殼聚糖抗菌凝膠中銀的表征及含量測定方法研究

【作 者】 彭俊，王書晗，劉文亮，柯浩奇，高小鳳

深圳市藥品檢驗研究院（深圳市醫(yī)療器械檢測中心），深圳市，518057

0 引言

抗菌凝膠的基質(zhì)材料主要有明膠、海藻酸鹽、透明質(zhì)酸、羧甲基纖維素鈉、果膠、殼聚糖等[1-2]。與其他基質(zhì)材料不同，殼聚糖除了具備形成凝膠基質(zhì)的能力，其本身還具有一定的抗菌活性[3-4]。銀的化學性質(zhì)穩(wěn)定，且具有良好的抗菌作用，由于其優(yōu)異的廣譜抗菌能力，被廣泛應用于醫(yī)療、化妝品和食品包裝等領(lǐng)域，但隨著研究的進一步深入，一些研究者發(fā)現(xiàn)無論是納米銀顆粒還是磷酸鋯鈉銀都容易進入人體，引發(fā)疾病[5]。研究顯示，納米銀可以在不同的組織和器官內(nèi)蓄積，并對血液循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和肝腎功能造成不同程度的危害，高劑量的納米銀暴露甚至會引發(fā)急性致死效應[6-7]。然而，國家標準及行業(yè)標準尚未規(guī)范含銀抗菌凝膠中銀的表征及含量檢測方法。目前，納米顆粒物的表征方法主要有掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope,SEM）、能譜儀（energy dispersive spectrometer,EDS）、透射電子顯微鏡（transmission electron microscope,TEM）、原子力電子顯微鏡（atomic force microscope,AFM）、動態(tài)光散射發(fā)（dynamic light scattering,DLS）等方法[8-9]，針對銀的形態(tài)分析有毛細管電泳-電感耦合等離子體質(zhì)譜法（capillary electrophoresis inductively coupled plasma mass spectrometry,CE-ICP-MS）、濁點萃取-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用（cloud point extraction inductively coupled plasma mass spectrometry,CPE-ICP-MS）以及單顆粒電感耦合等離子體質(zhì)譜法（single particle inductively coupled plasma mass spectrometry,SP-ICP-MS）[9]。文獻已報道的銀含量測定方法主要有滴定法、分光光度法[10-11]、原子吸收光譜法[12]、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法[13]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[14]等。滴定法實際操作過程中的影響因素較多，測試結(jié)果不穩(wěn)定，分光光度法不易找到合適的銀相關(guān)絡(luò)合物，因此受到了一定的限制；原子吸收法、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法和電感耦合等離子體質(zhì)譜法，試驗過程干擾少，準確度和精密度都較好[15]，但電感耦合等離子體設(shè)備價格昂貴，維護成本比較高，其使用也受到一定限制。鑒于此，本研究首先利用SEM及EDS分析、SP-ICP-MS分析，對殼聚糖抗菌凝膠中的銀進行了表征，接著建立一種簡便、快速、準確的微波消解-火焰原子吸收分光光度法，測定殼聚糖抗菌凝膠中的銀含量。該研究對抗菌凝膠中非法添加的銀進行表征及含量測定，可為抗菌凝膠類產(chǎn)品監(jiān)管及標準的制修訂提供參考和借鑒。

通過上述方法分析得出，3階模態(tài)的振型圖是獨立的，表5顯示與其他模態(tài)置信度相比很低，所以其為真實模態(tài)。1階模態(tài)與2階模態(tài)的頻率接近，二者振型圖為對稱2點間的上下振動。4階與5階模態(tài)的頻率接近，振型圖均為邊緣彎曲振動。6階模態(tài)與7階模態(tài)的頻率接近，振型圖為內(nèi)部的扭轉(zhuǎn)振動。對比MAC值，發(fā)現(xiàn)第1階模態(tài)與第2階模態(tài)的置信度很高，確認二者為重根模態(tài)。分析4階與5階模態(tài)為密集模態(tài)或重根模態(tài)，進行二級驗證。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：掃描電子顯微鏡（捷克Quanta 250FEG）；能譜儀（英國牛津Oxford,INCA x-act 250）；電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（PerkinElmer,NexION 350X），配有納米應用模塊（nano application module）；原子吸收分光光度計（美國Thermo Electron,SOLAAR MK II M6）；銀空心陰極燈（Thermo Scientific）；Milli-Q超純水器（美國Millipore）；微波消解系統(tǒng)（美國CEM,MARS5）。

試劑：銀離子標準溶液（國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院，1 000 μg/mL，批號：168004-1）；Au納米顆粒標準溶液（PerkinElmer,30 nm,9.92×106particles/mL）；硝酸（色譜級，MERK）；殼聚糖抗菌凝膠（婦用）樣品由某企業(yè)生產(chǎn)。

1.2 掃描電子顯微鏡及能譜儀表征

取少量殼聚糖抗菌凝膠涂布于導電膠上，然后置于80 ℃條件下真空干燥5 h后，將干燥樣品以掃描電鏡（加速電壓25 kV、6萬倍）和能譜儀進行表征。

1.3 SP-ICP-MS儀器條件

2.2.2 檢出限與定量限

1.4 樣品預處理及微波消解程序

精密稱取樣品約0.3 g，小心地置于消解管中，加入硝酸8 mL，依法消解完全后，用1%硝酸溶液分次涮洗并小心轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，最后以1%硝酸溶液定容至刻度；同法制備空白溶液（不加樣品，相同方法處理后所得溶液）。

波長取328.1 nm，光譜通帶寬度為0.5 nm，燈電流為4 mA（75%），背景校正采用D2，測量時間為4.0 s，重復測量次數(shù)3次，火焰類型為Air-C2H2，燃氣流量為1.1 L/min，霧化器提升4 s，燃燒器高度為7.0 mm。

所得溶液用于火焰原子吸收分光光度法測定銀含量。

微波消解程序各參數(shù)如表1所示。

表1 微波消解程序各參數(shù)Tab.1 Parameters of digestion procedure of microwave

1.5 銀含量測定標準溶液配置

精確量取1 000 μg/mL銀離子標準溶液1.0～100 mL容量瓶，加1%硝酸定容至刻度，搖勻，濃度為10 μg/mL；再分別依次量取125 μL、250 μL、500 μL、1 000 μL、1 250 μL 濃度為10 μg/mL的銀標準溶液至50 mL容量瓶，加1%硝酸定容至刻度，搖勻，即得系列濃度為25 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、250 μg/L的銀標準溶液。

1.6 原子吸收分光光度計儀器條件

本文對西江流域廣東段傳統(tǒng)村落的空間分布特征及影響因素進行了分析，受限于評估標準的約束，沒有完全對所有傳統(tǒng)村落的屬性情況進行詳細分析。此外，研究區(qū)域也僅針對西江流域廣東段，對全西江流域傳統(tǒng)村落及其數(shù)字化保護和現(xiàn)代化轉(zhuǎn)型的探討將是下一步研究的方向。

2 結(jié)果與討論

2.1 銀的表征

二〇一四年，當時的九臺市政府正式下達命令，治理飲馬河亂采亂挖現(xiàn)象，關(guān)停沿岸所有沙場。我兒時的大河啊，它終于可以有尊嚴地活著。那一夜，我激動不已，暢想著飲馬河無數(shù)美好的未來。我一直夢想，將勝利橋到春陽橋之間，十公里流域劃為柳條邊原生態(tài)文化保護區(qū)，恢復柳條邊濕地景觀，建立柳條邊文化博物館，修建環(huán)型旅游地景公路，邀請詩人、攝影家采風，邀請畫家寫生，舉辦國際馬拉松賽事……那將是真正的大河之舞！

2.2.1 標準曲線及線性范圍

“小弟,說話別帶刺兒!”孫曼玲教誨弟弟,轉(zhuǎn)臉又對徐進步說,“‘地包’是我們哈爾濱市的一個區(qū),我家住那區(qū)?！?/p>

利用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察分析殼聚糖抗菌凝膠，采用能譜儀（EDS）分析顆粒成分，并將實驗結(jié)果與SP-ICP-MS實驗結(jié)果進行對比驗證。

基于此，為了提升小學數(shù)學課堂教學中德育滲透之實效性，教師要在緊緊圍繞課堂教學內(nèi)容的前提下，緊密結(jié)合學生的實際認知水平，以設(shè)計各種各樣的作業(yè)為契機，恰如其分地打通德育滲透的延伸點。

SEM觀察分析殼聚糖抗菌凝膠，可以觀察到形態(tài)呈不規(guī)則圓形顆粒，并有少量顆粒聚集在一起，顆粒的尺寸為150～200 nm（見圖1），EDS分析結(jié)果表明其為銀（見圖2）。

2.1.2 單顆粒-電感耦合等離子體質(zhì)譜法表征

2.1.1 掃描電子顯微鏡及能譜儀分析

將殼聚糖抗菌凝膠按照1∶1 000（質(zhì)量濃度）超聲10 min以分散于超純水中后（濃度約為200 ng/L），采用1.3節(jié)的儀器條件進行分析，并以金納米顆粒標準溶液進行校驗，結(jié)果顯示，采用單顆粒-電感耦合等離子體質(zhì)譜法（SP-ICPMS）測得殼聚糖抗菌凝膠中銀顆粒的中值粒徑為168.7 nm，平均粒徑為205.0 nm（見圖3和表2），與SEM分析結(jié)果一致。

（2）企業(yè)級預案管理。收錄采集各級企業(yè)部門的綜合應急預案、專項應急預案、現(xiàn)場處置方案，對收集的預案進行動態(tài)管理。

表2 SP-ICP-MS法測定殼聚糖抗菌凝膠中銀的粒徑分布Tab.2 Size distribution of silver in chitosan antibacterial gel using SP-ICP-MS

2.2 銀含量測定

引即是引導，領(lǐng)則為領(lǐng)路。兩者看似是一個意思，實則不同，引導是一種開放式的引誘，作為被引導者，其日后的發(fā)展充滿了可能性；而領(lǐng)路一方面起到了引導的作用，但另一方面，卻代表著一種面向狹隘的指引，被領(lǐng)導者日后的狀態(tài)可能會十分糟糕。這個問題不僅今天值得大家研究，古人也已經(jīng)開始思考這個問題了，在我們經(jīng)典巨著《紅樓夢》中，曹雪芹已經(jīng)用黛玉的一個教學案例給我們作了一個很好的示范。

根據(jù)國際純粹與應用化學聯(lián)合會（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）規(guī)則，以1%硝酸空白溶液連續(xù)測定11次，計算標準偏差S=0.000 137 51，按3倍標準偏差除以標準曲線的斜率，得到本試驗方法的檢出限為1.25 μg/L。按10倍標準偏差除以標準曲線的斜率，得本試驗方法的定量限為4.17 μg/L。

調(diào)節(jié)儀器至最佳狀態(tài)，按1.6節(jié)儀器條件依次從低濃度到高濃度測定系列銀標準溶液的吸光度值，扣除試劑空白（1%硝酸溶液）的吸光度值，繪制標準曲線回歸方程。標準曲線的線性方程為y=0.000 35x+0.001 7，相關(guān)系數(shù)r為0.999 9。結(jié)果表明該實驗在25～250 μg/L濃度范圍內(nèi)，銀標準溶液濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系（見圖4）。

首先對ICP-MS儀器進行等離子體點火，預熱穩(wěn)定30 min后采用調(diào)諧液對儀器進行調(diào)諧，使ICP-MS靈敏度達到最佳狀態(tài)。在單顆粒測定模式下進行ICP-MS 測試，儀器工作參數(shù)：同位素監(jiān)測106.905Ag，RF功率為1 600 W，模擬壓為-1 637 V，霧化氣流速為1.02 L/min，輔助氣流速為1.20 L/min，等離子體氣流速為16 L/min，樣品流速為0.347 mL/min。每次測試駐留時間為50 μs，采集時間為120 s。

本文所探討的基于OBE的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)課程設(shè)計，以“學生為主體”，采用項目引入，知識講授、分組學習，項目實現(xiàn)、課堂考核等多樣化的教學策略，以項目為主線，將課堂教學、實驗、項目、考試和課后持續(xù)學習等各個教學環(huán)節(jié)高度融合起來，而且變驗證性實驗為實踐性實驗，激發(fā)了學生的興趣，強調(diào)學生自主學習，培養(yǎng)了學生綜合能力，全面提高了教學質(zhì)量。

2.2.3 精密度試驗

以50 μg/L的銀標準溶液，按1.6節(jié)儀器條件連續(xù)測定6次，記錄吸光度值，計算其吸光度值的RSD為2.96%，表明銀含量測定研究的儀器精密度良好。

2.2.4 加標回收率試驗

取某批次殼聚糖抗菌凝膠（經(jīng)篩查，含有銀成分）樣品9份，取樣量約為0.3 g，置微波消解管中，分別精密加入已知濃度的標準銀溶液作為加標回收樣品（加入量分別為140.2 μg、175.2 μg、210.2 μg），依1.4節(jié)方法消解，依1.6節(jié)儀器條件測定，平均回收率（n=9）為98.5%，RSD為1.25%，表明本方法回收率情況良好（結(jié)果見表3）。

表3 回收率試驗結(jié)果（n=9）Tab.3 The recovery rate test results（n=9）

2.2.5 樣品測定

按1.4節(jié)方法制備樣品溶液，同法制備空白溶液。按1.6節(jié)儀器條件測定某企業(yè)10批次殼聚糖抗菌凝膠中銀含量，結(jié)果顯示銀的含量范圍在155～505 μg/g，如表4所示。

表4 10批次樣品中銀含量Tab.4 Silver content of the sample

3 結(jié)論

本研究中的產(chǎn)品名稱為殼聚糖抗菌凝膠，未注明含銀，利用SEM、EDS和SP-ICP-MS不同的表征分析方法，可表明該殼聚糖抗菌凝膠中含有尺寸約為150～200 nm的銀顆粒（接近納米銀級別）。

抗菌凝膠需制備成溶液狀態(tài)才能進行銀含量的測定，微波消解法可快速、批量地將樣品消解為溶液狀態(tài)，極大地提高了工作效率。本實驗采用密閉微波消解法處理殼聚糖抗菌凝膠樣品，不但簡便、快速，而且密閉的消解罐避免了消解過程中樣品之間的相互污染和外部環(huán)境對樣品的污染，可保證測量結(jié)果的準確性。

含銀抗菌凝膠是近年來上市的一類新型抗菌產(chǎn)品，但目前國家標準尚未規(guī)范含銀抗菌凝膠中銀含量的檢測方法，因此，亟須制定相關(guān)標準規(guī)范和控制此類產(chǎn)品的質(zhì)量。本研究建立的微波消解-火焰原子吸收光譜法，簡單、快速且在線性范圍內(nèi)，實驗的精密度較好、回收率較高，表明本方法準確、可靠，可用于含銀的殼聚糖抗菌凝膠類醫(yī)療器械產(chǎn)品中銀含量的測定，可為其他含銀抗菌凝膠類產(chǎn)品中銀含量的測定提供參考。

納米生物材料類醫(yī)療器械（如納米金屬銀材料制成的醫(yī)療器械）為第三類醫(yī)療器械，本研究為抗菌凝膠類產(chǎn)品的監(jiān)管提供了參考依據(jù)，為抗菌凝膠類產(chǎn)品行業(yè)標準的制修訂提供了研究基礎(chǔ)。