤反硝化速率提高13%～26%，N2O累積排放量降低442%～809%，其原因?yàn)樯锾渴雇寥牢⑸镫娮觽鬟f速率提高39.6%～56.2%。(2)生物炭使培養(yǎng)體系pH值升高，進(jìn)而提高N2O還原酶活性，促進(jìn)N2O還原，導(dǎo)致較低的N2O/(N2O+N2)比值[25]。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，與DB相比，DB+BC和DB+WBC處理pH值分別增加0.12和0.02；在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，不同處理pH值總體呈DB+BC>DB+WBC>DB的趨勢(shì)。筆者研究結(jié)果與AAMER等[26]研究結(jié)果一致，其發(fā)現(xiàn)與對(duì)照處理相比，2%生物炭添加量使土壤N2O累積排放量降低70.16%，主要原因?yàn)樯锾渴雇寥纏H值升高0.63，較高的pH值有利于提高土壤nosZ和nirK基因豐度，進(jìn)而促進(jìn)N2O還原為N2[27]。王鴻浩等[28]研究也發(fā)現(xiàn)，玉米秸稈生物炭的添加使培養(yǎng)結(jié)束時(shí)土壤pH值平均升高0.5，顯著提高nosZ基因豐度，降低(nirK+nirS)/nosZ比值，促進(jìn)反硝化過(guò)程中N2O還原，從而降低N2O排放。

3.2 生物炭及其碳骨架的反硝化促進(jìn)作用對(duì)比

與DB+BC處理相比，雖然DB+WBC處理反硝化速率峰值提前12 h出現(xiàn)，但是，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程(60 h)中，與DB+BC處理相比，DB+WBC處理N2O+N2累積排放量減少20.98%，且N2O累積排放量增加50.27%；這是因?yàn)榉聪趸^(guò)程伴隨C源消耗[6]。筆者研究中，WBC處理DOC含量較低，因此與DB+BC處理相比，DB+WBC處理微生物可利用的C源較少，在一定程度上抑制了反硝化酶活性，導(dǎo)致NO3-和N2O的還原程度均較低。筆者研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)24 h時(shí)，DB+WBC處理NAR活性顯著低于DB+BC處理(P<0.05)(圖7)。相反，充足的DOC可使nosZ基因豐度和N2排放量增高，有利于完全反硝化[29]。

生物炭經(jīng)水浸提后，雖然許多含氧官能團(tuán)隨浸提液被剝離，但同時(shí)也使生物炭上原本被覆蓋的活性位點(diǎn)得以暴露[30]，生物炭電導(dǎo)結(jié)構(gòu)得以加強(qiáng)[12]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，稻殼生物炭主要通過(guò)其碳骨架(電導(dǎo)結(jié)構(gòu))進(jìn)行電子傳遞，促進(jìn)N2O還原。類似地，張?jiān)耓30]以含礦物質(zhì)豐富的豬糞、污泥生物炭為研究對(duì)象，分離生物炭的可溶與不可溶組分，發(fā)現(xiàn)不可溶組分主導(dǎo)生物炭得失電子的能力。有機(jī)物H和C原子數(shù)比(H∶Corg)是表征生物炭芳香縮合程度的指標(biāo)，該比值越低，芳香縮合程度就越高。高溫生物炭具有較低的H∶Corg，而碳骨架(電導(dǎo)結(jié)構(gòu))也具備該特征。CAYUELA等[14]通過(guò)元分析發(fā)現(xiàn)，H∶Corg小于0.3的生物炭能促使反硝化過(guò)程徹底進(jìn)行，減少(73±7)%的N2O排放，而該比值大于0.5的生物炭?jī)H能減少(40±16)%的N2O排放。WELDON等[31]和WAQAS等[32]研究均表明，碳化程度較高(H∶Corg較低或芳香縮合程度較高)的生物炭更有利于完全反硝化，促進(jìn)N2O還原。因此，與浸提液相比，芳香縮合程度較高的碳骨架可能具有較強(qiáng)的N2O還原促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

筆者研究中模擬廢水的N2O排放完全通過(guò)微生物途徑產(chǎn)生。生物炭及其碳骨架均提高反硝化速率，并促進(jìn)N2O還原。碳骨架的反硝化促進(jìn)作用不及生物炭。生物炭的含氧官能團(tuán)主要存在于浸提液中，但是碳骨架的電導(dǎo)結(jié)構(gòu)在反硝化過(guò)程中起主要作用。